实验二SDSPAGE凝胶电泳

（1０）脱色液： 冰乙酸75ml，甲醇50ml，加蒸馏水定容至 1000ml
（1１）电极缓冲液 （内含0.1%SDS，0.05mol/LTris0.384mol/L甘氨酸缓冲液pH8.3）：称Tris6.0g， 甘氨酸28.8g，加入SDS1g，加蒸馏水使其溶解 后定容至1000ml
（12）高分子量标准蛋白试剂盒:

分类
PAGE根据其有无浓缩效应，分为连续 系统和不连续系统两大类.
连续系统电泳体系中,缓冲液pH值及凝胶 浓度相同，带电颗粒在电场作用下，主要靠 电荷和分子筛效应。
电泳槽
不连续系统

不连续系统中由于缓冲液离子成分，pH， 凝胶浓度及电位梯度的不连续性，带电颗 粒在电场中泳动不仅有电荷效应，分子筛 效应，还具有浓缩效应，因而其分离条带 清晰度及分辨率均较前者佳。
上样缓冲液 之四
增加样品密度以保证蛋白质沉入加样孔内， 一般上样缓冲液中加入一定浓度的甘油或蔗 糖，这样可以增加样品的比重。 上样缓冲液中的甘油非常重要，起增加粘 度的作用，这可以阻止样品从梳样孔中扩散 出来到电泳缓冲液中。 指示剂检测电泳的行进过程，一般加入泳 动速率较快的溴酚蓝指示电泳的前沿 。
兔磷酸化酶B MW=97,400 牛血清白蛋白 MW=66,200 兔肌动蛋白 MW=43,000 牛碳酸酐酶 MW=31,000 胰蛋白酶抑制剂 MW=20,100 鸡蛋清溶菌酶 MW=14,400 置-20℃保存，使用前室温融化，沸水浴中加热35分钟后上样。
（13）样品：兔血清
２. 聚胶前准备

2）制备SDS聚丙烯酰胺凝胶
①制备分离胶 30%丙烯酰胺5ml + 分离胶缓冲液
5ml +10%SDS 0.2ml +10%过硫酸铵 0.2ml + 蒸
馏水 9.6 ml；混匀后加入8ul TEMED,立即混匀
（不能有气泡），灌入安装好的垂直板中，灌胶
时要匀速贴壁流入，防止气泡产生。灌至离槽沿 3cm处，立即在胶面上用移液管加入1-2cm的蒸馏
实 验 二
SDS-PAGE凝胶电泳
SDS-PAGE凝胶电泳
实验原理 实验步骤 注意事项 SDS-PAGE的优点 SDS-PAGE的缺点 实验常见问题及处理 小技巧
实验原理
源起 基本原理 分类 分离范围


1967年由Shapiro建立。 1969年由Weber和Osborn进一步完善。
上样缓冲液 之二
注意事项
还原型上样缓冲液中含一定量的DTT（二硫 苏糖醇）或巯基乙醇，有轻微刺激性气味，较 易区分； 含巯基的试剂有一定的毒性，为了安全和健 康，应穿实验服并戴一次性手套操作。
上样缓冲液 之三
使用说明
1.按每4 μl蛋白样品加入1μl蛋白上样缓冲液的比 例，混合蛋白样品和蛋白上样缓冲液(5X)。 2. 100℃或沸水浴加热3～5min，以充分变性蛋白。 3. 冷却到室温后取上清直接上样到SDS-PAGE胶 加样孔内即可。 4. 通常电泳时染料到达胶的底端附近（0.5 ～ 1cm)即可停止电泳。
上样缓冲液之一
上样缓冲液(SDS-PAGE loading buffer)是一种以 溴酚蓝为染料，5倍浓缩的SDS-PAGE凝胶电泳上样 缓冲液，用于常规的SDS-PAGE蛋白电泳样品上样。
本产品分为还原型和非还原型两种，还原型上样 缓冲液中的巯基可使蛋白分子的链内二硫键和链间二 硫键断裂，使通过二硫键连接的各亚单位彼此分离， 在电泳凝胶上显现多个蛋白条带，选购和使用时请务 必注明，仔细区分。
他们发现样品介质和丙烯酰胺凝 胶中加入离子去污剂（SDS）以后,蛋 白质亚基的电泳迁移率主要取决于亚 基分子量的大小,电荷因素可以忽视.
源起
四甲基乙二胺(TEMED) 丙烯酰胺
共聚合
激活作用
聚丙烯酰胺
N,N’-亚甲基双丙烯酰胺 过硫酸胺(AP)
பைடு நூலகம்激活作用
基本原理之一
阴离子去污剂SDS破坏蛋白质分子之间及
水，静置，待凝胶聚合后（约30min），去除水
相，然后用吸水纸吸干残余的水。

