生地对高糖致人肾小球系膜细胞增殖、氧化应激及细胞外基质的影响

生地对高糖致人肾小球系膜细胞增殖、氧化应激及细胞外基质
的影响
吕高虹;许惠琴;吕兴
【摘要】目的：观察生地含药血清对高糖刺激下人肾小球系膜细胞（HRMC）的作用。

方法制备生地含药血清，通过 LC-MS检测技术，鉴别入血成分；MTT 法检测 HRMC 增值抑制率；试剂盒检测细胞上清中 SOD、MDA 的含量变化；ELISA 法检测HRMC 中纤维连接蛋白（FN）、Ⅳ型胶原（ColⅣ）；流式法检测细胞周期分布；免疫荧光检测 HRMC 中 TGF-β1的表达。

结果生地含药血清中含有水苏糖、梓醇，含药血清中效应成分可抑制高糖诱导的 HRMC 增殖，减少细胞外基质（ECM）的增生，下调 TGF-β1的 mRNA 表达。

结论生地可能通过调节TGF-β1的表达来抑制 ECM 的分泌从而改善糖尿病肾病的发生发
展。

%OBJECTIVE To investigate the effects of Rehmanniae-medicated serum on human glomerular mesangial cells (HRMC)stimulated with high concentration of glucose.METHODS Rehmanniae-medicated serum was prepared and analyzed for its serum components using LC-MS technology.MTT assay was used to detect the inhibitory rate of HRMC.Cell superna-tant levels of SOD and MDA were measured by kits.ELISA assays were used to determine the contents of fibronectin and type IV collagen.Flow cytometry was used to analyze cell cycle
distributions.Immunofluorescence was used to detect the expres-sion of TGF-β1 in HRMC.RESULTS Rehmanniae-medicated serum contains catalpa alcohol and stachyose.These active com-ponents could inhibit high level glucose-induced HRMC proliferation,reduced the production of
extracellular matrix,and downregulated the mRNA expression of TGF-
β1 .CONCLUSION Rehmanniae could inhib it ECM production by regulating TGF-β1 so as to prevent the development of diabetic nephropathy.
【期刊名称】《南京中医药大学学报》
【年(卷),期】2015(000)006
【总页数】4页(P551-554)
【关键词】生地;含药血清;HRMC;ECM;TGF-β1
【作者】吕高虹;许惠琴;吕兴
【作者单位】南京中医药大学教学实验中心，江苏南京 210023;南京中医药大学
教学实验中心，江苏南京 210023;南京中医药大学教学实验中心，江苏南京210023
【正文语种】中文
【中图分类】R285.5
人肾小球系膜细胞（HRMC）是肾小球内的固有细胞，也是糖尿病肾病（DN）致病因子的主要靶细胞［1］。

糖尿病时异常增高的血糖，可通过多种途径刺激系膜细胞诱发氧化应激，导致HRMC的过度增殖，进一步促进细胞外基质成分纤维连接蛋白（FN）、Ⅳ型胶原等过量生成和聚积，最终致肾小球病理性改变［2－3］，因此，研究高糖状态下HRMC的机能变化对阐明DN发病机理具有重要意义。

现代医学研究发现，生地具有促进血管内皮细胞增殖，减轻DN中肾小球细胞外
基质增生等药理作用［4］。

本研究以高糖为刺激物，HRMC为实验对象，从细胞增殖及细胞外基质（ECM）和TGF-β1的表达来探讨生地含药血清对DN的干预
机制并为后期生地有效成分的筛选和确立提供理论依据。

