天麻发育过程中酸性磷酸酶及主要代谢产物累积规律研究

ＡＢＳＴＲＡＣＴ
Ｇａｓｔｒｏｄｉａｅｌａｔａ，ａｓａｋｉｎｄｏｆｈｉｇｈｅｒＯｒｃｈｉｄａｃｅａｅｐｌａｎｔｗｉｔｈｏｕｔｒｏｏｔａｎｄｌｅａｆ，ｃａｎｇｒｏｗｏｎｌｙｗｈｅｎｉｔｉｓｃｕｌｔｉｖａｔｅｄｔｏｇｅｔｈｅｒｗｉｔｈＡｒｍｉｌｌａｒｉａｍｅｌｌｅａ．ＴｈｅｒｅｌａｔｉｏｎｏｆＧ．ｅｌａｔａａｎｄＡ．ｍｅＵｅａｉｓａｎｉｍｐｏｒｔａｎｔｐｒｏｂｌｅｍｆｏｒｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇｂｉｏｌｏｇｙｏｆＧ．ｅｌａｔａ．Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ
ｖａｒｉｅｔｉｅｓｏｆＧ．ｅｌａｔａｗｅｒｅｃｕｌｔｉｖａｔｅｄｗｉｔｈｄｉｆｆｅｒｅｎｔｓｔｒａｉｎｓｏｆＡ．ｍｅｌｌｅａ，ａｃｉｄ
ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅａｎｄａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎｒｅｇｕｌａｒｉｔｙｏｆｓｏｌｕｂｌｅｐｒｏｔｅｉｎｓａｎｄｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓｄｕｒｉｎｇｔｈｅｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆＧ．ｅｌａｔａｗｅｒｅｓｔｕｄｉｅｄ．ＴｈｅｅｃｔｏｅｎｚｙｍｅａｃｔｉｖｉｔｉｅｓｏｆｄｉｆｆｅｒｅｎｔｓｔｒａｉｎｓｏｆＡ，ｍｅｌｌｅａ，ａｎｄｔｈｅｅｆｆｅｃｔｏｆｄｉｆｆｅｒｅｎｔｓｔｒａｉｎｓｏｎｔｈｅｙｉｅｌｄｏｆＧ．ｅｌａｔａｗｅｒｅｓｔｕｄｉｅｄａｌｓｏｉｎｔｈｉｓｐａｐｅｒ．
１．Ｔｈｅｉｓｏｚｙｍｅ
ｐａｔｔｅｒｎｓａｎｄａｃｔｉｖｉｔｉｅｓｏｆａｃｉｄｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅｖａｒｉｅｄｄｕｒｉｎｇｉｔｓｇｒｏｗｔｈｐｅｒｉｏｄ．３ｂａｎｄｓｏｆｉｓｏｚｙｍｅｗｅｒｅｏｂｓｅｒｖｅｄｏｎｔｈｅ９０“ｄａｙ，ｂｕｔｔｈｅｓａｍｅｂａｎｄｓｏｆｉｓｏｚｙｍｅｚｙｍｏｇｒａｍｏｎｔｈｅ１２０“ｄａｙｓｈｏｗｅｄｄｅｅｐｅｒｃｏｌｏｕｒ．ＷｈｉｌｅｔｈｅｂａｎｄｏｆＲｆＯ．８５２ｄｉｓａｐｐｅａｒｅｄｏｎｔｈｅｚｙｍｏｇｒａｍｏｆ１５０“ｄａｙ．Ｄｕｒｉｎｇｔｈｅｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓｔａｇｅｆｒｏｍ９０ｄｔｏ１５０ｄ，ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓｏｆａｃｉｄｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅｉｎｃｒｅａｓｅｄｆｉｒｓｔｌｙａｎｄｄｅｃｒｅａｓｅｄｆｉｎａｌｌｙ．２．Ｔｈｅｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓａｎｄｅｃｔｏｅｎｚｙｍｅａｃｔｉｖｉｔｉｅｓｏｆ４ｓｔｒａｉｎｓｏｆＡ．ｍｅｌｌｅａｗｅｒｅｓｔｕｄｉｅｄ．Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｃｅｌｌｕｌｏｓｅ，ｌａｃｃａｓｅａｎｄｐｏｌｙｐｈｅｎｄｏｘｉｄａｓｅｏｆｓｔｒａｉｎＭ１ｉｓｈｉｇｈｅｒｔｈａｎｔｈａｔｏｆｔｈｅｏｔｈｅｒｓｔｒａｉｎｓ．
３．Ｇ．ｅｌａｔａ￡ｅｌａｔａ．Ｇ．ｅｌａｔａ￡ｇｌａｕｃａＳ．Ｃｈｏｗａｎｄｔｈｅｉｒｈｙｂｒｉｄｗｅｒｅｃｕｌｔｉｖａｔｅｄｓｅｐａｒａｔｅｌｙｗｉｔｈ４ｓｔｒａｉｎｓｏｆｄｉｆｆｅｒｅｎｔｓｏｕｒｃｅｓｏｆＡ．ｍｅｌｌｅａ．ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｄｉｆｆｅｒｅｎｔｓｔｒａｉｎｓｏｆＡ．ｍｅｌｌｅａｈａｄｃｅｒｔａｉｎｅｆｆｅｃｔｏｎｔｈｅｙｉｅｌｄｏｆＧ．ｅｌａｔａ，ｂｕｔｖａｒｉａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｃＯｎｔｅｎｔｏｆｓｏｌｕｂｌｅｐｒｏｔｅｉｎｓａｎｄｐｏｌｙｓａｅｃｈａｒｉｄｅｓｈａｄｎｏｃｅｒｔａｉｎｒｅｌａｔｉｏｎｗｉｔｈｔｈｅｓｔｒａｉｎｓｏｆＡ．ｍｅｌｌｅａ．Ｄｕｒｉｎｇｔｈｅｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓｔａｇｅ，ｔｈｅｃｏｎｔｅｎｔｏｆｓｏｌｕｂｌｅｐｒｏｔｅｉｎｓｅｓｃａｌａｔｅｄ，ａｎｄｔｈｅｃｏｎｔｅｎｔｏｆｔｈｅｈｙｂｒｉｄｉｓｈｉｇｈｅｒｔｈａｎｔｈａｔｏｆＧ．ｅｌａｔａ￡ｅｌａｔａａｎｄＧ．ｅｌａｔａ￡ｇｌａｕｃａＳ，Ｃｈｏｗ．Ｔｈｅｃｏｎｔｅｎｔｏｆｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓｉｎｃｒｅａｓｅｄｆｉｒｓｔｌｙａｎｄｔｈｅｎｄｅｃｒｅａｓｅｄ，ａｎｄｔｈｅｃｏｎｔｅｎｔｏｆＧ．ｅｌａｔａ￡ｅｌａｔａｉｓｈｉｇｈｅｒｔｈａｎｔｈａｔｏｆＧ．ｅｌａｔａ￡ｇｌａｕｃａＳ．Ｃｈｏｗａｎｄｔｈｅｈｙｂｒｉｄ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ｇａｓｔｒｏｄｉａｄａｔａ；
ｓｏｌｕｂｌｅｐｒｏｔｅｉｎ；Ａｒｍｉｌｌａｒｉａｍｅｌｌｅａ；ａｃｉｄｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ；ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｆｉｄｅ
２
第一章天麻发育过程中酸性磷酸酶的研究
ｆｊｕ吾
天麻（ＧａｓｔｒｏｄｉａｅｌａｔａＢ１．）为多年生草本植物，是一种名贵的传统中药。

