疟疾镜检

染液的浓 度高其着色就快而深，染色时间相对缩短，疟 原虫寄生红细胞的薛氏点粗大显著，但颜色常 偏蓝；染液浓度过低则染色时间相对长一些， 颜色偏酸红，薛氏点不明显或消失。 （5） 稀释和冲洗用水：为使厚、薄血膜着色 较好，应使稀释的染液呈中性或稍偏碱性，故 应用pH7.0~pH7.2的水稀释。当染色太蓝，可 用pH较低的缓冲水冲洗；如染色太红，则用 pH较高的缓冲液冲洗；如染色太深，可延长冲 洗时间，予以校正。
• （2） 染色方法：
• •
A. 常规染色 用PH7.0-7.2缓冲液或蒸馏水将吉氏原液与 缓冲液1：20稀释。 分别加数滴经稀释吉氏染液于厚、薄血膜， 染色25-30分钟后，用中性蒸馏水轻轻将片上 的染液冲去，（冲洗时勿用水直接对准厚血膜， 以免血膜脱落）凉干后镜检。
B. 快速吉氏染色 • 在每毫升缓冲液中加吉氏原液3滴，（1015%吉氏染液）分别加数滴于厚、薄血膜上， 染色5分钟，用流水轻轻冲洗干净，凉干后镜 检。
• 用水过酸可致受染RBC上的点彩染不出来， • 用水过碱，则使薄血膜上的RBC染成灰蓝色， •
致使R的胞浆难以辨论。 因此，当染色结果发生偏蓝（碱）或偏红（酸） 时，可用酸碱度与之相反的缓冲液冲洗血膜， 予以调整。
血片染色好坏除了与玻片是否清洁， 血片制作质量好坏等有关外，还受到 以下几个因素的影响：
• 瑞氏（Wright）染液: • （1）染液配制： • 瑞氏染剂粉 0.1—0.5g • 甘油 3ml • 纯甲醇 97 ml • 将瑞氏染剂粉臵于研钵内，加入甘油
充分研磨后，然后加入少量甲醇碾磨后倒 入有玻塞瓶中，再分次用甲醇冲洗碾钵中 的瑞氏染粉甘油液，倒入瓶中，直至洗完。 充分摇匀，一般放臵一二星期后，再过滤 应用（保存时间愈久，染色力愈佳）。 急用时，放臵24小时后过滤也可使用。
（2）缓冲液的配制
PH M/15 Na2HPO4 M/15 KH2PO4 DW (ml) ( ml) (ml) 6.8 49 51 900 7.0 63 37 900 7.1 68 32 900 7.2 73 27 900 7.4 81 19 900 • 加缓冲液的PH可用试纸或0.02%酚红液测定。 • 亦可用PH7.0中性蒸馏水稀释染剂
3 分子生物学方法应用于疟原虫分型
三、 厚血膜的疟原虫计数
根据预先测定的白细胞数目计算出每微升血液中疟原虫的数目。 在制作厚血膜的同时，使用Coulter计数器或血球计确定每微升血 液中的白细胞数。然后镜检厚血膜，计数同一视野中的疟原虫数和 白细胞数，直到所计数的白细胞数达到确定的数值为止(如果疟原 虫密度较高，计数100～200个白细胞即可，但在疟原虫密度很低时， 计数白细胞数需达1000个)。 用下式算出疟原虫密度： 疟原虫数/白细胞数×白细胞数/μl血=疟原虫数/μl血。 如果无法进行白细胞计数，则可按常规估计白细胞数。国外最 常采用的数值是8000白细胞/μl血,国内常用6000白细胞/μl血。
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• （2）染色方法：
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• 先用腊笔在厚薄血膜间画一界线，滴2-3滴蒸 •
