血清淀粉样蛋白a、c反应蛋白荧光免疫层析联合检测方法的建立

doi:10.3969/j.issn.1000⁃484X.2020.02.013
㊃免疫学技术与方法㊃
血清淀粉样蛋白A ㊁C 反应蛋白荧光免疫层析联合检测方法的建立①
贺　沁　周春峰②　王云龙　明　亮　李玉林③　曹继宗③(郑州大学第一附属医院检验科,郑州450052)
中图分类号　R446.61 文献标志码　A 文章编号　1000⁃484X (2020)02⁃0198⁃05
①本文为河南省科技攻关资助项目(No.182102310685)㊂②河南省医药设计院有限公司,郑州450000㊂③河南省生物工程技术研究中心,郑州450000㊂
作者简介:贺　沁,女,硕士,主要从事免疫与分子诊断技术方面的
研究㊂
通讯作者及指导教师:王云龙,男,硕士,教授,博士生导师,主要从
事免疫与分子诊断技术方面研究,同时就职于河南省生物工程技术研究中心,郑州450000,E⁃mail:biowyl@㊂
[摘　要]　目的:建立一种可同时定量检测人血清中SAA㊁CRP 含量的荧光免疫层析方法㊂方法:采用双抗体夹心原理制备SAA㊁CRP 联合检测荧光免疫层析试纸条,对标记㊁包被抗体量进行研究后,对试纸条线性范围㊁精密性㊁交叉反应等性能指标进行评价㊂结果:最终确定SAA㊁CRP 标记量均为20μg,包被浓度分别为2mg /ml㊁1.5mg /ml,SAA㊁CRP 线性范围为
0.78~200μg /ml;批内精密性与批间精密性均小于15%,平均回收率分别为101.7%和103.5%;且SAA 和CRP 两种抗原进行联合检测时无交叉反应,与西门子BN ProSpec ®特定蛋白分析系统上平行检测80份临床血清其相关性良好㊂结论:初步建立了联合定量检测SAA㊁CRP 的荧光免疫层析方法,为感染性疾病的早期筛查提供一种新的检测手段㊂
[关键词]　血清淀粉样蛋白A;C 反应蛋白;荧光免疫层析法;联合检测
Establishment of a combined detection method for serum amyloid A and C⁃reactive fluorescence immunochromatography
HE Qin ,ZHOU Chun⁃Feng ,WANG Yun⁃Long ,MING Liang ,LI Yu⁃Lin ,CAO Ji⁃Zong .Department of Clinical Laboratory ,The First Affiliated Hospital of Zhengzhou University ,Zhengzhou 450052,China
[Abstract ]　Objective :To establish a method for the simultaneous quantitative detection of SAA and CRP in human serum by
fluorescence immunochromatography.Methods :The principle of double antibody sandwich was used to prepare SAA and CRP combined detection fluorescent immunochromatographic test strips to detecting of SAA and CRP.Results :The final determination of SAA and CRP was 20μg,and the coating concentrations were 2mg /ml and 1.5mg /ml,respectively.The linear range of SAA and CRP was 0.78-200μg /ml.The internal and inter⁃assay CV were less than 15%,and the average recovery rates were 101.7%and 103.5%,respectively.And there was no cross⁃reaction between the two antigens of SAA and CRP.The correlation was well correlated with the detection of 80clinical sera in parallel with the Siemens BN ProSpec ®specific protein analysis system.Conclusion :A
fluorescent immunochromatographic method for the combined detection of SAA and CRP is established,which provides a new detection method for early screening of infectious diseases.
