地中海贫血基因检测-PCR扩增——【分子诊断学】

Free nucleotides
Taq DNA polymerase
Mg2+ Mg2+ Buffer Mg2+Mg2+ containing Mg2M+ g2+ magnesium
PCR原理:实质就是体外基因复制技术
.
靶序列
Mg2+
dCTP dGTP dUTP dATP
Primer
Taq DNA聚合酶 AmpErase
点，通过变性、退火、延伸等步骤，体外复制出与母链模板DNA 互补的子链DNA的过程。Fra bibliotekPCR
94
温
度 72
（℃）
55
22
1
2
3
高温变性 低温退火 适温延伸
DNA 2
形 成
条变
单性
链
DNA单链
与引物复性
子链延伸 DNA加倍
DNA双螺旋
1
2
3
4
时间（min）
重复1~3步 25~30轮 目的DNA片段 扩增100万倍以上
操作步骤
•1 取出冻存的DNA解冻 •2 试剂准备 • 取所需的反应管PCR Mix-A,若管盖上 有液体附着的 请低速离心数秒 •3、加样 • 在反应管上做好标记，分别加2-4ul 已提取的待测样品、阴性质控、阳性质 控，终反应体积为25ul，低速离心数秒。 转移至扩增区
质量控制
•1 阴性质控（ 灭菌双蒸水 ） •2 阳性质控（缺失型/突变型） • 随病人标本检测,不同缺失/突变类 型可以依次轮流循环作为质控检测
• 3、加样过程中注意防止污染样品及试剂。 • 4、置PCR仪进行PCR反应前，PCR管要盖
紧，否则使液体蒸发影响PCR反应。
思考
•1、试述PCR技术的基本原理。 •2 、问：在Gap-PCR中为什么α正常 DNA序列不能生成相应的扩增产物而 缺失序列可以扩增出特定长度的片段。
本节内容结束
5
动画演示
α-地贫实验原理（四重Gap-PCR）
• 根据α-地贫3种缺失范围及断裂点，分别设计 特异引物同时检测，在3种缺失片段的共同区 域还设计一对正常内对照引物，当发生任一 种缺失纯合子或双重杂合子该正常对照不扩 增;根据阳性扩增片段组合结果诊断各种不同 基因型。
•
α-地贫基因缺失示意图
正常内对照
65℃ 45sec
72℃ 3 min
72℃ 10 min
PCR扩增 （β-地中海贫血）
• 用生物素标记的引物扩增待测样品DNA
•
PCR-Mix-I（紫色管）23μL
•
DNA模板
2μL
•
Total
25μL
• 50℃
15min
• 95℃
10min
• 94℃
1 min
• 50℃
30s
35 cycles
• 72℃
PCR 常见问题之一
假阳性
现象：空白对照出现目的扩增产物
M+- 1 2
PCR 常见问题之二
无扩增产物
现象：正对照有条带，而样品则无；
M 样品 样品 正对照
注意事项
• 1、在运输过程中会有PCR反应液附着在 管壁/盖上，因此请在使用前先离心，以 保证PCR反应体系的体积及防止潜在的污 染。
• 2、PCR反应的加样量多数是微量的，所 以加样时应把枪头伸进液面下加样，并 注意确保试剂确实加进去了！
ζ
ψζ
ψα2
ψα1
α2
α1
1
a3.7
a4.2
--SEA
β-地贫 PCR实验原理
• 设计特异的PCR引物且其5‘端用生物素进行 标记，扩增获得一定长度的DNA片段，该片 段包含了所要检测的各个位点。 •
What’s in the PCR Tube
5’
3’
Target DNA
3’
5’
A B
primers
靶序列引物退火55 °C 加热变性95 °C
引物延伸72 °C
操作步骤
• PCR扩增 （α-地中海贫血）
PCR-Mix-I （蓝色管） 21μL
DNA模板
4μL
Total
25μL
96℃ 5 min
98℃ 45sec 65℃ 90sec
（10cycles）
72℃ 3 min 98℃ 30sec
（25cycles）
30s
试剂
试剂盒组成： （1）PCR反应液
（已包含PCR扩增所需的缓冲液、引物、 dNTPs、 DNA聚合酶等） （2）纯水
仪器设备
•离心机 •加样枪 •PCR扩增仪（使用介绍） •1、PCR扩增循环条件的设置(PCR仪请 使用热盖)：若用没有热盖的PCR扩增 仪，则需在反应体系中加入液体石蜡 等矿物油封闭体系以防止反应过程中 液体的蒸发。
中海贫血基因检测
PCR扩增DNA
实验目的
•1、掌握PCR的原理 •2、熟悉PCR操作过程 •3、了解PCR的临床应用
实验原理
• PCR（Polymerase Chain Reaction）：聚合酶链式反应， • PCR过程类似于DNA的天然复制过程，包括DNA双链解开，引物配
对，合成三步； • 在DNA聚合酶催化下，以母链DNA为模板，以特定引物为延伸起