圈养大熊猫肠道微生物分离、鉴定及细菌耐药性研究

圈养大熊猫肠道微生物分离、鉴定及细菌耐药性研究
李蓓;郭莉娟;龙梅;汤纯香;周晓平;罗燕;邹立扣
【摘要】对中国卧龙自然保护区大熊猫研究中心-碧峰峡基地64只大熊猫分别采取粪样,用选择性培养基分离大肠杆菌、沙门氏菌,根据形态特征及16S rDNA序列对菌株进行鉴定;用PDA培养基分离真菌,真菌通用引物ITS4、ITS5进行扩增鉴定.采用K-B法(CLSI)药敏试验测试大肠杆菌和沙门氏菌对18种药敏纸片的耐药性.形态学与rDNA-ITS序列鉴定表明,共分离到真菌19株,鉴定为8个属.分离出大肠杆菌88株,沙门氏菌47株;大肠杆菌对各抗生素的耐药率为0％～ 35.22％,耐药率为TET(35.22％)、AML(12.50％)、S3(12.50％),共产生17种耐药谱,其中TET、AML-TET谱型占优势;沙门氏菌对各抗生素的耐药率为0％～42.55％,耐药率为TET(42.55％)、AML(40.43％)、S3(38.30％),也产生了17种耐药谱,AML和AML-TET谱型占优势.通过对细菌和真菌的分离鉴定以及细菌的耐药性试验,了解大熊猫肠道微生物与不同个体的关系,为研究大熊猫的营养及消化等奠定基础,对预防和诊断大熊猫肠道疾病,提高大熊猫的存活率提供依据.
【期刊名称】《四川动物》
【年(卷),期】2014(033)002
【总页数】6页(P161-166)
【关键词】大熊猫;真菌;大肠杆菌;沙门氏菌;分离鉴定;耐药性
【作者】李蓓;郭莉娟;龙梅;汤纯香;周晓平;罗燕;邹立扣
【作者单位】四川农业大学都江堰校区微生物学实验室,森林资源保护与利用实验室,四川都江堰611830;四川农业大学都江堰校区微生物学实验室,森林资源保护与
利用实验室,四川都江堰611830;四川农业大学资源环境学院,成都611130;四川农
业大学都江堰校区微生物学实验室,森林资源保护与利用实验室,四川都江堰611830;四川农业大学资源环境学院,成都611130;中国保护大熊猫研究中心雅安
碧峰峡基地,四川雅安625000;中国保护大熊猫研究中心雅安碧峰峡基地,四川雅安625000;四川农业大学都江堰校区微生物学实验室,森林资源保护与利用实验室,四
川都江堰611830;四川农业大学都江堰校区微生物学实验室,森林资源保护与利用
实验室,四川都江堰611830
【正文语种】中文
【中图分类】S852.65
大熊猫是世界上最珍贵的动物之一，数量十分稀少，是我国特有的珍稀濒危物种，国家一级保护动物，属哺乳纲食肉目熊科(朱靖，1974)。

从牙齿推断，为适应环
境已进化成为兼食竹类的动物，但大熊猫具有典型食肉动物的消化道，单室胃，结肠短，盲肠退化(胡锦矗，1995)。

大熊猫以竹子为生，除了能够消化、吸收竹子
细胞内含物质外，只能利用一部分半纤维素，排出竹节外形几乎没有什么变化，这种独一无二的消化营养方式，无论是食肉动物还是食草动物都很难见到。

这很可能与大熊猫肠道微生物群落结构特征有关(Lu & Walker, 2001)。

由于菌群结构影响
消化能力，从而影响动物机体的健康状况(鲁海峰等，2005)，在致死大熊猫的各
种疾病当中，以肠道疾病最为严重，其中寄生虫感染列第一位，消化道疾病列第二位。

且大熊猫在圈养情况下肠道疾病更是影响其健康的多发病和常见病(孙飞龙等，2002)。

大肠杆菌Escherichia coli为肠道微生物指示种(熊焰等，2000)，沙门氏
菌Salmonella为疾病指示菌。

分离出这两种细菌并进行药敏试验，可为大熊猫肠道细菌疾病的防治提供参考。

1.1 样品采集
样品采自四川省雅安市中国保护大熊猫研究中心碧峰峡基地，两次采样(2010年7月～2010年12月)共采集64只大熊猫粪样，保存于冰盒中，72 h内送回实验室进行培养。

1.2 培养基与试剂
1.2.1 微生物培养基 EMB培养基、SS培养基、TSA培养基、TSB培养基、MH培养基、MHA培养基、PDA培养基，均购于杭州微生物试剂有限公司。