②制备浓缩胶 30%丙烯酰胺 1.32ml + 浓缩胶缓冲液 1ml +10%SDS 0.08ml +10% AP 0.08ml + 蒸馏水 5.6 ml；混匀后加入8ul TEMED,立即混匀（不能有气 泡），灌入垂直板至离槽沿0.5cm处，插入梳子 （不能混入气泡），静置，待凝胶聚合后，加入 电泳缓冲液，拔去梳子。
浓缩胶

浓缩胶的作用是有堆积作用，凝胶浓度较小， 孔径较大，把较稀的样品加在浓缩胶上，经过 大孔径凝胶的迁移作用而被浓缩至一个狭窄的 区带。
分离胶
孔径较小,通过选择合适的凝胶浓度,可以
使样品很好的分离.
浓缩效应之一
凝胶由两种不同的凝胶层组成。上层为浓缩胶，下层为分 离胶。在上下电泳槽内充以Tris-甘氨酸缓冲液(pH8.3)， 这样便形成了凝胶孔径和缓冲液pH值的不连续性。在浓 缩胶中 HCl几乎全部解离为Cl-，但只有极少部分甘氨酸 解离为H2NCH2COO-。蛋白质的等电点一般在pH5左右， 在此条件下其解离度在HCl和甘氨酸之间。当电泳系统通 电后，这3种离子同向阳极移动。其有效泳动率依次为Cl＞蛋白质＞H2NCH2COO-，故C1-称为快离子，而 H2NCH2COO- 称为慢离子。
浓缩效应之二
电泳开始后，快离子在前，在它后面形成离子浓度 低的区域即低电导区。电导与电压梯度成反比，所 以低电导区有较高的电压梯度。这种高电压梯度使 蛋白质和慢离子在快离子后面加速移动。在快离子 和慢离子之间形成一个稳定而不断向阳极移动的界 面。由于蛋白质的有效移动率恰好介于快慢离子之 间，因此蛋白质离子就集聚在快慢离子之间被浓缩 成一条狭窄带。这种浓缩效应可使蛋白质浓缩数百 倍。
电荷效应之一
样品进入分离胶后，慢离子甘氨酸全部解 离为负离子，泳动速率加快，很快超过蛋白质， 高电压梯度随即消失。此时蛋白质在均一的外 加电场下泳动，但由于蛋白质分子所带的有效 电荷不同，使得各种蛋白质的泳动速率不同而 形成一条条区带。
电荷效应之二
与SDS结合的蛋白质的构型也发生变化，在水 溶液中SDS-蛋白质复合物都具有相似的形状，使 得SDS-PAGE电泳的泳动率不再受蛋白质原有电 荷与形状的影响。因此，各种SDS-蛋白质复合物 在电泳中不同的泳动率只反映了蛋白质分子量的 不同。
考马斯亮蓝
变为青色，蛋白质-色素结合物在595nm波长下有最大光 吸收。其光吸收值与蛋白质含量成正比，因此可用于蛋白 质的定量测定。蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合在2min左 右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速；其结合物在室 温下1h内保持稳定。该法是1976年Bradford建立，试剂配 制简单，操作简便快捷，反应非常灵敏，可测定微克级蛋 白质含量，测定蛋白质浓度范围为0～1000μg／mL，是一 种常用的微量蛋白质快速测定方法。 考马斯亮蓝最大光吸收在488nm；当它与蛋白质结合后
电荷效应之三
在SDS-PAGE电泳中，由于SDS这种阴离子 表面活性剂以一定比例和蛋白质结合成复合物， 使蛋白质分子带负电荷，这种负电荷远远超过 了蛋白质分子原有的电荷差别，从而降低或消 除了蛋白质天然电荷的差别；此外，由多亚基 组成的蛋白质和SDS结合后都解离成亚单位， 这是因为SDS破坏了蛋白质氢键、疏水键等非 共价键。
冰醋酸：纯醋酸在温度稍变低时即形成冰晶，所以又
称为冰醋酸。常用0.3～0.5的浓度作为固定液。冰醋 酸对材料有膨胀作用，对核蛋白固定好，可与水、酒精、 氯仿混合。
染色剂
考马斯亮蓝染色 常用染色方法 银染法 金属离子染色法
以考马斯亮蓝染色为例
考马斯亮蓝
考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度，是利用 蛋白质―染料结合的原理，定量的测定微量 蛋白浓度的快速、灵敏的方法。
（4）1.0mol/LTris-HCl缓冲液(pH6.8): 称取Tris12.1g,加入50ml水，用1mol/L 盐酸调pH6.8,最后用蒸馏水定容至100ml （5）0.05mol/LTris-HCl缓冲液(pH8.0)： 称取Tris0.6g,加入50ml水，用1mol/L盐酸 调pH8.0,最后用蒸馏水定容至100ml （６）TEMED（四甲基乙二胺）
实验步骤
１．试剂配制
(1) 30%丙烯酰胺（Acr）：称Acr30g，甲叉双 丙烯酰胺（Bis）0.8g，加蒸馏水至100ml，过滤 后置棕色瓶中。 4℃，1～2月 （2）10%SDS（十二烷基磺酸钠） （3）1.5mol/L Tris-HCl缓冲液(pH8.9)： 称取Tris 18.2g, 加入50ml水,用1mol/L盐酸调 pH8.8,最后用蒸馏水定容至100ml。

