防腐剂苯甲酸和山梨酸的高效液相色谱分析

防腐剂苯甲酸和山梨酸的高效液相色谱分析

一、实验目的

1、了解高效液相色谱仪的基本结构和工作原理，初步掌握其操作技能。

2、掌握高效液相色谱保留值定性方法和外标定量方法。

二、实验原理

高效液相色谱法是重要的液相色谱法。它选用颗粒很细的高效固定相，采用高压泵输送流动相，分离、定性及定量全部分析过程都通过仪器来完成。

根据使用的固定相及分离机制的不同，一般将高效液相色谱法分为分配色谱、吸附色谱、离子交换色谱和空间排阻色谱等。

在分配色谱中，组分在色谱柱上的保留程度取决于它们在固定相和流动相之间的分配系数K ；

组分在流动相中的浓度组分在固定相中的浓度

K

显然，K 越大，组分在固定相上停留时间越长，固定相与流动相间的极性差值也越大，因此，相应出现了流动相为非极性而固定相为极性物质的正相液相色谱法和以流动相为极性而固定相为非极性物质的反相液相色谱法。目前应用最广的固定相是通过化学反应的方法将固定液键合到硅胶表面上，即所谓的键合固定相。若将正构烷烃等非极性物质（如n-C18烷）键合到硅胶基质上，以极性溶剂（如甲醇和水）为流动相，则可分离非极性或弱极性的化合物。据此，采用反相液相色谱法可分离防腐剂苯甲酸和山梨酸。

本实验采用外标法测定样品中苯甲酸和山梨酸的浓度。外标法又称定量进样-标准曲线法，指用欲测组分纯物质配制成不同浓度的标准溶液，取固定量标准溶液进行分析，从所得色谱图上测出响应信号（峰面积或峰高），然后绘制响应信号（纵坐标）对浓度（横坐标）的标准曲线。分析样品时，取和制作标准曲线时同样量的试样（固定量进样），测得该样品的响应信号，由标准曲线即可查出其浓度。

三、仪器

DIONEX UltiMate3000（USA ） 高效液相色谱仪（配有自动进样器，紫外检测器）。

四、试剂和溶液

苯甲酸（分析纯）、山梨酸（分析纯）、甲醇（色谱纯)、高纯水、0. 02 mol/ L 乙酸铵溶液、标准储备液、标准使用液、标准混合使用液、未知溶液。

五、溶液的配制

(1)乙酸铵溶液(0.02mol/ L ) ：称取1.54g乙酸铵，加水定容至1000mL。

(2)苯甲酸标准储备液：准确称取苯甲酸0.1000g，加少量甲醇完全溶解，移入100 mL的容量瓶中，加水定容，苯甲酸浓度为1.00mg/mL。

(3)山梨酸标准储备液：准确称取山梨酸0.1000g，加少量甲醇完全溶解，移入100 mL的容量瓶中，加水定容，山梨酸浓度为1.00mg/mL。

(4) 苯甲酸标准使用液：吸取苯甲酸10.00 mL，置于100 mL容量瓶中，加水至刻度，苯甲酸为0.10mg/mL。

(5) 山梨酸标准使用液：吸取山梨酸10.00 mL，置于100 mL容量瓶中，加水至刻度，山梨酸为0.10mg/mL。

(6) 标准混合使用液：分别吸取苯甲酸和山梨酸标准储备液10.00 mL，置于100 mL容量瓶中，加水至刻度，苯甲酸和山梨酸浓度均为0.10mg/mL。

六、色谱条件

色谱柱∶chromarex ODS (5μm，20cm×4.6mm )

流动相：甲醇∶乙酸铵( 0. 02mol/L) = 5∶95 (体积比)

流速：1.0m L /min

检测波长：230nm

柱温：25℃

进样体积：10µL

七、实验步骤

1、按从上往下的顺序以下依次打开泵、自动进样器、柱温箱和检测器的电源开关。

2、打开Chromeleon软件界面，连接仪器和软件按钮。

3、按控制面板上的purge阀按钮排气泡。注意：排气泡应一个通道一个通道排。

4、设定流速、柱温和检测波长（流动相：甲醇/水＝5/95，流动相流速：1.0mL·min-1；检测波长：230nm；柱温：25℃；进样体积：10µL。）。注意：开泵时，以0.2 mL·min-1

步进速度（每个平衡点保持0.5分钟以上时间）进行升速，直到设定流速。等待压力稳定后平衡30分钟以上后打开检测器的紫外灯。

5、通过软件建立相应的程序、方法和样品表。

6、通过软件清洗注射器、缓冲环。

7、待仪器稳定后通过控制面板依次分别进标准使用液、标准混合液和未知试液，记录各色谱图，并重复两次。

8、实验结束，关紫外灯和柱温箱。清洗柱子和自动进样器，关泵。

9、断开仪器和软件连接按钮，关闭软件。

10、按从下往上的顺序以下依次关闭检测器、柱温箱、自动进样器和泵的电源开关。

八、数据及处理

1、记录苯甲酸和山梨酸各标准液色谱图的色谱峰的保留时间。

2、依次记录标准混合液色谱图上各色谱峰的保留时间。

3、记录未知液各组分色谱峰的保留时间和峰面积，并根据标准混合液各色谱峰的保留时间判断未知液的组分，应用外标法计算未知试样含量。

九、思考题

1、高效液相色谱分析有那几种常用的定量方法？

2、紫外检测器的工作原理？

参考文献：

[1]朱明华.仪器分析（第三版）.北京：高等教育出版社，2000

[2]魏培海,曹国庆.仪器分析.北京：高等教育出版社，2006

撰写人：王新运