1.2.2 实验试剂 DNA分子量标准DL2000、dNTP及TaqDNA聚合酶等购自天根生化科技(北京)有限公司。

1.2.3 药敏纸片头孢类：头孢曲松(CRO，30 μg/片)、头孢噻吩(KF，10 μg/片)、头孢他啶(CAZ，30 μg/片)；青霉素类/抑制剂：阿莫西林(AML，10 μg/片)、阿莫西林/克拉维酸(AMC，10/20 μg/片)、氨苄西林/舒巴坦(SAM，10 μg/片)；氨基糖苷类：庆大霉素(CN，10 μg/片)、丁胺卡拉霉素(AK，30 μg/片)、卡拉霉素(K，30 μg/片)；四环素类：四环素(TET，30 μg/片)；喹诺酮类：萘啶酸(NA，30 μg/片)、氧氟沙星(OFX，5 μg/片)、环丙沙星(CIP，5 μg/片)；磺胺类：磺胺复合物(S3，10 μg/片)、复方新诺明(SXT，25 μg/片)；单环内酰胺类：单环菌素(ATM，30 μg/片)；碳青霉烯类：亚胺配能(IPM，10 μg/片)、美罗配能(MEM，10 μg/片)。

以上药敏纸片购于广州迪景微生物有限公司。

1.2.4 仪器设备微量移液器(Eppendorf)、PCR仪(ABI)、电泳仪(BIO-RAD)、凝胶成像系统(BIO-RAD)及自动电热压力蒸汽灭菌锅(LDZX-40AI)等实验室常规仪器。

1.3 分离鉴定
1.3.1 细菌的分离鉴定取64只熊猫粪样分别于伊红美蓝培养基(EMB)、SS培养基划线培养18 h，挑取EMB上金属光泽菌落、SS培养基上黑色菌落，革兰氏染色后镜检观察其形态和染色特征，挑取5个典型菌落至TSB中37℃培养18 h后，保存于含20%甘油中。

分别挑取上述菌落，采用引物27F(5’-
AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)和1492R(5’-TACGGATACCTTGTTACGACTT-3’)扩增16S rDNA序列(黎丽雯等，2012)。

1.3.2 真菌的分离鉴定 64只熊猫粪样4倍稀释后，采用稀释涂布平板法10倍梯
度稀释，每组2个重复。

获得纯化菌种后，转接至PDA培养基，每日测定菌落大小，观察菌丝形态及菌落特征，并记录。

采用改良二次沉淀法(潘欣等，2008；邹立扣，潘欣，2009)，提取子实体及菌丝
体总DNA，所获得的DNA于-20℃冰箱保存备用，用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测。

采用真菌通用引物ITS4(5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’)和ITS5(5’-GGAAGTAAAA-GTCGTAACAAG-3’)进行PCR扩增。

扩增产物经0.8%琼脂糖
凝胶电泳后用凝胶成像系统观察并保存，样品送上海生工生物工程有限公司测序。

将序列在GenBank Blast (http///)比对。

用Clustal X (Larkin et al., 2007)软件对测定序列及从GenBank下载真菌序列进行序列比对，比对后的真菌序列用系统发育分析软件MEGA(Tamura et al., 2007)构建进化树，并进行比对分析。

1.4 药敏试验
采用纸片琼脂扩散法(Kirby-Bauer法)(CLSI，2011)，根据CLSI推荐方法进行操作，选取经鉴定的大肠杆菌、沙门氏菌进行药敏实验，以大肠杆菌ATCC25922
和35218作为质控菌株，根据CLSI (2011)标准判断敏感(S)、中介(I)和耐药(R)，分析病原菌的耐药率及耐药谱。

2.1 细菌分离鉴定
2.1.1 大肠杆菌形态特征在EMB培养基上形态光滑圆润，凸起，中心有紫红色或
黑色，有金属光泽的菌落镜检结果为革兰氏阴性，两端钝圆的短小杆菌。

64只大
熊猫粪样中共分离出88株，经16S rDNA测序结果与基因库(GenBank)中Blast
进行比对，与其他大肠杆菌同源性全部为99%，证明此次实验成功分离出大肠杆
菌。

2.1.2 沙门氏菌形态特征在SS培养基上形态有黑心，边缘整齐、稍隆起、表面光
滑湿润及无色的圆形菌落；培养基由红色变为黄色。

镜检结果为革兰氏阴性，粗短、两端钝圆的小杆菌(比大肠杆菌细)。

64只大熊猫粪样分离出47株，经16S rDNA 测序结果与基因库(GenBank)中Blast中与已知沙门氏菌序列比对，与已知沙门氏菌同源性全部为99%，证明实验成功分离出沙门氏菌。

