绒山羊AMELY-I4基因的筛选与克隆

5 结论
（1）绒山羊AMELY-i4的PCR筛选优化体系为：上游引 绒山羊AMELY-i4的PCR筛选优化体系为： AMELY 筛选优化体系为 2µl； 物1.1µl，下游引物2.2µl；10×buffer 2µl； 1.1µl，下游引物2.2µl；10× 2.2µl 2.1µl； DNA聚合酶0.2µl。 聚合酶0.2µl dNTP 2.1µl；Taq DNA聚合酶0.2µl。 （2）测序后得到的绒山羊AMELY-i4基因序列长259bp。 测序后得到的绒山羊AMELY-i4基因序列长259bp。 AMELY 基因序列长259bp （3）AMELY-i4序列中AT和GC含量分别为61.3%和 AMELY-i4序列中AT和GC含量分别为61.3%和 序列中AT 含量分别为61.3% 38.3%，是一段富含AT的基因序列。 38.3%，是一段富含AT的基因序列。 AT的基因序列 （4）绒山羊AMELY-i4在绵羊和牛的某些基因区域上 绒山羊AMELY-i4在绵羊和牛的某些基因区域上 AMELY 的覆盖率为100%，而与人、黑猩猩、 的覆盖率为100%，而与人、黑猩猩、老鼠牙釉蛋 100% 白基因的同源性非常低，可以看出，绒山羊AMELY 白基因的同源性非常低，可以看出，绒山羊AMELY 基因在不同物种间的保守性很低，并且相对复杂。 基因在不同物种间的保守性很低，并且相对复杂。
致
谢
我要非常感谢我的指导老师肖红梅老师， 我要非常感谢我的指导老师肖红梅老师， 以及其他关心、 以及其他关心、帮助和支持过我的老师和同学 们！
பைடு நூலகம்
2 实验方法
优化体系① 优化体系① 筛选出含有AMELY筛选出含有AMELY-i4 AMELY 基因的超级池
以NCBIsAMELY-i4已知序列设计引物 NCBIsAMELY-i4已知序列设计引物 绒山羊基因组DNA为模板 绒山羊基因组DNA为模板 DNA 体系① 体系① PCR扩增 PCR扩增 体系① 体系① PCR扩增 PCR扩增 超级池DNA为模板 超级池DNA为模板 DNA
3.3 二级池 二级池PCR 筛选
取稀释后二级池DNA 4µl做PCR模板 模板， 取稀释后二级池DNA 4µl做PCR模板，扩 增二级池，结果如图： 增二级池，结果如图：
300bp
→
300bp
→
得到定位结果为： 得到定位结果为 阳性克隆的行池P 阳性克隆的行池P、4列池3、6列池2、板池2。定位于 列池3 列池2 板池2 562P07这个阳性克隆 这个阳性克隆。 562P07这个阳性克隆。
1000bp
→ →
300bp
所得到的菌体PCR 产物条带很清晰， 所得到的菌体PCR 产物条带很清晰，且与目的条带 大小一致，可鉴定出获得的单克隆为阳性。 大小一致，可鉴定出获得的单克隆为阳性。
3.5 切胶回收及鉴定重组质粒
将菌体PCR产物纯化，切胶回收， 将菌体PCR产物纯化，切胶回收，将回 PCR产物纯化 收的PCR产物进行连接，转化， 收的PCR产物进行连接，转化，挑菌做菌体 PCR产物进行连接 PCR鉴定阳性克隆， PCR鉴定阳性克隆，结果如图 ： 鉴定阳性克隆
二级池的筛选
对应二级池DNA为模板 对应二级池DNA为模板 DNA
阳性单筛选结果在BAC中定位） 进行阳性克隆的鉴定 克隆测序
（切胶回收、连接、转化、菌体 切胶回收、连接、转化、 PCR鉴定重组质粒、测序） PCR鉴定重组质粒、测序） 鉴定重组质粒
3.4 菌体PC到562P07阳性克隆，在 562P07阳性克隆 LB培养基中37℃恒温培养24小时， LB培养基中37℃恒温培养24小时，之后 培养基中37℃恒温培养24小时 做菌体PCR鉴定， 做菌体PCR鉴定，结果如图 : PCR鉴定
绒山羊AMELY-i4基因的筛选和克隆 绒山羊AMELY-i4基因的筛选和克隆
答 辩 人: 导 师: 级:07级生物技术（3）班 :07级生物技术（ 班 级生物技术
主要内容
1 2 3 4 5
研究的目的与意义 实验方法 实验结果 讨论 结论
1 研究的目的与意义