天麻隶属于兰科（Ｏｒｃｈｉｄａｃｅａｅ）、树兰亚科（Ｅｐｉｄｅｎｄｒｏｉｄｅａｅ）、天麻族（Ｇａｓｔｒｏｄｉｅａｅ）、天麻亚族（Ｇａｓｔｒｏｄｉｎａｅ）、天麻属（Ｇａｓｔｒｏｄｉａ）（王秋颖，２０００）。

天麻主要分布于我国以及亚洲的其他一些国家。

临床上应用于治疗眩晕眼黑、头风头痛、肢体麻木、半身不遂、小儿惊痫动风。

药理研究表明天麻具有镇惊、抗癫痫、镇静、安眠、镇痛、促智抗衰老、扩血管、降压、抗缺血缺氧、增强抗炎免疫等作用，且毒性很小（陆光伟，１９８５；郝小燕，２０００）。

主要化学成分为天麻蕾，含量在Ｏ．３％以上，此外还有对羟基苯甲醇、对羟基苯甲醛、琥珀酸、谷甾醇以及蔗糖等（冯孝章等，１９７９；周俊，１９７９；Ｙｕｎ．Ｃｈｏｉｅｔａｌ，１９９６）。

目前天麻在我国普遍栽培，分布较广，在种内产生了很多变异，花的颜色、花茎的颜色、块茎的形状、块茎的含水量等不同，根据这些变异，将天麻划分为４个类型，即原变型一红天麻（Ｇ．ｅ／ａｔａＢ１．ｆ．ｅｌａｔａ）、绿天麻（Ｇ．ｅ／ａｔａＢＩ．￡ｖｉｒｉｄｉｓＭａｋｉｎｏ）、乌天麻（Ｇ．ｅ／ａｔａＢＩ．￡ｇｌａｕｃａＳ．Ｃｈｏｗ）、黄天麻（Ｇ．ｅｌａｔａＢＩ．ｆ．ｇａｖｉｄａＳ．Ｃｈｏｗ）（周铉等，１９８３）。

在生产中栽培最多的主要是红天麻、乌天麻和绿天麻。

红天麻也称红杆天麻，我国长江流域诸省、东北、西南及日本、朝鲜、前苏联远东地区都有分布，我国陕西省汉中地区各县，以及陕南、豫西、ＪＩＩ北等地主要野生和栽培的也是红杆天麻，分布在海拔８００．１５００米的山区。