2.2 真菌鉴定
真菌菌丝经形态特征初步鉴定，分离纯化培养获得真菌19株，rDNA-ITS测序后
从GenBank下载真菌序列进行比对，基于ITS序列构建系统发育树(图1)。

从进
化树可以看出：NXΜ、SB-1、SB-1(2)、XM-1聚为一簇，支持率为67%，同源
性较高；WG-2与Monodictys actica(单格孢属)(EΜ676522.1)支持率为98%，
进化关系极相近；SB-2、SBY、YB、和Dothideomycete sp.(座囊菌属)
(EΜ680536.1)为一簇，SB-2与SBY的支持率为99%，同源性很高；YYC、YA、WJB、TSB、TSA、LX-1、SBC和Arthrinium sp.(节菱孢属) (HQ630961.1)的支持率是100%，为同一属的真菌，进化关系非常近；YYB和Irpex
sp.(EΜ301643.1)支持率为100%，LZ和Schizophyllum commune(裂褶
属)(FJ478109.1)的进化关系也极为相近，支持率为100%；SBY(2)和Ascomycete(子囊菌属)(EΜ490105)的进化关系也极为相似，支持率也为99%；NX-2和Cladosporium sp.(枝孢菌属)(FR799495.1)支持率为99%，进化关系很
相近。

结合形态特征与分子鉴定结果，19株真菌鉴定为8个属，最多为节菱孢属共7株，其次是竹簧属4株，然后是座囊菌属3株，其余各属都只有1株(表1)。

2.5 细菌耐药结果
2.5.1 细菌耐药率由表2可知，88株大肠杆菌对各种抗菌药物耐药率不均一，耐
药率在1.14%～35.22%之间。

其中对TET的耐药率最高，耐药率为35.22%，对其它抗菌药物的耐药率为AML(12.50%)、S3(12.50%)>SXT(6.82%)>KF(4.55%)、NA(4.55%)>SAM(2.27%)>AMC(1.14%)、CN(1.14%)；但对CRO、CAZ、IPM、MEM、ATM、AK、K、CIP耐药率为0%，其中对CRO、IPM、AK 3种抗生素
的药物敏感性达到100%，具有极强的抑菌作用。

大肠杆菌耐药率从抗生素大类比较耐药率依次为：四环素类(35.22%)>青霉素类(12.50%)>磺胺类(6.28%～
12.50%)>氟喹诺酮类(1.14%～4.55%)>头孢类(0%～4.55%)>加酶抑制剂类(1.14%～2.27%)>氨基糖苷类(0%～1.14%)>碳青霉烯类(0%)、单环内酰胺类(0%)。

由表2可知，47株沙门氏菌对TET、AML、S3的耐药率最高，分别是42.55%、40.43%、38.30%，对其他抗生素的耐药率依次为：SXT(12.77%)>KF(4.26%)、AMC(4.26%)>CRO(2.13%)、CAZ(2.13%)、SAM(2.13%)、ATM(2.13%)、
NA(2.13%)，但对IPM、MEM、CN、OFX、CIP 5种抗生素的耐药率为0%，其中对MEM、CN、OFX、CIP的敏感率为100%。

沙门氏菌耐药率从抗生素大类比较，耐药率分别为：四环素类(42.55%)>青霉素类(40.43%)>磺胺类(12.77%～38.30%)>头孢类(2.13%～4.26%)、加酶抑制剂类(2.13%～4.26%)>氨基糖苷类(0%～4.26%)>单环内酰胺类(2.13%)>氟喹诺酮类(0%～2.13%)>碳青霉烯类(0%)。

2.5.2 细菌的多重耐药由表3可以得出，大肠杆菌对抗生素未产生耐药性的菌株占61.36%，耐受1种抗生素的菌株占17.06%，耐受2种抗生素的菌株占11.36%，耐受3种及3种以上抗生素的菌株占10.23%。

沙门氏菌未产生耐药菌株所占总菌株数的比率是17.02%，其耐受1种抗生素的菌株占36.17%，耐受2种抗生素的菌株占29.78%，耐受3种及3种以上抗生素的菌株占17.03%。

2.5.3 耐药谱由表4可知，大肠杆菌对18种抗生素共产生17种耐药谱，88株大肠杆菌中共有34株具有耐药性，其中15株耐1种抗生素，10株耐2种抗生素，
10株耐3种及3种以上抗生素，也有的耐4种抗生素。

大肠杆菌耐药谱最多的抗生素组合是TET、AML-TET。

沙门氏菌产生17种耐药谱，47株沙门氏菌共有39株产生不同程度的耐药性，其中17株耐1种抗生素，14株耐2种抗生素，8株
耐3种及3种以上的抗生素，更有耐5种抗生素的菌。