绒山羊是内蒙古重要的肉、 绒山羊是内蒙古重要的肉、绒畜牧资 源，牙齿在其生命活动和经济活动中起着 重要作用， 重要作用，而AMELY-i4基因在绒山羊牙 基因在绒山羊牙 齿发育过程中起着重要的调控作用， 齿发育过程中起着重要的调控作用，所以 对绒山羊AMELY -i4基因的筛选与克隆， 基因的筛选与克隆， 对绒山羊 基因的筛选与克隆 为绒山羊牙齿保护和后续研究绒山羊牙齿 的进化过程、 的进化过程、促进绒山羊产业的发展奠定 基础。 基础。
内蒙古农业大学07级生物技术（3） 徐梦璐
4 讨论
（1）实验中所用到的正交拉丁法对PCR反应体系 实验中所用到的正交拉丁法对PCR反应体系 PCR 中多因素进行筛选， 中多因素进行筛选，可以较快的得到最优水平 组合，从而避免摸体系所消耗的时间和精力。 组合，从而避免摸体系所消耗的时间和精力。 （2）进行PCR扩增时，会出现弥散带：可能是由 进行PCR扩增时，会出现弥散带： PCR扩增时 于酶量过多或酶放置时间过长，dNTP浓度过高， 于酶量过多或酶放置时间过长，dNTP浓度过高， 浓度过高 退火温度过低，循环次数过多引起， 退火温度过低，循环次数过多引起，应做适当 的调整 （3）在平板上划菌时，画平行线或Z字型线，应尽 在平板上划菌时，画平行线或Z字型线， 量划线均匀，避免细菌杂乱无章长成一片， 量划线均匀，避免细菌杂乱无章长成一片，否 则做菌体PCR时得不到目的基因的单克隆产物。 则做菌体PCR时得不到目的基因的单克隆产物。 PCR时得不到目的基因的单克隆产物
3.2 超级池筛选
以稀释10倍的超级池 以稀释 倍的超级池DNA为模板 倍的超级池 为模板 54℃扩增,结果如图： ℃扩增 结果如图 结果如图：
1000bp
→
扩增得到阳性的超级池4 分别为S23 S29、 S23、 PCR 扩增得到阳性的超级池4个，分别为S23、S29、 S34和S36。PCR扩增条带与雌性对照条带大小不同， S34和S36。PCR扩增条带与雌性对照条带大小不同，说明 扩增条带与雌性对照条带大小不同 所扩增出的片段存在于Y染色体上。 所扩增出的片段存在于Y染色体上。
1000bp
← 1000bp ← 400bp
→ →
400bp
图1 切胶回收
图2 鉴定重组质粒
3.6 克隆测序
GCTCAACTTTTGTGTCTTCTCATGTCTAGAAA AACACTAATTTCCTTCATGTGACATCTGTTCC ACATGACTAGAATTCATGCACTCCCCCTTCC CTAAAATCAAATATATATATATATATATGAC CTCTACCTTGCCTCTTTGGAGCAGTTTCTGGA ACTACCTGTGGCTGTCTCTTGGACTGCAGTCC TCACCTTGTTCCAAATAAAACTTAATTCATA ACTTAGGTTGTGCATTTGTTTTCCAGTCAATG CTTTGC 绒山羊AMELY-i4基因克隆测序后得到的序列长度为259bp， 绒山羊AMELY-i4基因克隆测序后得到的序列长度为259bp， AMELY 基因克隆测序后得到的序列长度为259bp 序列中AT和GC含量分别为61.3%和38.3%，AT%的含量相对较高。 序列中AT和GC含量分别为61.3%和38.3%，AT%的含量相对较高。 AT 含量分别为61.3% 的含量相对较高
3 实验结果 3.1 优化体系
以稀释10倍的绒山羊基因组为模板做 以稀释10倍的绒山羊基因组为模板做 10 53-56℃正交拉丁PCR, 扩增结果如图: 53-56℃正交拉丁PCR, 扩增结果如图: 正交拉丁
500bp
→ 300bp →
确定的20µl PCR体系为 上游引物（10pmol/µl）1.1µl， 体系为： 确定的20µl PCR体系为：上游引物（10pmol/µl）1.1µl， 下游引物（10pmol/µl）2.2µl；10× 2µl； 下游引物（10pmol/µl）2.2µl；10×buffer 2µl；dNTP 2.1µl； DNA聚合酶0.2µl。 聚合酶0.2µl 2.1µl；Taq DNA聚合酶0.2µl。