[Key words ]　Serum amyloid A;C⁃reactive protein;Fluorescence immunochromatography;Joint detection
感染性疾病是威胁人类健康的重要病因之一,临床常以C 反应蛋白(C⁃reaction protein,CRP)和血清淀粉样蛋白A(serum amyloid A,SAA)作为早期诊断
感染性疾病的检测指标㊂CRP 和SAA 是反映早期炎症的敏感指标,当机体发生细菌感染时,二者含量显著升高;而在病毒感染早期,SAA 显著升高,CRP 不升高或仅小幅升高[1,2]㊂因此,SAA 与CRP 联合检测有利于早期鉴别细菌或病毒感染,为临床用药提供参考[3,4]㊂目前,临床上针对SAA㊁CRP 检测主要是化学发光和免疫比浊法,这些方法主要适用于拥有相对完善检验设备的大中型医院,不适用基层或社区医疗机构床旁快速检测,限制了其临床应用㊂
本研究旨在利用荧光免疫层析技术建立一种可同时联合定量检测血清中CRP㊁SAA 的检测方法,既满足社区基层医院常规检测的需求,又可提高鉴
别细菌㊁病毒感染的准确度,节省检测时间,指导患者合理用药,为感染性疾病的早期筛查提供了一种便捷㊁准确的检测方法㊂
1　材料与方法
1.1　材料　Eu 3+羧基荧光微球购自上海微测生物科技有限公司;鼠抗兔IgG 单克隆抗体㊁CRP 配对单克隆抗体㊁SAA 配对单克隆抗体㊁硝酸纤维素膜㊁PVC 板㊁玻璃纤维素膜㊁吸水纸㊁CRP㊁SAA 线性质控品,精密性质控品均由河南省生物工程技术研究中心提供㊂N,N′⁃二环己基碳二亚胺(EDC)和N⁃羟基琥珀酰亚胺(NHS)购自南京化学试剂股份有限公司㊂三维点膜喷金仪㊁自动斩切机购自上海金标生物;荧光定量分析仪购自杭州峰航科技有限公司;NanoDrop 微量紫外分析仪购自Thermo㊂
1.2　方法1.
2.1
试纸条的制备　参照文献[5,6],采用
EDC⁃NHS 两步法活化荧光微球,取5μl 荧光微球加入500μl 0.05mol /L 硼酸缓冲液(pH8.0)漩涡振荡混匀后,加入50μl EDC 溶液(1mg /ml)和50μl NHS 溶液(1mg /ml)作为活化剂混匀后,振荡活化
30min;15000r /min 离心20min,弃上清;加入800μl
0.05mol /L 硼酸缓冲液(pH8.0)复溶沉淀后,再加入20μg 抗SAA Ⅰ抗体,室温下振荡偶联2h;
15000r /min 离心20min,弃上清;加入1ml 微球保护液复溶沉淀后,加入10μl 1%BSA 溶液振荡封闭
1h,置于4℃保存备用㊂荧光微球标记抗CRP Ⅰ抗体:加入20μg 抗CRP Ⅰ抗体,其余步骤同荧光微球标记抗SAA Ⅰ抗体㊂荧光微球标记兔IgG 多克隆抗体:加入10μg 兔IgG 多克隆抗体,其余步骤同荧光微球标记SAA Ⅰ抗体㊂将3种免疫微球按照体积比1∶1∶1混匀后,按照5μl /cm 喷涂到微球结合垫上制备成微球垫,37℃干燥2h㊂采用三维平面点膜喷金仪,按1μl /cm 将2mg /ml 鼠抗兔IgG 单克隆抗体㊁1.5mg /ml 抗SAA Ⅱ单克隆包被抗体
㊁图1　SAA 、CRP 二联荧光免疫层析试纸条结构示意图Fig.1　Schematic diagram of combined detection of SAA
and CRP fluorescence immunochromatographic test strips
1.5mg /ml 抗CRPⅡ单克隆包被抗体包被于NC 膜上分别作为T1线㊁T2和C 线,37℃干燥2h㊂按试纸条组装方式,组装好后用切条机切成3.9mm 宽的试纸条如图1,装于带有干燥剂的铝箔袋中密封,置于2~8℃保存备用㊂
1.2.2　试纸条的检测　采用样品稀释液(pH7.80.02mol /L Tris⁃HCl㊁0.9%NaCl㊁0.1%BSA㊁0.5%T⁃20,0.1%NaN 3)将血清稀释100倍后,取70μl 样品加样,5min 后于荧光定量分析仪中检测,分析软件自动计算出待测样本中的SAA㊁CRP 浓度㊂1.2.3　最佳标记蛋白量与包被蛋白量的确定　采用二因素多水平实验确定最佳SAA㊁CRP 标记包被抗体的量,设计5μl 荧光微球,兔IgG 标记量为10μg,鼠抗兔IgG 单克隆抗体包被量为2.0mg /ml,SAA㊁CRP 标记抗体梯度为10㊁20㊁40μg,包被抗体浓度梯度为1.0㊁1.5㊁2.0mg /ml㊂按照1.2.2的方法制备试纸条,用线性参考品检测试纸条的线性范围与R 2㊂