凝胶的筛分特性取决于它的孔径，而孔径又是灌 胶时所用丙烯酰胺和双丙烯酰胺绝对浓度的函数。 用5～15%的丙烯酰胺所灌制凝胶的线性分离范围 如下表：
双丙烯酰胺～丙烯酰胺摩尔比为 1：29。
丙烯酰胺浓度（%） 15 线性分离范围（kD） 12～43
10
7.5 5.0
16～68
36～94 57～212
与其它物质分子之间的非共价键，使蛋白质变 性而改变其原有的构象，并同蛋白质分子充分 结合形成带负电荷的蛋白质-SDS复合物。
强还原剂巯基乙醇打开蛋白质分子内的
二硫键使这种结合更加充分。
基本原理之二

结合了SDS的蛋白质在水溶液中的形状类似于长 椭圆棒，不同的蛋白质-SDS复合物其椭圆棒的短 轴长度恒定，而长轴的长度则与蛋白质分子量的 大小成正比。 这样的蛋白质-SDS复合物在电场作用下，其迁移 率便不再受蛋白质原有的净电荷及形状等因素的 影响，而主要取决于其分子量大小这一因素。根 据这一特点，就可以将各蛋白组分按分子量大小 分开。
甲醇/冰醋酸固定液
单纯的固定液一般难以达到这些要求，因此在实验 中使用两种混和的固定液。Carnoy固定液（甲醇:冰 乙酸=3:l）每次使用前需临时配制，长时间放置影响 固定效果，固定时间15min至24 h，冰箱、室温均可。
甲醇/冰醋酸固定液
甲醇：有固定、硬化和脱水的作用。可以固定白蛋白、
球蛋白、核蛋白，但对核蛋白固定效果较差(亲和力小 且易自溶)。甲醇固定的特点是杀死快，渗透力强，对 组织收缩较大(可收缩20左右)，可使材料变硬。

③先用刀片将琼脂糖剥离开，再将玻璃板从架子 上取出，再用夹子固定在电泳槽内（注意凹槽朝 内），将电泳缓冲液倒入电泳槽内。 3).样品预处理 取0.5ml样品加入0.5ml上样缓冲液，置沸水 中煮5分钟。
4).上样 ①第一个孔内加20ul标准蛋白质溶液 ②其他每孔加入20ul样品。上样时要将移液枪头 垂直插入孔内且要缓慢匀速推入样品。
分离范围

SDS 聚丙烯酰胺凝胶的有效分离范围取决于用于灌胶的聚 丙烯酰胺的浓度和交联度。在没有交联剂的情况下聚合的 丙烯酰胺形成毫无价值的粘稠溶液，而经双丙烯酰胺交联 后凝胶的刚性和抗张强度都有所增加，并形成SDS-蛋白质 复合物必须通过的小孔。这些小孔的孔径随 “双丙烯酰 胺～丙烯酰胺” 比率的增加而变小，比率接近 1：20 时孔 径达到最小值。 SDS 聚丙烯酰胺凝胶大多按“双丙烯酰 胺～丙烯酰胺”为1：29 配制，试验表明它能分离大小相 差只有3% 的蛋白质。
（７）样品溶解液： SDS（100mg）+巯基乙醇（0.1ml）+ 溴酚蓝 （2mg）+甘油（2g）+ 0.05mol/L pH8.0Tris-HCl （2ml），最后定容至10ml （８）固定液：50%甲醇454ml，冰乙酸46ml混匀 （９）染色液：称取考马斯亮蓝R250 0.125g，加 上述固定液250ml，过滤后备用
(1) 配制10％过硫酸铵溶液(需每天新鲜配 制)。 (2) 将单体储存液、缓冲液、水按照一定比 例配制成凝胶溶液。 (3) 将灌胶装置准备好。 (4) 待凝胶溶液平衡至室温(23~25℃)后，真 空脱气15 min。


1）.安装膜具
①将玻璃板用蒸馏水洗净晾干, 将凡士林 均匀的涂在两侧的封条上，用封条将玻璃 板封好。 ②称取2g琼脂糖加100ml蒸馏水，慢慢的煮 开（煮的过程中要不断搅拌），将煮好的 (无气泡)琼脂糖倒入支胶架三分之二高度， 快速将两侧封好的玻璃板插入琼脂糖中， 注意凹槽朝外，用夹子固定好，待凝固后 灌胶。