花茎肉红色，花浅姜黄色、微带淡红色，果实椭圆形、肉红色，块茎长椭圆形、淡黄色、重５００余克，含水量７８％．８６％，商品天麻节数多、纵皱纹多且明显。

乌天麻也称乌杆天麻、铁杆天麻，花茎灰褐色，带有明显的白色纵条斑。

花黄绿色，果实有棱、间隔浅黄绿与褐色条纹，为上粗下细的倒圆锥行。

块茎短柱形，前端有明显的肩，淡黄色，最大者可达１０００余克，含水量７１％左右，商品天麻坚实，外观品质佳，节数少，皱纹少且不明显。

我国东北长白山区有乌天麻生长，南方主要分布在海拔１５００米以上的高山区，在高山区栽培的主要是乌杆天麻。

绿天麻，花茎黄绿至蓝绿色，花黄绿色，果大、卵圆形、绿色，块茎圆锥形，是较稀有的栽培品种。

天麻无根无绿色叶片，不能进行光合作用营自养生活，必须同化蜜环菌才能正常生长发育。

天麻与蜜环菌的关系，是高等兰科植物与真菌之间一个生物相关问题。

早在１９世纪，人们就发现兰科植物中存在着真菌。

１８８６年，Ｗａｈｒｌｉｃｈ在实验室条件下，对兰科菌根进行了解剖观察，得出植物细胞消化入侵真菌的结论；Ｂｅｒｎａｒｄ于１９０３年首次报道真菌和兰科植物种子萌发的关系，认为自然条件下存在的兰科种子，只有被适宜的真菌所感染才能成功发芽：Ｂｕｒｇｅｆｆ．Ｈ．（１９３９）认为真菌可侵染正常种子，以及己吸水膨大或即将萌发的种子，他分离并命名了许多真菌，发展了消化真
３
菌作为兰科植物生长营养来源的重要理论。

１９４３年，Ｂｕｒｇｅｆｆ．Ｈ．研究指出，兰科植物菌根消化真菌的方式有两种，一是真菌以菌丝结的形式被同化，即侵入根或根茎细胞中的菌丝形态发生变化，相互扭曲盘绕成菌丝结被消化掉；二是胞质溢出，即真菌的原生质体注入吸收细胞被利用，这种状况是由胞质溢出的特殊菌丝来完成。

兰科植物菌根形成的过程，可分为两个阶段；第一个阶段是种子萌发幼苗时的初次侵染；第二个阶段是幼苗生长新根时的再次侵染（弓明钦，１９９７）。

１９１１年，日本学者Ｋｕｓａｎｏ．Ｓ．首次发表论述天麻与蜜环菌关系的论文，通过切片和绘图阐述了天麻与蜜环菌的共生关系，并对天麻的无性繁殖生长过程进行了观察和论述，为以后学者研究天麻奠定了基础。

Ｂｕｒｇｅｆｆ．Ｈ．对天麻属的Ｇ．ｃａＵｏｓａ和Ｇ．ｆａｖａｎｉｃａ切片观察后指出，真菌经天麻块茎的表皮细胞侵入后，皮层细胞中的菌丝细胞壁明显比侵入前加厚，并有囊状结构附着，这一现象在天麻属和其他兰科植物菌根中普遍存在（Ｈａｄｌｅｙ．Ｇ１９７２），加厚物和泡束可能来自寄生的细胞质和质膜，并进一步证实其上有消化真菌的酶类存在（Ｈａｄｌｅｙ．Ｇ１９７５）。

近年来，我国对天麻与蜜环菌之间的关系研究取得一定的进展，但对二者之间是共生、寄生或腐生关系，仍有不同看法。

张维经（１９８０）认为天麻一蜜环菌一绿色植物（死的或活的）三者之间是一种二重寄生现象，天麻应属于真菌营养型的寄生植物，并观察了蜜环菌对天麻侵染的详细过程，发现有正常生理侵染和病理侵染两种状况，病理侵染的突出表现是入侵的菌索可冲破消化层而瓦解深层组织；周铉（１９８７）认为蜜环菌与天麻是一种寄生与反寄生的关系；蔡义荣（１９８７）则认为天麻与蜜环菌是一种共生关系，天麻与蜜环菌对环境条件要求的一致性是它们建立共生关系的环境基础，在营养上两者之间的依赖性，是它们建立共生关系的物质基础，天麻一蜜环菌一绿色植物这条食物链中，前两者的关系存在着不稳定性。

兰进等（１９９４）利用３Ｈ．葡萄糖标记天麻，追踪标记化合物是否存在于蜜环菌中，结果表明，蜜环菌能从天麻中获取营养。

兰进等（１９９６）应用放射性自显影技术，追踪观察标记蜜环菌侵染天麻过程中标记物在天麻体内的积累、分配和运输，发现线粒体、内质网等细胞器上均有银粒，表明被同化的蜜环菌作为天麻的主要营养参与代谢过程。

兰进的实验表明，蜜环菌不仅供给天麻营养，也可以从天麻中获取营养，天麻与蜜环菌的营养关系是一种双方相互受益的特殊的共生关系。

徐锦堂（１９９０）采用常规石蜡切片技术，发现蜜环菌以菌索形态侵染天麻茎，菌索直达皮层内易染菌层，形成菌丝流，初期蜜环菌侵染为主动，其主要营养来源为菌材，同时以天麻细胞的原生质为营养，并指出天麻与蜜环菌是一种特殊的共生关系。