沙门氏菌耐药最多的抗生
素(组合)是AML和AML-TET。

3.1 大熊猫粪样中真菌分离鉴定研究相对较少
64份粪样分离到19株真菌，鉴定为8个属，分别是节菱孢属、竹黄属、座囊菌属、单格孢属、耙齿菌属、裂褶属、子囊菌属和枝孢菌属，而周杰珑等(2012)春
季对云南大熊猫园中大熊猫分离鉴定有青霉属、木霉属、曲霉属、链格孢属、红酵母菌属和德克酵母属，这和本实验分离的真菌部分不同，可能与采集、季节和地域不同有关。

实验中圈养大熊猫所喂食的竹类有冷箭竹、拐棍竹、方竹、水竹以及苦竹。

这些竹类上的真菌主要有竹黄、枝孢菌、瘤座菌、锈菌、黑粉菌、黑痣菌、廉孢菌，这些真菌都是竹类病害菌(徐梅卿等，2006)。

实验中也分析到部分以上真菌，且这些有害真菌都会引起竹类相关病害。

竹黄是竹团子病病原菌，枝孢菌主要引起叶枯病和叶霉病，座孢菌也被确定引起毛竹丛枝病(薛振楠等，2007)，节菱
孢霉属最多，它是一类产毒霉菌，产生的非蛋白毒素能使杂交竹机体组织完全破坏(李姝江等，2011)，因此可能对大熊猫所食竹类产生危害。

在流行病学的调查中，枝孢属、链格孢属、青霉属、曲霉属都是常见的潜在真菌过敏原，与哮喘病、过敏性鼻炎、皮肤感染等疾病的发生密切相关(胡利锋，2005；陈怡平等，2008)。

这
些真菌引起的病害，可通过肉眼对竹病状的观察进行辨别，因此喂食大熊猫的竹子选择时应慎重，同时加强人工竹类栽培基地真菌病害的防治。

3.2 大熊猫粪样大肠杆菌及沙门氏菌耐药性及多重耐药情况
用Kirby-Bauer法对大肠杆菌、沙门氏菌进行药敏实验，结果显示两种细菌对18种抗生素产生了不同程度的耐药性。

对两种细菌耐药性都较高的抗生素为四环素、
阿莫西林/克拉维酸、阿莫西林，但头孢曲松、头孢他啶、亚胺培南、美罗配能、
环丙沙星对大肠杆菌和沙门氏菌的耐药率都为零，药物敏感性极高。

大肠杆菌和沙门氏菌对青霉素及其抑制剂类和四环素类抗生素都有较高的耐药率，不建议使用此类药物。

诊断大熊猫感染大肠杆菌和沙门氏菌疾病时，建议使用磺胺类、头孢类及氟喹诺酮类药物添加到大熊猫日粮中，可有效控制病情。

实验中两种细菌都出现了多重耐药的情况。

Zhang等(2009)用14种抗生素对30只大熊猫粪样分离出的
59株菌进行药敏实验，结果显示32.20%菌株至少对1种抗生素产生耐药，16.95%菌株耐3种及3种以上的抗生素，耐药最多的抗生素是链霉素，其次是氯霉素和
四环素。

张安云等(2006)对83株肠道分离细菌氨基糖苷类药物进行药敏试验结果表明，共有33株对1种药物耐药，也出现两重及三重耐药情况。

王彩先等(2012)对62株鸡源大肠杆菌进行27种抗生素耐药性实验结果显示所有菌株均有不同程
度耐药，并且大多数为多重耐药，所有耐药菌株均对6种或6种以上抗生素耐药。

其他研究也表明大肠杆菌和沙门氏菌的耐药率虽然不高，但多重耐药已经是普遍现象(李蓓等，2012；邹立扣等，2012)，应引起管理饲养人员的高度重视。

通过本研究积累了相关数据及资料，饲养人员应当对大熊猫生长环境进行严格控制，对大熊猫主食竹类生长环境中的真菌种类的鉴定非常有必要，以免引起大熊猫因食用含有害真菌的竹子而引起疾病。

由于细菌耐药基因整合子通过质粒转座子或整合噬菌体在同种菌或不同种菌之间水平传播耐药性。

但在没有抗生素压力的自然环境中，整合子的发生率很低，并且一半以上的整合子不携带抗生素耐药基因盒(单霞，黄茂，2010)。

应减少不必要的用药，避免产生不必要的抗生素压力，并通过药敏试验选择性地用药，加强对细菌耐药性监测，对提高大熊猫存活率及肠道疾病提供科学指导。

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*通讯作者Corresponding author，博士，教授，E-mail:****************。