馏水于厚血膜上溶血,弃残液。（小心勿使蒸 馏水超出腊笔线而触及薄血膜）。 在薄血膜上滴瑞氏染液5-8滴，再加与染液等 量的蒸馏水，与染液混合均匀后用玻棒引至厚 血膜上，厚薄血膜同时染色5-8分钟后，用清 水轻轻冲洗数秒钟，待干后镜检。
2．血片制作
（1）取血部位 采血部位有指尖、耳垂、婴儿可在足跟取血 （2） 涂制血膜 厚血膜的涂制：
用推片的左下角刮取血液 4-5μl（约火柴头大小）， 将血滴涂于载片的中央偏右， 由里向外划圈涂成直径为 0.8-1厘米的厚薄均匀的圆 形厚血膜。
（一）薄血膜的涂制：
用棉球抹净角上的血渍， 再刮取血液1.5μl{约1/4 火柴头大小)，将推片的 一端臵于血滴之前，当血 液在载玻片与推片之间向 两侧扩展至约2cm宽时， 使两玻片保持25-35°角， 从右向左迅速向前推成舌 状薄血膜，长约2.5CM。
• （3）厚薄血膜的位臵： • 每张载玻片上分别做1个薄血膜，1个厚血膜。 • •
标准血膜的位臵如下图所示。 （4）血膜的编号 制成血片后，待薄血膜干后用铅笔将代号或个 人编号写于血膜基部，编号要与登记本及结果 报告单上的编号相一致，以防差错。
标准血膜示意图
（二）血片的染色
1．薄血膜的固定 血片完全干燥后才可染色 • 固定的方法： 将涂片的血膜面向上，厚血膜在上端，略倾斜放 臵，干后用小玻棒蘸甲醇在薄血膜上轻轻抹过以 固定薄血膜。 （注意：厚血膜不能固定）
3.染色质量
• 染色较好的血片，肉眼看上去呈淡紫红色（不 应该出现蓝—绿色或红色）； • 镜检红细胞呈淡红色，嗜酸性细胞的颗粒呈鲜 红色，淋巴细胞及疟原虫的胞浆呈蓝色或淡蓝 色，白细胞的核呈紫蓝色； •疟原虫的核呈红色，疟色素清晰可见，在显微 镜下仅有小量染液沉淀。
4. 影响血膜染色的因素
血膜染色好坏，除与玻片的清洁、血膜制作 技术等有关外，尚与下列因素有关： (1)试剂和溶剂的质量：染料、甲醇和甘油如不 纯，常使所配的染液偏酸或偏碱，从而影响 血膜的染色。 (2)染液的新旧：新配制的染液，因色素尚未充 分溶解，一般染色力弱，且常带碱性。染液 放臵较久，染色力逐渐增加，尤以吉氏染液 为甚。通常在染液配制1-2周后才使用。
(3)染液的稀释浓度： • 染液浓度高，则着色快而深，各种细胞着色 粗糙、薛氏点等粗大显著，但颜色偏碱；使 用 • 染液浓度低，染色时间长，则着色慢，颜色 偏酸，各种细胞内部结构着色均匀、细致。 (4)染色时间与温度：染色时间长，化学反应 充分完成，染色效果好，反之则染色效果差。
(5)稀释和冲洗用水：
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混合感染的鉴别
• 1、容易鉴别的混合感染
1）同一血膜中发现间日疟各期原虫和恶性疟雌雄配子体。 2）同一血膜中发现大量纤细的恶性疟环状体，并混有少量 间日疟原虫。
• 2、不易鉴别的混合感染
1）间日疟各期原虫和粗环的恶性疟环状体。 2）仅有间日疟和恶性疟的环状体。 1） 提高检出：对镜检漏诊病人 敏感性达5个原虫/100uL血 2） 确定四种疟原虫，做复核鉴定
厚血膜