溶酶体是与细胞自溶和消化作用有关的细胞器，酸性磷酸酶是其标志酶。

酸性磷酸酶是一种在酸性条件下水解各种磷酸酯的酶，与细胞间物质转运、磷酸基团转移反应以及物质代谢有关（田国伟，１９９４；Ｊｏｓｈｉ，１９８５）。

植物溶酶体在细胞内自身物质的分解转化、种子萌发过程中贮藏物质的利用以及细胞自溶过程中起着重要作用。

采用酸性磷酸酶细胞化学定位来研究菌麻关系是以前常用的方法（刘成运，１９８１；
４
王贺，１９９２）。

刘成运（１９８１）报道，菌丝侵入天麻皮层细胞，导致小液泡破裂，释放水解酶将细胞自身和菌丝一同水解，他认为皮层细胞以过敏性坏死的方式消化蜜环菌，大型细胞以吸收和合成作用为主；董兆彬（１９８６）认为只有通过皮层细胞与大型细胞的相互协作才能完成对菌丝消化的全过程，即若干皮层细胞首先将菌丝细胞壁消化掉，然后大型细胞对裸露的菌丝原生质碎段进行彻底消化；而王贺（１９９２）认为天麻大型细胞在抵御和消化蜜环菌过程中起重要作用，大型细胞通过溶酶体小泡主动消化蜜环菌且保持自身活性。

酸性磷酸酶在生物体的不同发育阶段，不同器官和不同环境下有着不同的表达方式，在生物体生长和对环境胁迫反应中起着重要作用。

Ｅｚａｗａ（１９９４）发现，在Ｇｌｏｍｕｓｅｔｕｎｉｃａｔｕｍ侵染金盏菊（Ｃｌｅｎｄｕｌａｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）过程中，产生一种诱导性酸性磷酸酶，通过Ｎ一末端氨基酸分析，发现这种酸性磷酸酶起源于寄主植物。

在植物与真菌的系统进化中，同工酶分析技术已经成为一个有价值的研究工具。

Ｓｅｖｉｏｕｒ和Ｃｈｉｌｖｅｒｓ（１９７２）首次将电泳技术应用到菌根研究上，在Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ－Ｐｉｓｏｌｉｔｈｕｓ菌根共生体中分离得到真菌的蛋白质：Ｇｉａｎｉｎａｚｚｉ等（１９７６）在、，Ａ菌根中检测到碱性磷酸酶同工酶。

早期的研究表明，同工酶分析技术在菌根和寄主植物相互关系的研究上，无论在生物化学水平上，还是在生态学水平上，都具有相当的潜力。

通过同工酶分析，对Ｇｌｏｍｕｓｍｏｓｓｅａｅ、Ｇ．ｃａｌｅｄｏｎｉｕｍ、Ｇ．［ａｓｉｃｕｌａｍｍ、Ｇ．ｄｅａｅｒｔｉｃｏｌａ与一些特定宿主共生时，可以对各自侵染情况进行鉴别（弓明钦，１９９７）。

用未接种的同～植物的根和相应菌根真菌的同工酶进行鉴别，可鉴别出宿主和真菌的多种同工酶图谱的差异。

同工酶不仅是生理指标，而且是可靠的不同发育阶段的标志。

本研究采用同工酶技术，对天麻发育过程中酸性磷酸酶的动态变化进行了分析，以期通过对天麻发育过程中酸性磷酸酶的研究，进一步探讨天麻与蜜环菌的相互关系以及天麻的生理发育机理。

第一节材料与方法
１．供试材料
红天麻采自随州市三里岗镇尚店天麻种植基地。

自天麻播种起，分别于９０ｄ，１２０ｄ，１５０ｄ，１８０ｄ采样检测。

２．供试试剂
２．１酸性磷酸酶（ＡＣＰ）活性测定系列试剂
２．１．１ＡＣＰ反应混合液：ＮａＡｃｐＨ５．１０，１ｍｏｌ／Ｌ，ＣａＣｌ２５ｍｍｏｌ／Ｌ
对硝基磷酸苯酚（ＮＰＰ）５０ｍｍｏｌ／Ｌ
２．１。

２ＮａｚＣ０３１ｍｏｌ／Ｌ
２．１．３对硝基苯酚（ＡＲ）
２．２同工酶分析系列试剂
２．２．１分离胶缓冲液（ｐＨ８．９）：＂Ｉｒｉｓ３６．６９，ＴＥＭＥＤ０．４６ｍＬ，１ＭＨＣｌ４８ｍＬ，用蒸馏水溶解定容至１００ｍＬ，４℃保存。

