基因组编辑技术 ppt课件
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17
CRISPR-Cas主要由两部分组成：
CRISPR/Cas的结构 CRISPR 是一个特殊的DNA重复序列家族, 广泛分布于细菌和古细菌 基因组中。CRISPR 位点通常由短的高度保守的重复序列(repeats) 组 成, 重复序列的长度通常 21~48 bp, 重复序列之间被 26~72 bp 间 隔序列(spacer)隔开。CRISPR就是通过这些间隔序列（space）与靶 基因进行识别。
域，其中HNH切割与crRNA互补的链，切割位点位于PAM序列上游3 bp， RuvC-like切割非互补链，切割位点位于PAM序列上游3~8 bp，从而造成 双链的断裂。
25
CRISPR/ Cas9产生的DSB能够激活细胞和生物体自身修复 机制，产生两种不同的修复途径NHEJ和HDR修复。NHEJ能 够高效地引入不同长度的插入或者缺失突变，导致转录阅读 框编码序列，转录激活相关的启动子和增强子的损坏；而 HDR的修复通常会引入特定位点的突变或者在外源供体DNA 模板存在时对靶位点进行可预测的插入。
18
Cas（CRISPR associated）： 存在于CRISPR位点附近，是一种双链
DNA核酸酶，能在guide RNA引导下对靶位 点进行切割。它与folk酶功能类似，但是它并 不需要形成二聚体才能发挥作用。
19
CRISPR/Cas9系统的工作原理和机制
CRISPR/Cas9系统由间隔重复CRISPR基因座转录出来 的pre-crRNA、多功能的Cas9核酸酶和tracrRNA组成， 其中tracrRNA促进pre-crRNA的成熟，以及形成具有切 割活性的crRNA-tracrRNA-Cas9三元复合体。
2009 年，研究者在植物病原体黄单胞菌(Xanthomonas)中 发现一种转录激活样效应因子(TAL蛋白),它的核酸结合域的氨 基酸序列与其靶位点的核酸序列有恒定的对应关系,一个模块单 元识别一个碱基，简单且特异性极好。随后，TALE特异识别 DNA 序列的特性被用来取代 ZFN技术中的锌指蛋白。它可设 计性更强，不受上下游序列影响，具备比ZFN 更广阔的应用潜 力。
26
27
CRISPR/Cas9系统的关键点
1. PAM序列区是CRISPR/Cas9系统行使切割功能的基本条件。 如果靶序列3′端没有PAM序列，即使靶序列与sgRNA序列完全匹 配，Cas9蛋白也不会切割该序列位点.
2. sgRNA与目标基因组相结合的20nt序列区决定着CRISPR/Cas 系统的靶向特异性。
2013年，研究者报道了CRISPR/Cas9系统可高效地 编辑基因组。其中分别在人类细胞和小鼠细胞中成功对 部分基因实现了编辑。
16
CRISPR/Cas系统概述
CRISPR/ Cas系统广泛存在于细菌和古菌中，是它们 的一种适应性免疫系统，能够识别自身和外源入侵DNA 片段。CRISPR/ Cas系统有3种类型：Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型。
复序列) 第四代：NgAgo - gDNA 韩春雨
7
ZFN 基因组编辑技术
ZFN 技术是第一代基因组编辑技术，其功能的实现是基于 具有独特的DNA序列识别的锌指蛋白发展起来的。
1986年Diakun 等首先在真核生物转录因子家族的 DNA 结 合区域发现了Cys2- His2锌指模块。
1996年，Kim等首次人工连接了锌指蛋白与核酸内切酶。 2005年，Urnov等发现一对由4个锌指连接而成的ZFN可识 别24 bp的特异性序列，由此揭开了ZFN在基因组编辑中的应 用。
病毒或质粒入侵细菌后，其基因组DNA暴露于细菌胞 浆之中，经过同源重组，CRISPR重复序列转录、翻译出 的Cas复合物对外来DNA进行剪切，产生新的spacer序列。 如果产生的新spacer序列能够与CRISPR array内部的短重 复序列部分互补，将会通过某种未知的方式整合到细菌基 因组的CRISPR array 序列中，从而对该病毒或质粒产生 特异性免疫记忆。
基因组编辑
应用基因编辑技术不长角的奶1牛
基因编辑的定义： 通过精确识别靶细胞DNA片段中靶点的核苷酸序列，利用 核酸内切酶对DNA靶点序列进行切割，从而完成对靶细胞 DNA目的基因片段的精确编辑。
2
精品资料
• 你怎么称呼老师？ • 如果老师最后没有总结一节课的重点的难点，你
