明胶酶谱法检测步骤

明胶酶谱法检测步骤

1、明胶酶谱溶液配制

1.1.1洗脱液（1×）：

1.1.2Triton X-100，

2.5%（v/v）in water

配法：量取Triton X-10025ml，加去离子水定容至1000ml即可。

1.1.2孵育液（1×）：50mM Tris-HCl，5mM CaCl2·2H2O，0.02%Brij-35，0.2M NaCl，pH7.6。

配法：

1)称取Tris碱6.06g，CaCl2·2H2O0.74g（或CaCl20.555g），Brij-350.2g，NaCl11.7g；

2)加水至800ml；

3)用浓HCl调pH至7.6；

4)定容至1000ml。

1.1.32×上样缓冲液（不含β巯基乙醇）

0.5M Tris-HCl，pH6.8 2.5ml

甘油 2.0ml

10%（w/v）SDS 4.0ml

0.1%溴酚蓝0.5ml

dH2O1ml

Total10ml

1.1.45×上样缓冲液（不含β巯基乙醇）

配法：

1)量取下列试剂，置于15ml塑料离心管中

a)1M Tris-HCl（pH6.8） 2.5ml

b)SDS1g

c)溴酚蓝0.05g

d)甘油5ml

2)加dH2O定容至10ml，Vortax振荡混匀；

3)小份分装（1ml/管），-20℃保存。

1.1.50.5%（w/v）考马斯亮蓝R-250400ml

配法：

1)称取2g考马斯亮蓝R-250，置于1L烧杯中；

2)量取100ml异丙醇加入上述烧杯中，搅拌溶解；

3)加入40ml冰醋酸，搅拌均匀；

4)加入260ml去离子水，搅拌溶解；

5)用滤纸过滤除去颗粒物质后，室温保存。

1.1.6考马斯亮蓝脱色液（400ml）

配法甲醇：乙酸：水=200：40：160=5：1：4。

1.1.7明胶储液（10mg/ml in water）

配法：称取明胶（Sigma，猪皮来源）0.1g，加去离子水10ml，溶解。配好后储存于4℃。若凝固成胶冻状可用55℃水浴解冻。

1.1.810%SDS-PAGE凝胶之分离胶（含1.0mg/ml明胶）

配法：

dH2O3ml

30%丙烯酰胺溶液 3.3ml

1.5M Tris-HCl（pH8.8）

2.5ml

10%SDS0.1ml

10%过硫酸铵0.1ml

TEMED0.004ml

10mg/ml明胶1ml

Total10ml

1.1.9浓缩胶的配置（与Western Blot完全相同)

2、实验具体步骤

2.1.取对数期的癌细胞在的无血清培养基DMEM中培养24h。

2.2.次日收集上清液，将上清液移入离心管中2000rpm离心10min，-70℃储存备用。

2.3.根据细胞计数调整各组细胞培养上清液中的蛋白浓度（或者测定蛋白浓度调整使所上蛋白总量一致）。与5×上样缓冲液混合，13ul样本+4ul上样缓冲液。（不要用枪用力吹打，防止出现过多气泡）

2.4.配制分离胶和浓缩胶，16ul/孔上样（根据表达强度和蛋白浓度确定上样量），4℃进行SDS-PAGE电泳100v约1.5小时（电泳时在周围敷上冰，有利于使条带跑直）。

2.5.电泳结束后,将凝胶置于洗脱液(2.5%Triton X-100，50mmol/L Tris-HCl，5mmol/L CaCl2，pH7.6)中振荡洗脱2次,每次40分钟,然后用漂洗液(除不含Triton X-100外其余同洗脱液)漂洗2次,每次20分钟,接着,将凝胶置于孵育液(50mmol/L Tris-HCl,5mmol/CaCl2,0.02% Brij-35,pH7.6)中37℃孵育42h。

2.6.孵育结束后经染色液(0.05%Coomassic亮蓝、30%甲醇、10%乙酸)染色3h,及脱色液A、

B、C(甲醇浓度分别为30%、20%、10%,乙酸浓度分别为10%、10%、5%)分别脱色0.5、

1、2h后，显示出MMP-2（72KD）和MMP-9（92KD）为位于蓝色背景上的透亮带，用凝胶图像分析系统分析读取条带面积，宽度和灰度值，做统计分析。