２．２．２分离胶贮液：丙烯酰胺２８．ｏｇ，Ｎ，Ｎ’一二甲基丙烯酰胺Ｏ．７５３９，用蒸馏水溶解定容至１００ｍＬ，４６Ｃ保存。

２．２．３浓缩胶缓冲液（ｐＨ６．７）：Ｔｒｉｓ５．９８９，ＴＥＭＥＤ０．４６ｍＬ，１ＭＨＣＩ４８ｍＬ，用蒸馏水溶解定容至１００ｍＬ，４。

Ｃ保存。

２．２．４浓缩胶贮液：丙烯酰胺１０．Ｏｇ，Ｎ，Ｎ’一二甲基丙烯酰胺２．５９，用蒸馏水溶解定容至１００ｍＬ，４。

Ｃ保存。

２．２．５过硫酸铵贮液：过硫酸铵０．１４９，用蒸馏水溶解定容至１００ｍＬ，４＂Ｃ保存。

２．２．６甘油溴酚蓝指示剂：溴酚蓝０．１９，蒸馏水５０ｍＬ，甘油５０ｍＬ，４℃保存。

２．２．７电极缓冲液（ｐＨ８．３）：Ｔｒｉｓ６．０９，甘氨酸２８．８９，用蒸馏水溶解定容至１０００ｍＬ，４。

Ｃ保存，使用时稀释１０倍。

３．ＡＣＰ活·性测定
３．１酶液制备：称取冰冻材料２．０９，加入３ｍＬ冷却提取缓冲液（Ｏ．１ｍｏｌ／Ｌ，ＮａＡｃｐＨ５．１）匀浆，离一ｔｌ，（４。

Ｃ，１００００ｒｐｍ，１５ｍｉｎ），取上清夜，一２０℃保存备用。

３．２对硝基苯酚（ＮＰ）标准曲线的制作：以不同浓度的对硝基苯酚溶液，于４００ｎｍ处测吸光度，绘制标准曲线Ｙ＝０．１３２３ｘ一０．０８３７，ｒ＝０．９９７４。

３．３测定方法：
３．３．１取上述制备的ＡＣＰ酶液０．５ｍＬ，用超纯水稀释至５ｍＬ，再加入３ｍＬＡＣＰ反应混合液，并摇匀，３７℃水浴中保温３０ｍｉｎ。

３．３．２加入２ｍＬ０．５ｍｏｌ／ＬＮａ２Ｃ０３以终止酶反应，提供反应产物ＮＰ显色的碱性环境，用７２２型光栅分光光度计测４００１１ｍ处光吸收。

３．３．３从标准曲线上查出ＮＰ的释放量，折算成单位鲜重块茎组织内的ＡＣＰ活性。

４．ＡＣＰ同工酶分析
４．１酶液制备：称取去皮材料１．０９，加入３ｍＬ冷却提取缓冲液（Ｏ．１ｍｏｌ／Ｌ，＂Ｉｒｉｓ—ＨＣＩ，ＤＨ８．０），冰浴中匀浆，离心（４℃，１００００ｒｐｍ，１５ｍｉｎ），上清液保存于－２０℃低温冰箱中，待用。

４．２凝胶制备
４．２．１７．２％分离胶（１６ｍＬ）：分离胶缓冲液２ｍＬ
分离胶贮液４ｍＬ
超纯水２ｍＬ
过硫酸铵贮液８ｍＬ
从图１．１可以看出，在天麻发育生长过程中，ＡＣＰ活性呈现先升高后下降的趋势。

ＡＣＰ活性以１２０ｄ为最高，约为９０ｄ的１．４倍和１８０ｄ的１．６倍。

酶活性的增强与减弱，都与当时的细胞生长阶段和生理状况有直接的联系，是细胞生理状况的·个指标。

在９０ｄ—ｔ２０ｄ这段时期，天麻进入旺盛生长期，细胞新陈代谢活跃，表现为ＡＣＰ活性增强，而１５０ｄ以后，天麻生长缓慢，生理生化代谢低下，ＡＣＰ活性较低。

２．天麻发育过程中ＡＣＰ同工酶酶谱
图１．２表明，在天麻生长９０ｄ时，ＡＣＰ同工酶图谱中具有３条谱带，其中Ｒｆ为Ｏ．８２７和０．８５２的两条谱带显色较弱：生长至１２０ｄ，谱带数量及Ｒｆ值均没有变化，但着色程度加深；而在生长至１５０ｄ后，Ｒｆ为Ｏ．８５２的谱带消失。

在所有谱带中，最主要的谱带是ＲｆＯ．６５４带，谱带较宽，着色也较深，同时也是天麻发育过程中共有的谱带。

９０ｄ１２０ｄ１５０ｄ
图１．２天麻发育过程中ＡＣＰＮＴ酶酶谱
ｏｆＧ．ｅｌａｍＦｉｇ．１．２ＴｈｅｚｙｍｏｇｒａｍｏｆＡＣＰｉｓｏｚｙｍｅｄｕｒｉｎｇｔｈｅｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ
第三节小结与讨论
天麻依靠同化侵入其细胞内的蜜环菌获取异源营养，天麻细胞对入侵菌丝的消化是一个复杂的过程；天麻对真菌的同化不仅表现在天麻与真菌细胞结构的变化上，而且涉及到相互作用过程中两者所产生物质的化学性质。

在许多病变组织里，代谢活动的增加与核酸和蛋白质的合成的显著增强相伴随。

蜜环菌侵染天麻过程中，其侵染过程可以影响核酸和蛋白质的代谢，引起天麻细胞代谢活动的变化，导致组织细胞生理状态的改变，表现为某些酶活性的变化。

８
第二章蜜环菌不同菌株生物学特性及胞外酶活性的研究
丹ｌＪ吾
蜜环菌（Ａｒｍｉｌｌａｒｉａｍｅｌｌｅａ）属于担子菌亚门（Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｏｔｉｎａ）、伞菌目（Ａｇａｒｉｃａｌｅｓ）、白磨科（Ｔｆｉｃｈｏｌｏｍａｔａｃｅａｅ）、蜜环菌属（ＡｒｍｉＵａｒｉａ（Ｆｒ．）Ｓｔａｕｄｅ．）（徐锦堂，１９９３）。

蜜环菌广泛分布于世界热带和温带许多国家的森林地区，在其不同发育阶段，
形态上有子实体和菌丝体之分；菌丝分隔，乳白色，成熟菌丝常密集结成菌索，菌索外为一层红褐色或黑褐色胶质外壳，直径１－２ｍｍ，菌索先端呈白色，为菌索生长点：子实体丛生成伞状，菌盖近卵圆形，常具蜜状粘液，菌柄中上部有菌环（胥献字，１９９８）。