是否会认为老师的教学方法需要改进？ • 你所经历的课堂，是讲座式还是讨论式？ • 教师的教鞭 • “不怕太阳晒，也不怕那风雨狂，只怕先生骂我
29
CRISPR/Cas9系统在基因组DNA片段编辑中的应用
1. DNA片段靶向删除 2. DNA片段靶向反转 3. DNA片段靶向重复 4. DNA片段靶向插入 5. 染色体靶向易位
30
编辑技术对比
类别 构成
技术难度 商业价格 脱靶效应
ZFN
ZF Array∷Fok1
第三，每一个成熟的sgRNA能够引导Cas9蛋白定位到双 链DNA的靶位点上并在原型间隔毗邻序列(Proto-spacer adjacent motif, PAM)的上游3~8 bp位置对结合的序列进 行切割(图2A)。
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Cas9的特异性靶点和两个核酸酶结构域
Cas9的特异性靶点 依赖于原型间隔序列3′端PAM序列，不同的Cas9突变体在基因组中拥
12
TALENs 包含两个 TALEN 蛋白, 每个 TALEN 都是由 TALE array 与 FokⅠ融合而成. 其中一个 TALEN 靶向正义链上靶 标位点, 另一个则靶向反义链上的靶标位点. 然后 FokⅠ形成 二聚体, 在靶向序列中间的 spacer 处切割 DNA, 造成双链 DNA 断裂, 随后细胞启动 DNA 损伤修复机制. 针对不同的 TALEN 骨架, 其最适宜的spacer长度不同, 其长度范围一般为 12~20 bp.
10
ZFN 诱导的基因组编辑技术可应用于很多物种及基 因位点，具有较好的发展潜力。
缺点: (1)以现有的策略设计高亲和性的 ZFN，需要投
入大量的工作和时间;(2)在细胞中持续表达 ZFN 对 细胞有毒性;(3)虽然三联体设计具有一定特异性，但 仍然存在不同程度的脱靶效应。
11
TALEN 基因组编辑技术
20
21
CRISPR/Cas9系统的工作原理和机制
当同类的病毒或者质粒再次入侵该细菌时
首先，tracrRNA与pre-crRNA的重复序列结合；
第二，内源RNase Ⅲ切割pre-crRNA/ tracrRNAs复合
体，切除5′末端的间隔序列，形成成熟的crRNA，并与 tracrRNA形成被称为向导RNA (Single guide RNA, sgRNA)的嵌合RNA分子；
15
2011年，才揭示了CRISPR/Cas系统的分子机制： 当病毒首次入侵时，细菌会将外源基因的一段序列整合 到自身的CRISPR的间隔区；病毒二次入侵时，CRISPR 转录生成crRNA前体(pre-crRNA)，pre-crRNA经过加 工形成含有与外源基因匹配序列的 crRNA，该crRNA与 病毒基因组的同源序列识别后，介导Cas蛋白结合并切 割，从而保护自身免受入侵。
Ⅰ型和Ⅲ型CRISPR/Cas系统较为复杂，需要多个Cas 蛋白形成复合体切割DNA双链，而Ⅱ型CRISPR/Cas系统 只需要一个Cas9蛋白核酸酶来切割DNA双链,即为现在广 泛应用于遗传学基因编辑的CRISPR/Cas9系统。
TypeⅡ系统中只有一种核酸酶—Cas9核酸酶，在该 系统中Cas9蛋白与crRNA参与对抗外源噬菌体和质粒的 入侵。目前，TypeⅡ系统在基因组编辑中应用的最为广 泛。
TALEN
TALEN Array∷Fok1
CRISPR /Cas9 NgAgo-gDNA
Cas9∷sgRNA
NgAgo-gDNA
笨，没有学问无颜见爹娘 ……” • “太阳当空照，花儿对我笑，小鸟说早早早……”
4
基因编辑的优势
与传统的以同源重组和胚胎干细胞(embryonic stem cell，ES)技术为基础的基因打靶技术相比， 基因编辑新技术保留了可定点修饰的特点，可应用 到更多的物种上，效率更高，构建时间更短，成本 更低。
2002年科学家才将其命名为成簇的规律间隔短回文重复 序列(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats, CRISPR) ，现有测序结果显示40%的细菌基因组中 含有CRISPR位点。
2005年，科学家们发现CRISPR中的许多间隔序列来源于 质粒和病毒，CRISPR的基因座能够被转录，并且Cas基因编 码的蛋白具有核酸酶和解旋酶结构域，因此推测CRISPR/ Cas 是利用无义的RNAs标记外源核酸序列的防御系统。