1．1 细胞株与动物
人肾小球系膜细胞（HRMC）购自Sciencell。

清洁级雄性SD大鼠，上海斯莱克
实验动物有限公司提供，SCXK（沪）2007-0005。

1．2 实验药物与试剂
生地由河南宛西制药有限公司提供。

生地粉碎后过40目筛，进行3次提取，合并各提取液，浓缩至1．5g／mL。

MEM培养基（南京凯基生物有限公司）；胎牛
血清（杭州四季青公司）；D-葡萄糖（美国Sigma公司）；0．25%Trypsin-EDTA（美国Gibco公司）。

1．3 仪器
Direct－Q型超纯水仪，MILLIPORE公司；Synekgy HT型酶联免疫检测仪，
BIO－Tek公司；超高效液相色谱，Waters公司。

1．4 动物
雄性SD大鼠，体质量200～220g，清洁级；由上海斯莱克实验动物有限公司提供，动物质量合格证：SCXK（沪）2007－0005。

2．1 含药血清的制备
取健康雄性大鼠8只，适应性喂养1周，随机分为空白对照组、生地组，每组4只。

各组大鼠按15 g／kg灌胃给予相应的药液或生理盐水，连续给药3 d。

于末次给药1h后，用10%水合氯醛腹腔注射麻醉，颈动脉取血，静置1h后分离血清，4℃离心（3 000r／min，10min），取上层血清，56℃水浴30min灭活补体，0．22μm微孔滤膜过滤除菌并分装，置－20℃保存备用。

2．2 血清样品的处理
取200μL血清，用6倍色谱纯甲醇醇沉，涡旋，离心，吸取上清液氮气流吹干，
以200μL色谱醇甲醇复溶，离心，取上清液，制得空白血清样品及含药血清样品。

采用UPLC－ESI－MS联用技术，通过空白血清样品和给药血清样品的比较，找
出差异性色谱峰，再结合对照品及质谱规律分析，以确定入血成分。

2．3 实验分组及给药方案
2．3．1 空白血清对HRMC的增殖作用将细胞液配制成浓度为5×104mL－1的细胞悬液，接种于96孔细胞培养板中每孔200μL。

实验分组：①空白组：低糖MEM培养基；②血清组：空白大鼠血清（终浓度分别为0．625%、1．25%、2．5%、5%、10%），置于37℃，5%CO2培养箱中培养48h，MTT法于
490nm处测定OD值。

2．3．2 生地含药血清对高糖损伤HRMC的保护作用将细胞分为5组：①空白
组（葡萄糖5．5mmol／L＋10%空白血清）；②模型组（葡萄糖30mmol／L＋10%空白血清）；③0．625%含药血清组；④1．25%含药血清组；⑤2．5%含
药血清组。

③④⑤组加入生地含药血清，终浓度分别为0．625%、1．25%、2．5%，另以空白血清将血清终浓度补充为10%，各组细胞终体积为200μL，然后置于37℃，5%CO2培养箱中继续培养48h；用MTT法于490nm处测定OD 值。

2．4 细胞周期测定
将对数生长期的HRMC消化接种到6孔板中，根据组别不同加入相应的含药血清，流式细胞仪分析HRMC在各细胞周期所占比例。

2．5 纤维连接蛋白（FN）、ColⅣ胶原、SOD及MDA测定
分组、造模及给药方法同前，加入含药血清48h后按说明书要求，使用酶标仪在450nm下读取OD值。

2．6 TGF－β1mRNA表达情况
引物序列及PCR产物大小：Homo－TGF－β1 primer（137bp），正义引物：5＇－AAGGACCTCGGCTGGAAGTG－3＇；反义引物：5＇－
CCCGGGTTATGCTGGTTGTA－3＇。

由融解曲线判断PCR反应的特异性。

用2－△△CT方法进行相对定量分析。

2．7 统计学处理
数据以表示，数据采用SPSS17．0软件进行统计处理，组间比较方差齐性采用t 检验，方差不齐者采用非参数检验。

3．1 生地含药血清成分鉴定
通过色谱质谱图比较，结合对照品对照，提取的m／z665及m／z361的保留时间tR分别为0．78min和0．87min，与对照品溶液保留时间一致，且相对分子质量也符合，故可知生地水煎液血清中含有水苏糖及梓醇（见图1）。

3．2 空白大鼠血清对低糖环境下HRMC的影响
实验结果显示：浓度为0．625%、1．25%、2．5%的血清对HRMC的作用与空白组相比无差异，随着血清浓度的增加，高浓度组血清对HRMC产生了一定的促进作用（P＜0．01）。

在最终含药血清浓度的选择上，本实验选择了0．625%、1．25%、2．5%3个浓度的含药血清来研究药物对细胞的作用。

见表1。

3．3 生地含药血清对高糖环境下HRMC的作用
实验结果显示：模型组HRMC出现异常增殖，与空白组比较差异显著（P＜0．01）；药物组在48h内对高糖损伤下HRMC呈现不同程度的抑制作用，并且随着含药血清浓度的增加，其对HRMC的抑制作用也增强，具有浓度依赖关系（P＜0．05）。