自１７９０年由Ｖａｌｌｌ鉴定该种以来，国外最早报道蜜环菌可引起多种针叶树及阔叶树根腐病，其寄主植物多达３００属，但并非完全致病，相反有些被蜜环菌侵染的植物生长旺盛，有的必须有该菌侵染，植物才能正常生长，甚至有些大型真菌菌核也必须靠蜜环菌侵染提供营养而生长繁殖。

目前，在世界范围内，已报道的蜜环菌菌种有３６种。

欧洲分布５种，北美分布７种，非洲分布２种，日本分布６种，澳大利亚分布５种，我国记载９种，主要分布在黑龙江、吉林、辽宁、山西、甘肃、福建、湖北、四川等２２个省、自治区（王秋颖，２０００）。

蜜环菌是一种兼性寄生菌，以腐生为主，兼营寄生生活，该菌多腐生在林间枯木、死树根和枯枝落叶上，分解木质素及纤维素为营养。

蜜环菌作为一种好气真菌，只有在通气良好的情况下，才能生长旺盛，菌索有输送氧气的能力。

在黑暗处，蜜环菌的菌丝和幼嫩的菌索能够发出荧光，其作为一种著名的发光菌很早就引起了科学家的关注（Ｔｕｌａｓｎｅ，１９４８）。

蜜环菌生长的温度范围在６—３０℃，但以２５℃为其最适生长温度，超过３０℃菌索就停止生长。

蜜环菌是促进天麻、猪苓生长发育的重要菌根真菌，兰科药用植物天麻块茎需要有蜜环菌的侵入才能正常生长发育，大型药用真菌猪苓菌核也是靠蜜环菌的侵入才能正常生长发育（王秋颖２００１）。

蜜环菌质量的优劣，直接关系到天麻（ＧａｓｔｒｏｄｉａｅｌａｔａＢ１．）与猪苓（Ｇｒｉｆｏｌａｕｍｂｅｌｌａｔａ）的产量和质量。

同时，蜜环菌又是重要的药食兼用真菌。

蜜环菌发酵产物与天麻有类似的药理作用，具有镇静、抗惊厥、增强耐缺氧能力及增强肌体免疫功能等作用；蜜环菌多糖（Ａｒｍｉｌｌａｒｉａｍｅｌｌｅａｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ，ＡＰ）是其有效成分之一，国外从蜜环菌子实体内分离出两种多糖，一种为水溶性葡聚糖；另一种为多肽葡聚糖。

因此优良蜜环菌菌株的选育不仅是天麻、猪苓高产的关键，也是选择高产发酵菌株的关键。

本试验选择了４个有代表性的供试菌株，对它们的生物学特性以及液体深层发酵过程中几种胞外酶活性的变化进行了系统研究，以便为蜜环菌优劣的鉴定提供理论依据。

１０
第一节材料与方法
１．供试菌株
蜜环菌菌株Ｍ。

和Ｍ３由宜昌市微生物研究所提供（宜昌市下堡坪乡野生蜜环菌菌材上分离）；Ｍ２由宜昌市乌红天麻公司提供（宜昌市雾渡河镇野生蜜环菌菌材上分离）：Ｍ４由宜昌市乌红天麻公司提供（湖北省五峰县野生蜜环菌菌材上分离）。

２．供试培养基
２．１ＰＤＡ培养基
葡萄糖２０９，土豆２００９，琼脂２０９，蒸馏水１０００ｍＬ。

２．２液体发酵培养基
玉米粉３０９，麸皮２０９，葡萄糖２０９，蛋白胨ｌｇ，ＫＨ２Ｐ０４３９，ＭｇＳ０４·７Ｈ２００．５９，Ｋ２ＨＰ０４Ｏ．５９，蒸馏水１０００ｍＬ，ｐＨ自然。

３．试验方法
３．１蜜环菌不同菌株的平板培养
将灭菌的ＰＤＡ培养基倒入直径９ｃｍ的无菌培养皿中，每皿倒入培养基１５ｍＬ，冷却后无菌操作分别接入活化的ｌｃｍ长的幼嫩蜜环菌菌索，在２５。

Ｃ条件下进行培养，每日观察，并记录菌索生长速度，每个处理５次重复。

３．２不同蜜环菌菌株胞外酶活性的研究
３．２．１菌丝体培养
选用液体发酵培养基，分装后（１００ｍｌｄ２５０ｍＬ三角瓶）高压灭菌；冷却后无菌操作分别接入不同菌株，标记后，１１０ｒｐｍ，２５℃，摇床培养８天。

３．２．２酶液制备
均匀取发酵液５ｍＬ于１０ｍＬ刻度离心管内，３０００ｒｐｍ，４。

Ｃ离心１０ｒａｉｎ，取上清液。

３．２．３酶活性定义
滤纸纤维素酶（ＦＰ酶）底物为定性滤纸（新华）
ｌｕ＝ｌｍｇ葡萄糖／６０ｒａｉｎ－ｍＬ发酵液
多酚氧化酶以邻苯二酚为底物
ｌｕ＝ＡＯＤ／３０ｍｉｎ－ｍＬ发酵液
漆酶以邻联甲苯胺为底物
１ｕ＝△ＯＤ／３０ｒａｉｎ·ｍＬ发酵液
３．２．４酶活性的测定
３．２．４．１纤维素酶活性测定：采用滤纸作为底物测定纤维素酶的活力，分别于酶管中加入一条新华１号滤纸（１＞（６ｃｍ），而后加入ｌｍＬ０．０５Ｍ柠檬酸缓冲液（ｐＨ４．５），再往酶管中加入粗酶液ｌｍＬ，置于５０。