有不同的PAM序列，来源于酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)的Cas9 识别一个5′- NGG-3′的PAM，而来源于嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)和脑膜炎奈瑟氏菌(Neisseria meningi-tidis)的Cas9分别识
别5′-NNAGAAW-3′的PAM和5′-NNNNGATT-3′的PAM。 Cas9拥有两个核酸酶结构域 分别是蛋白中间的HNH结构域和蛋白氨基酸末端附近的RuvC-like结构
13
实验结果表明, TALENs在靶向DNA时, 第一个碱基为 T 时其结合效果更佳。 通过组合各类模块，可对任意核苷酸序列进行靶向特异 性敲除或内源基因的表达调控。
目前已在人、大鼠、小鼠、猪、羊、斑马鱼、拟南芥 及酵母等多类物种中得到成功应用。
14
CRISPR /Cas9 基因组编辑技术
CRISPR/Cas9系统的发现可以追溯到1987年，日本学者 首次在大肠杆菌(E. coli)基因组中发现一连串短的空间间隔重 复序列。随后，在其他细菌和古细菌中也发现了这一特殊的 序列。
5
基因编辑原理
现代基因组编辑技术的基本原理是相同的，即 借助特异性 DNA 双链断裂( DNA doublestrand breaks DSBs) 激活细胞天然的修复机 制，包括非同源末端连接( NHEJ)和同源重组 修复(HDR) 两条途径。
6
基因编辑发展史
第一代: ZFN(锌指核酸酶) 第二代: TALEN(转录激活样效应因子核酸酶) 第三代: CRISPR/Cas9(成簇的规律性间隔的短回文重
3. sgRNA的长度也与特异性密切相关。sgRNA的5′端额外增 加两个鸟嘌呤核苷酸后能够显著提高CRISPR/Cas9系统的特异 性。
28
CRISPR/Cas9系统的脱靶效应
CRISPR/Cas9基因编辑系统的特异性决定于sgRNA上 的识别(~20nt)。然而，在复杂的生物基因组中， sgRNA的识别序列可能会与非靶点DNA发生局部匹配 (Partial match)。 这种局部匹配，目前可归结为两类： (1)sgRNA与脱靶位点DNA序列长度相同，但存在碱基错 配。 (2) 脱靶位点DNA序列长度比sgRNA多或少几个碱基，通 过形成DNA凸起(DNA bulge)或RNA凸起(RNA bulge) 来完成其他碱基的正确配对。
8
ZFN原理和机制
ZFN=DNA识别域+核酸内切酶
DNA识别域： 由一系列 Cys2-His2锌指蛋白（zinc-fingers）
串联组成（一般3~4个），每个锌指蛋白识别并结合 一个特异的三联体碱基。
核酸内切酶： 非特异性核酸内切酶FokI，形成二聚体时切割双
链DNA。
9
ZFN 由锌指蛋白(ZFP)和 FokⅠ核酸内切酶组成。其中，由 ZFP 构成的 DNA 识别域能识别特异位点并与之结合，而由FokⅠ构 成的切割域能执行剪切功能，两者结合可使靶位点的双链DNA 断裂(DSB)。于是， 细胞可以通过同源重组(HR)修复机制和非同 源末端连接(NHEJ)修复机制来修复 DNA。HR 修复有可能会对 靶标位点进行恢复修饰或者插入修饰，而 NHEJ 修复极易发生插 入突变或缺失突变。两者都可造成移码突变，因此达到基因敲除 的目的。
CRISPR-Cas主要由两部分组成：
CRISPR/Cas的结构 CRISPR 是一个特殊的DNA重复序列家族, 广泛分布于细菌和古细菌 基因组中。CRISPR 位点通常由短的高度保守的重复序列(repeats) 组 成, 重复序列的长度通常 21~48 bp, 重复序列之间被 26~72 bp 间 隔序列(spacer)隔开。CRISPR就是通过这些间隔序列（space）与靶 基因进行识别。
域，其中HNH切割与crRNA互补的链，切割位点位于PAM序列上游3 bp， RuvC-like切割非互补链，切割位点位于PAM序列上游3~8 bp，从而造成 双链的断裂。
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CRISPR/ Cas9产生的DSB能够激活细胞和生物体自身修复 机制，产生两种不同的修复途径NHEJ和HDR修复。NHEJ能 够高效地引入不同长度的插入或者缺失突变，导致转录阅读 框编码序列，转录激活相关的启动子和增强子的损坏；而 HDR的修复通常会引入特定位点的突变或者在外源供体DNA 模板存在时对靶位点进行可预测的插入。