见表2。

3．4 生地含药血清对高糖刺激HRMC细胞周期的影响
高糖可使HRMC的细胞周期发生改变，其中G0／G1期含量减少，S期、G2／M 期明显增加，与空白组比较差异显著（P＜0．05～0．01），表明高糖可以促进细胞增殖。

与模型组相比，给予生地后发现，各组G0／G1期细胞含量均较模型组增多且随着浓度的增加而增大，S期及G2／M期的HRMC含量随之降低，且
呈浓度依赖性，表明生地能改善高糖导致的HRMC周期异常，生地抑制HRMC
增殖的作用主要是通过细胞周期阻滞作用来实现的。

见表3。

3．5 生地含药血清对高糖刺激HRMC分泌SOD、MDA水平的影响
与模型组相比，高糖损伤HRMC分泌的SOD含量显著低于空白组（P＜0．05），生地各浓度含药血清对高糖损伤HRMC的SOD活性均有一定的增强作用，其中2．5%含药血清增加最为明显（P＜0．01）。

与空白组相比，在予以高糖刺激
48h后，HRMC培养上清液中MDA显著增多（P＜0．01）；生地各组均能显著降低高糖升高的MDA水平，随着浓度的升高，呈逐渐下降趋势（P＜0．01）。

见表4。

3．6 生地含药血清对高糖刺激HRMC分泌FN、ColⅣ水平的影响
30mmol／L高糖培养系膜细胞48h后，细胞中FN、ColⅣ水平明显升高（P＜0．01），与模型组相比，1．25%和2．50%含药血清均能显著降低高糖刺激后
的FN含量（P＜0．01）；随着药物浓度的升高，ColⅣ水平呈逐渐下降趋势（P
＜0．01）。

见表5。

3．7 生地含药血清对高糖刺激下TGF-β1mRNA表达的影响
TGF-β1的动态变化可调节ECM及其相关物质的集聚，高糖刺激48h后，模型组TGF-β1mRNA水平明显升高（P＜0．01），生地含药血清（0．625%、1．25%和2．50%）干预后可以明显减低高糖引起的TGF-β1的增高。

见表6。

HRMC是肾小球的3种固有细胞之一，有合成和分泌细胞外基质及细胞因子、吞
噬并清除大分子物质等功能。

在DN的发生发展过程中，高糖是引起肾脏病理改变的启动因素，高糖可促进HRMC增殖，促使HRMC过度分泌和释放大量的细胞因子，加速ECM成分合成，同时引起氧化应激反应。

ECM构成了肾小球内独特的微环境，对肾小球的功能起
到了重要的作用。

ECM积聚可引起肾小球硬化和间质纤维化，其主要组成成分为
层粘连蛋白（LN）、纤维连接蛋白（FN）、Ⅳ型胶原（ColⅣ）等。

SOD是体内氧自由基清除主要活性酶之一，具有特殊的生理活性，可有效清除有
害自由基，终止自由基的连锁反应，阻止氧化应激反应的发生，从而保护细胞不受损伤［5］。

而在受到氧化应激刺激后，自由基的积累，产生大量脂质过氧化产物，例如丙二醛（MDA）。

MDA易与含游离碱基的蛋白质发生交联，生成scKiff碱
基产物，造成肾组织中细胞膜的损坏。

因此通过检测SOD活性和MDA的含量，可以间接反映机体细胞受损的严重程度。

从本实验结果可以看出，加入生地含药血清保护后，SOD活力上升明显，MDA含量也有明显的下降。

从而可以判断生地
有较好的清除氧自由基，保护细胞膜的作用。

转化生长因子（TGF-β1）被认为是DN肾小球硬化前期的重要细胞因子，TGF-
β1作为糖尿病肾病中多种致病因素的最终途径，它通过受体信号传递发挥多种生
物效应。

一方面，它能抑制肾小球多种固有细胞的增殖分化，诱导细胞肥大。

另一方面，它能刺激FN、ColⅣ、LN的合成增加，同时又抑制合成降解ECM所需的
蛋白酶抑制剂和纤溶酶原活化剂，造成ECM在肾脏的沉积［6］。

是研究DN病
理变化的重要指征。

在本实验中生地含药血清可以抑制HRMC过度增殖，使HRMC的细胞周期阻滞
于G0／G1期；通过干预HRMC的ECM增生，下调高糖刺激TGF-β1的mRNA 的表达，从而阻止DN的发生发展。

【相关文献】
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