Ｃ保温６０ｒａｉｎ，取出后，立即加入ＤｉＮＳ试剂１．５ｍＬ，于１００。

Ｃ水浴中５ｍｉｎ，取出冷却后加蒸馏水至２５ｍＬ，混匀，然后于５２０ｎｍ处测ＯＤ值，３次重复。

另取同量酶液，沸水浴５ｍｉｎ灭活后，作为对照。

以不同浓度的葡萄糖溶液与ＤＮＳ试剂反应，在５２０ｎｍ处测ＯＤ值，得到葡萄糖标准曲线ｙ＝０．３８９３ｘ＋０．０４９４ｒ＝Ｏ．９９４２。

３．２．４，２漆酶活性测定：取１３．３６ｍＭ邻联甲苯胺（用９５％乙醇溶解）０．５ｍＬ作为底物，加入０．１Ｍ醋酸缓冲液（ｐＨ４．６）３．４ｍＬ，再加入０．５ｍＬ酶液，置２８℃下反应３０ｒａｉｎ，然后于６００ｎｍ处测０Ｄ值，３次重复。

另取同量酶液，沸水浴５ｒａｉｎ灭活后作为对照。

３．２．４．３多酚氧化酶活性测定：取０．１ｍＭ的邻苯二酚２．０ｍＬ，加入０．０５Ｍ磷酸缓冲液（ｐＨ６．０）２．０ｍＬ，加入０．５ｒｎＬ酶液，置２８℃下反应３０ｍｉｎ，然后于４００ｎｍ处测ＯＤ值，３次重复。

另取等量酶液，沸水浴５ｍｉｎ灭活后作为对照。

第二节结果与分析
１．蜜环菌不同菌株生物学特１性的比较
通过对不同菌株进行平板培养，对蜜环菌不同菌株的菌索生长速度、菌丝和菌索萌动天数进行了测定，同时观察了菌索的生长状况，结果见表２．１。

由表２．１可以看出，菌株Ｍ。

生长较快，且菌丝粗壮，分枝茂盛；菌株Ｍ２的生长较缓慢，分枝较少，且色素分泌较多。

表２．１不同菌株生长特点的比较
Ｔａｂｌｅ２．１ＣｏｍｐａｒｉｓｏｎｏｆｔｈｅｇｒｏｗｔｈｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓｏｆｄｉｆｆｅｒｅｎｔｓｔｒａｉｎｓｏｆＡ．ｍｅｌｌｅａ
１２
２．蜜环菌菌株胞外酶活性的测定结果
２．１不同菌株的纤维素酶活性
表２．２不同菌株纤维素酶活。

ｌ生测定结果
Ｔａｂｌｅ２．２ＤｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆｃｅｌｌｕｌｏｓｅａｃｔｉｖｉｔｙｏｆｄｉｆｆｅｒｅｎｔｓｔｒａｉｎｓｏｆＡ．，行Ｐｌｌｅａ
菌株Ｓｔｒａｉｎｓ
Ｍ１Ｍ２Ｍ３Ｍ４
蜜环菌以分解基质中的纤维素、半纤维素、木质素来满足其生长繁殖所需要的营养，而纤维素是一种超分子结构的高分子，必须在纤维素酶的作用下才能够分解，４个蜜环菌菌株纤维素酶活性测定结果见表２．２。

由表２．２可知，菌株Ｍ１纤维索酶活力为２．７５ｕ，相对高于其它菌株，说明菌株Ｍｔ分解纤维素的能力可能较高。

２．２不同菌株的漆酶活性
已知漆酶是与木质素等大分子物质降解有关的主要酚氧化酶，是一种含铜的糖蛋白，它能加速木质素芳香族高分子化合物的分解，为蜜环菌提供丰富营养。

胞外漆酶活性越高，菌株分解能力就越强。

漆酶活性测定结果见表２．３，菌株Ｍ１漆酶活性最高，达到Ｏ．１０４ｕ，菌株Ｍ２漆酶活性最低，仅有Ｏ．０４６ｕ。

在发酵液中，菌株Ｍ１的生长速度显著高于菌株Ｍ２；分析其原因，可能是由于漆酶活性强，底物分解快，使菌丝生长速度加快。

表２．３不同菌株漆酶活性测定结果
Ｔａｂｌｅ２．３ＤｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆｌａｃｃａｓｅａｃｔｉｖｉｔｙｏｆｄｉｆｆｅｒｅｎｔｓｔｒａｉｎｓｏｆＡ．ｍｅｌｌｅａ
１３
２．３不同菌株的多酚氧化酶活性
表２．４不同菌株多酚氧化酶活性测定结果
Ｔａｂｌｅ２．４Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆｐｏｌｙｐｈｅｎｏｌｏｘｉｄａｓｅ
ａｃｔｉｖｉｔｙｏｆｄｉｆｆｅｒｅｎｔｓｔｒａｉｎｓｏｆ
Ａ．ｍｅＵｅａ
菌株Ｓｔｒａｉｎｓ
Ｍ１Ｍ２Ｍ３Ｍ４
多酚氧化酶是与木质素生物降解有关的重要催化剂，也是一种含铜的酶（曾荣鉴，１９９２）。