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Cas（CRISPR associated）： 存在于CRISPR位点附近，是一种双链
DNA核酸酶，能在guide RNA引导下对靶位 点进行切割。它与folk酶功能类似，但是它并 不需要形成二聚体才能发挥作用。
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CRISPR/Cas9系统的工作原理和机制
CRISPR/Cas9系统由间隔重复CRISPR基因座转录出来 的pre-crRNA、多功能的Cas9核酸酶和tracrRNA组成， 其中tracrRNA促进pre-crRNA的成熟，以及形成具有切 割活性的crRNA-tracrRNA-Cas9三元复合体。
2009 年，研究者在植物病原体黄单胞菌(Xanthomonas)中 发现一种转录激活样效应因子(TAL蛋白),它的核酸结合域的氨 基酸序列与其靶位点的核酸序列有恒定的对应关系,一个模块单 元识别一个碱基，简单且特异性极好。随后，TALE特异识别 DNA 序列的特性被用来取代 ZFN技术中的锌指蛋白。它可设 计性更强，不受上下游序列影响，具备比ZFN 更广阔的应用潜 力。
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CRISPR/Cas9系统的关键点
1. PAM序列区是CRISPR/Cas9系统行使切割功能的基本条件。 如果靶序列3′端没有PAM序列，即使靶序列与sgRNA序列完全匹 配，Cas9蛋白也不会切割该序列位点.
2. sgRNA与目标基因组相结合的20nt序列区决定着CRISPR/Cas 系统的靶向特异性。
2013年，研究者报道了CRISPR/Cas9系统可高效地 编辑基因组。其中分别在人类细胞和小鼠细胞中成功对 部分基因实现了编辑。
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CRISPR/Cas系统概述
CRISPR/ Cas系统广泛存在于细菌和古菌中，是它们 的一种适应性免疫系统，能够识别自身和外源入侵DNA 片段。CRISPR/ Cas系统有3种类型：Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型。
复序列) 第四代：NgAgo - gDNA 韩春雨
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ZFN 基因组编辑技术
ZFN 技术是第一代基因组编辑技术，其功能的实现是基于 具有独特的DNA序列识别的锌指蛋白发展起来的。
1986年Diakun 等首先在真核生物转录因子家族的 DNA 结 合区域发现了Cys2- His2锌指模块。
1996年，Kim等首次人工连接了锌指蛋白与核酸内切酶。 2005年，Urnov等发现一对由4个锌指连接而成的ZFN可识 别24 bp的特异性序列，由此揭开了ZFN在基因组编辑中的应 用。
病毒或质粒入侵细菌后，其基因组DNA暴露于细菌胞 浆之中，经过同源重组，CRISPR重复序列转录、翻译出 的Cas复合物对外来DNA进行剪切，产生新的spacer序列。 如果产生的新spacer序列能够与CRISPR array内部的短重 复序列部分互补，将会通过某种未知的方式整合到细菌基 因组的CRISPR array 序列中，从而对该病毒或质粒产生 特异性免疫记忆。
基因组编辑
应用基因编辑技术不长角的奶1牛
基因编辑的定义： 通过精确识别靶细胞DNA片段中靶点的核苷酸序列，利用 核酸内切酶对DNA靶点序列进行切割，从而完成对靶细胞 DNA目的基因片段的精确编辑。
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精品资料
• 你怎么称呼老师？ • 如果老师最后没有总结一节课的重点的难点，你
是否会认为老师的教学方法需要改进？ • 你所经历的课堂，是讲座式还是讨论式？ • 教师的教鞭 • “不怕太阳晒，也不怕那风雨狂，只怕先生骂我
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CRISPR/Cas9系统在基因组DNA片段编辑中的应用
1. DNA片段靶向删除 2. DNA片段靶向反转 3. DNA片段靶向重复 4. DNA片段靶向插入 5. 染色体靶向易位