• 用血量约为10μl～20μl。涂制成直径1cm的厚血膜 由于在制备过程中红细胞已溶解，疟原虫在形态上仍可 分辨，但胞浆和胞核不可避免地形成一定程度的固缩。 受影响较大的有大滋养体、裂殖体的形态。在镜检厚血 膜时，一般门诊须检查200~1 000个油镜视野（相当于 0.5~2.5μl血量），才能确保镜检的敏感性和可重复性。 通常的敏感性可达约10~20个原虫/μl血。 由于厚血膜与薄血膜相比血量大，须查范围小，节 省时间，阳性检出率较高。厚血膜能查出疟原虫数是薄 血膜的15～25倍。所以，我们推荐疟疾诊断应以检查厚 血膜为主。在普查时均应查完整个厚血膜，未查见疟原 虫则判为阴性。
（ 4）染液的稀释浓度与染色时间
薄血膜中常见的血液成分
中 性 白 细 胞
酸性球
血小板 红血球 淋巴球 大单核球
（三） 厚薄血膜的优缺点及其适用范围
薄血膜
Байду номын сангаас
用血量约为2μl，涂制成2cm宽×4cm长面积 的薄血膜。由于在制备过程中，血片通常经甲醇固 定，使红细胞及其内疟原虫的形态保持完整，便于 疟原虫虫种的鉴定。惟由于用血量少，为保证检测 的敏感性，常耗时较多，似不适用于大规模调查。 即使在医院的化验室，由于要求在短时间内作出诊 断，因而极有可能出现漏诊。
（1）染料溶剂的质量 染料、甲 醇和甘油如果不纯，常使配制的染 液偏酸或偏碱而影响染色效果。因 此必须用分析纯的甲醇和中性甘油， 而且在配制时所用的器具必须干净 而无水份。
（2）染液的新旧 新配制的染液因色素尚未充分 溶解，染色力较弱且常有沉渣。染液存放时间越 久，染色力越强。通常在染液配制1~2周后才使 用，盛装染液的瓶子应加塞盖密。以防吸潮而影 响染液质量。 （3）染液稀释后使用时间 染液的主要成份是美 蓝、伊红和由美蓝氧化产生的天青，三者能在酒 精溶液中溶解，但在水溶液中伊红遇到美蓝和天 青即产生沉淀。因此，必须在稀释染液当时使用， 一般在半小时内染色力最强。
• 2． 染色用水和冲洗用水配制
• 常用中性的蒸馏水或经煮沸过滤的冷开水。用pH7.0～
pH7.2的缓冲液效果最佳。在没有蒸馏水的情况下，也 可用井水、河水、泉水或雨水。为了使血膜着色较好。
• （1）两种贮备液的配制：
• 贮备液I 1/15M磷酸氢二钠（Na2HPO4）溶液 • Na2HPO4 9.5 g • 蒸馏水 1000 ml • 贮备液Ⅱ 1/15M磷酸二氢钾 （KH2PO4 ）溶液 • KH2PO4 9.07 g • 蒸馏水 1000 ml
疟原虫镜检技术
一、显微镜镜检用于疟疾诊断
• 显微镜镜检仍是目前广泛应用的疟疾诊断
技术(金标准） • 主要优点 - 特异高 - 能区分虫种 - 能分期 - 能计数 - 1小时内能完成诊断程序
二、血片制作及染色
1.
所需设备
（1）载玻片 （2）采血针 （3） 玻片盒 （4） 75％乙醇棉球 （5） 铅笔 （6） 登记表
• （1）配制吉姆萨（Giemsa）染液：
• 吉姆萨粉 10g • 甲醇 500ml • 甘油 500ml • 将吉姆萨粉臵于研钵中，加入少量甘油充分研 磨，然后边加边磨，至甘油加完为止，倒入 500ml有塞玻璃瓶中。在研钵中加入少量甲醇 洗涤掉剩余部分并倒入瓶内，重复数次，一并倒 入瓶中，至研钵中甘油洗净为止。塞紧瓶塞，充 分摇匀，在室温下放臵3-5天，每天摇动，即可 使用。放臵时间越长染色效果愈佳。