不同的菌株多酚氧化酶活性不同，其中以菌株Ｍ１活性最高，为Ｏ．５０８ｕ，菌株Ｍ２的活性最差，只有Ｏ．２２８Ｕ。

术质素首先被分解为酚类物，进而被氧化为醌类物。

第三节小结与讨论
本次试验在液体培养的条件下，对蜜环菌菌株进行了胞外酶活性测定，结果表明：菌株Ｍ１的纤维素酶、漆酶以及多酚氧化酶活性均高于其它菌株：菌株Ｍ，在各方面均表现出一定的优势，其生长速度快，菌丝粗壮，分枝茂盛，初步确定菌株Ｍ。

为优良菌株。

木质素、纤维素与半纤维素是构成植物骨架的主要成分，木质素基本结构是苯丙烷类结构单元组成的芳香族高分子化合物，很难为大多数生物直接利用，造成这一一丰富自然资源的巨大浪费，而漆酶和多酚氧化酶是降解木质素的主要酶（史央，２００２）。

蜜环菌侵入植物组织内部生存并同时为天麻生长提供营养，因此蜜环菌应具有很强的降解木质素和纤维素的能力，有可能从蜜环菌中筛选出高产木质素降解酶的菌种，以应用到造纸、秸秆降解等实际生产中。

蜜环菌不同菌株间分泌的胞外酶活性的差异，表现在分解基质中的营养物质的速度有差异。

以菌株胞外酶活性变化为基础，分析比较不同菌株间的生物降解能力，对应地绘制某些特定菌株的特定酶活性曲线，了解其酶学基础，可望用于蜜环菌菌株的鉴定及选育工作（宋爱荣，１９９９；温海洋，１９９９）。

研究蜜环菌酶系和利用细胞工程或基因工程技术，使某些蜜环菌加强或增加某些酶系，对改善底物利用，提高生物效率和保持生态平衡具有重要意义。

本研究的供试菌株主要来自鄂西南地区，从更广泛的区域收集野生菌株，研究其胞外酶活性，将具有更大的理论意义和实践意义。

１４
第三章天麻发育过程中主要代谢产物含量的变化
刚舌
蛋白质是原生质的主要成分，任何植物体、器官组织和细胞都是由多种蛋白质作为基本成分而构成，酶是一类具有催化功能的蛋白质。

蛋白质作为一种含氮的高分子化合物，在植物生命活动中起着重要的作用（潘瑞炽，１９９５）。

根据功能的不同，蛋白质可分为结构蛋白、酶蛋白和贮藏蛋白，其中，酶蛋白和贮藏蛋白主要为可溶性蛋白。

酶蛋白是组成酶成分的蛋白质，参与植物体内各种生化过程，贮藏蛋白则无酶功能，可降解为氨基酸，供植物生长发育需要。

糖类也是植物体中重要的有机化合物，其含量常占植株干重的５０％以上，它既是植物体的组成物质，又是参与新陈代谢的重要底物（潘瑞炽，１９９５）。

多糖是由许多单糖分子缩合而成的高分子化合物，根据功能不同可分为两大类：一是形成植物骨干结构的不溶性多糖，如纤维素、半纤维素、木质素等；二是贮藏的营养多糖，如淀粉、菊糖等。

植物体中的有机化合物种类十分复杂，例如各种糖类、蛋白质、脂肪、核酸等等。

研究植物发育过程中主要代谢产物的变化过程有助于深入了解植物的发育生理和发育机制。

蛋白质和多糖作为两种重要的生物大分子，在植物的生长发育过程中起着重要作用。

天麻（ＧａｓｔｒｏｄｉａｅｌａｔａＢ１．）靠同化蜜环菌（Ａｒｍｉｌｋｒｉａｍｅｌｌｅａ）获取营养，整个营养生长发育期都要依靠外源营养；而在生殖生长阶段，天麻依靠球茎内贮存的营养物质供抽苔、开花、结果。

天麻在整个发育周期中，除组织细胞发生形态和结构的变化外，细胞内的主要组成物质，如蛋白质、脂类、糖类、核酸等在组织细胞中的分布和含量随着发育的不同阶段而变化，它们对天麻个体的生长与分化，既形态建成过程产生重要的影响（刘成运，１９８２）。

刘成运（１９８１）对天麻发育过程中多糖的变化及分布进行了研究，发现天麻在正常生长发育下，各生长期多糖颗粒的数量与发育期的进程成正相关，多糖的积累直接关系到天麻生活周期的长短。

孙士青（１９９０）采用显微组织化学对天麻生长过程中体内的核酸、蛋白质、多糖三类物质进行了定量测定，并对不同时期三类物质的含量进行了两两相关分析，认为生长５个月前后是天麻与蜜环菌共生关系发生阶段性变化的关键时期。

研究天麻发育过程中体内各物质的变化规律及特点，对于了解天麻的发育形态和发育生理，认识菌麻之间的互作关系有着重要意义。

本试验以４种不同来源的蜜环菌菌株分别伴栽红天麻、乌天麻以及红乌杂交天麻，对天麻生长过程中可溶性蛋白及多糖含量进行了系统分析，初步探讨了天麻．蜜环菌之间不同组合中可溶性蛋白和多糖含量的累积规律。