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编辑技术对比
类别 构成
技术难度 商业价格 脱靶效应
ZFN
ZF Array∷Fok1
第三，每一个成熟的sgRNA能够引导Cas9蛋白定位到双 链DNA的靶位点上并在原型间隔毗邻序列(Proto-spacer adjacent motif, PAM)的上游3~8 bp位置对结合的序列进 行切割(图2A)。
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Cas9的特异性靶点和两个核酸酶结构域
Cas9的特异性靶点 依赖于原型间隔序列3′端PAM序列，不同的Cas9突变体在基因组中拥
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TALENs 包含两个 TALEN 蛋白, 每个 TALEN 都是由 TALE array 与 FokⅠ融合而成. 其中一个 TALEN 靶向正义链上靶 标位点, 另一个则靶向反义链上的靶标位点. 然后 FokⅠ形成 二聚体, 在靶向序列中间的 spacer 处切割 DNA, 造成双链 DNA 断裂, 随后细胞启动 DNA 损伤修复机制. 针对不同的 TALEN 骨架, 其最适宜的spacer长度不同, 其长度范围一般为 12~20 bp.
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ZFN 诱导的基因组编辑技术可应用于很多物种及基 因位点，具有较好的发展潜力。
缺点: (1)以现有的策略设计高亲和性的 ZFN，需要投
入大量的工作和时间;(2)在细胞中持续表达 ZFN 对 细胞有毒性;(3)虽然三联体设计具有一定特异性，但 仍然存在不同程度的脱靶效应。
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TALEN 基因组编辑技术
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21
CRISPR/Cas9系统的工作原理和机制
当同类的病毒或者质粒再次入侵该细菌时
首先，tracrRNA与pre-crRNA的重复序列结合；
第二，内源RNase Ⅲ切割pre-crRNA/ tracrRNAs复合
体，切除5′末端的间隔序列，形成成熟的crRNA，并与 tracrRNA形成被称为向导RNA (Single guide RNA, sgRNA)的嵌合RNA分子；
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2011年，才揭示了CRISPR/Cas系统的分子机制： 当病毒首次入侵时，细菌会将外源基因的一段序列整合 到自身的CRISPR的间隔区；病毒二次入侵时，CRISPR 转录生成crRNA前体(pre-crRNA)，pre-crRNA经过加 工形成含有与外源基因匹配序列的 crRNA，该crRNA与 病毒基因组的同源序列识别后，介导Cas蛋白结合并切 割，从而保护自身免受入侵。
Ⅰ型和Ⅲ型CRISPR/Cas系统较为复杂，需要多个Cas 蛋白形成复合体切割DNA双链，而Ⅱ型CRISPR/Cas系统 只需要一个Cas9蛋白核酸酶来切割DNA双链,即为现在广 泛应用于遗传学基因编辑的CRISPR/Cas9系统。
TypeⅡ系统中只有一种核酸酶—Cas9核酸酶，在该 系统中Cas9蛋白与crRNA参与对抗外源噬菌体和质粒的 入侵。目前，TypeⅡ系统在基因组编辑中应用的最为广 泛。
TALEN
TALEN Array∷Fok1
CRISPR /Cas9 NgAgo-gDNA
Cas9∷sgRNA
NgAgo-gDNA
笨，没有学问无颜见爹娘 ……” • “太阳当空照，花儿对我笑，小鸟说早早早……”
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基因编辑的优势
与传统的以同源重组和胚胎干细胞(embryonic stem cell，ES)技术为基础的基因打靶技术相比， 基因编辑新技术保留了可定点修饰的特点，可应用 到更多的物种上，效率更高，构建时间更短，成本 更低。
2002年科学家才将其命名为成簇的规律间隔短回文重复 序列(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats, CRISPR) ，现有测序结果显示40%的细菌基因组中 含有CRISPR位点。
2005年，科学家们发现CRISPR中的许多间隔序列来源于 质粒和病毒，CRISPR的基因座能够被转录，并且Cas基因编 码的蛋白具有核酸酶和解旋酶结构域，因此推测CRISPR/ Cas 是利用无义的RNAs标记外源核酸序列的防御系统。
有不同的PAM序列，来源于酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)的Cas9 识别一个5′- NGG-3′的PAM，而来源于嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)和脑膜炎奈瑟氏菌(Neisseria meningi-tidis)的Cas9分别识
别5′-NNAGAAW-3′的PAM和5′-NNNNGATT-3′的PAM。 Cas9拥有两个核酸酶结构域 分别是蛋白中间的HNH结构域和蛋白氨基酸末端附近的RuvC-like结构
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实验结果表明, TALENs在靶向DNA时, 第一个碱基为 T 时其结合效果更佳。 通过组合各类模块，可对任意核苷酸序列进行靶向特异 性敲除或内源基因的表达调控。
目前已在人、大鼠、小鼠、猪、羊、斑马鱼、拟南芥 及酵母等多类物种中得到成功应用。
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CRISPR /Cas9 基因组编辑技术
CRISPR/Cas9系统的发现可以追溯到1987年，日本学者 首次在大肠杆菌(E. coli)基因组中发现一连串短的空间间隔重 复序列。随后，在其他细菌和古细菌中也发现了这一特殊的 序列。
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基因编辑原理
现代基因组编辑技术的基本原理是相同的，即 借助特异性 DNA 双链断裂( DNA doublestrand breaks DSBs) 激活细胞天然的修复机 制，包括非同源末端连接( NHEJ)和同源重组 修复(HDR) 两条途径。
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基因编辑发展史
第一代: ZFN(锌指核酸酶) 第二代: TALEN(转录激活样效应因子核酸酶) 第三代: CRISPR/Cas9(成簇的规律性间隔的短回文重
3. sgRNA的长度也与特异性密切相关。sgRNA的5′端额外增 加两个鸟嘌呤核苷酸后能够显著提高CRISPR/Cas9系统的特异 性。
28
CRISPR/Cas9系统的脱靶效应
CRISPR/Cas9基因编辑系统的特异性决定于sgRNA上 的识别(~20nt)。然而，在复杂的生物基因组中， sgRNA的识别序列可能会与非靶点DNA发生局部匹配 (Partial match)。 这种局部匹配，目前可归结为两类： (1)sgRNA与脱靶位点DNA序列长度相同，但存在碱基错 配。 (2) 脱靶位点DNA序列长度比sgRNA多或少几个碱基，通 过形成DNA凸起(DNA bulge)或RNA凸起(RNA bulge) 来完成其他碱基的正确配对。
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ZFN原理和机制
ZFN=DNA识别域+核酸内切酶
DNA识别域： 由一系列 Cys2-His2锌指蛋白（zinc-fingers）
串联组成（一般3~4个），每个锌指蛋白识别并结合 一个特异的三联体碱基。
核酸内切酶： 非特异性核酸内切酶FokI，形成二聚体时切割双
链DNA。
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ZFN 由锌指蛋白(ZFP)和 FokⅠ核酸内切酶组成。其中，由 ZFP 构成的 DNA 识别域能识别特异位点并与之结合，而由FokⅠ构 成的切割域能执行剪切功能，两者结合可使靶位点的双链DNA 断裂(DSB)。于是， 细胞可以通过同源重组(HR)修复机制和非同 源末端连接(NHEJ)修复机制来修复 DNA。HR 修复有可能会对 靶标位点进行恢复修饰或者插入修饰，而 NHEJ 修复极易发生插 入突变或缺失突变。两者都可造成移码突变，因此达到基因敲除 的目的。