1.2.4　分析性能评价1.2.4.1　标准曲线的建立　取SAA㊁CRP 线性标准品浓度依次为0.78㊁1.56㊁3.125㊁6.25㊁12.5㊁25㊁50㊁100㊁150㊁200μg /ml,分别吸取70μl CRP,SAA 线性标准品滴至加样孔中,5min 后置于荧光定量分析仪检测,重复检测3次,并以T /C 均值的对数为纵坐标,以相应浓度的对数值为横坐标绘制标准曲线㊂
1.2.4.2　精密性　随机抽取三批SAA㊁CRP 联合检测免疫层析试纸条,分别检测浓度为5㊁10㊁50μg /ml 的SAA㊁CRP 样本,每个浓度平行测定10次,计算3个批号检测试纸条的批内和批间精密性(CV)㊂计算公式:精密性(CV)=标准差(s)/平均数(x )㊂1.2.4.3　准确度　向阴性样本中加入已知浓度的CRP 和SAA 室内质控品(浓度均为150㊁50㊁10μg /ml),
采用本方法制备的SAA㊁CRP 联合检测免疫层析试纸条检测,分别计算其回收率(回收率=测定浓度/预测浓度×100%)㊂
1.2.4.4　交叉反应　取浓度分别为50㊁100μg /ml 仅含SAA 抗原的样品各70μl 加入样品孔中,5min 后检测T1㊁T2㊁C 线荧光强度;同样将仅含有CRP 抗原,浓度分别为50㊁100μg /ml 的溶液滴加到该检测卡的加样孔中,5min 后检测㊂1.3　方法学比对　采用本方法制备的SAA㊁CRP 联合检测免疫层析试纸条与西门子BN ProSpec ®特定蛋白分析系统(散射比浊法)同时检测80份临床血清标本,并对SAA㊁CRP 定量检测结果进行比对
分析㊂
2　结果
2.1　最佳标记蛋白量与包被蛋白量的确定　结果如表1所示,采用5μl 荧光微球标记时,抗SAAⅠ标记量为20μg,抗SAAⅡ包被浓度为2mg /ml 时,试纸条的线性范围最宽,R 2最大,分别为0.78~200μg /ml,R 2=0.985㊂抗CRP Ⅰ标记量为20μg,抗CRP Ⅱ包被浓度为1.5mg /ml 时,试纸条的线性范围最宽,R 2最大,分别为0.78~200μg /ml,R 2=0.996㊂
2.2　分析性能评价
2.2.1　标准曲线的建立　SAA 线性质控品检测结果如图2,测得SAA 在0.78~200μg /ml 范围内线
性较好,y =0.6445x+1.6415,R 2=0.9958;CRP 线性质控品检测结果如图3,测得CRP 在0.78~
200μg /ml 范围内线性较好,y =0.7259x +1.2594,R 2=0.9964㊂SAA㊁CRP 最低检测限分别为0.35μg /ml㊁0.42μg /ml㊂
2.2.2　精密性　随机抽取3个不同批次的SAA㊁CRP 联合检测免疫层析试纸条,分别对浓度为5㊁10㊁50μg /ml 的样本进行精密性检测㊂SAA 批内精密性依次为9.59%㊁7.13%㊁4.49%,批间精密性依次为9.44%㊁6.92%㊁5.76%;CRP 批内精密性依次为9.59%㊁7.13%㊁4.49%,批间精密性依次为9.44%㊁6.92%㊁5.76%㊂本方法制备的试纸条其批间和批内变异系数均小于15%,符合精密性要求㊂表1　最佳标记蛋白量与包被蛋白量结果Tab.1　Best amount of labeling and coating
Coating(mg /ml)Labeling(μg)
SAA 1.0
1.5
2.0CRP 1.0
1.5
2.0
103.125-100μg /ml 3.125-150μg /ml 1.56-150μg /ml 3.125-100μg /ml 3.125-150μg /ml 3.125-150μg /ml R 2=0.933
R 2=0.928
R 2=0.943
R 2=0.949
R 2=0.951
R 2=0.939
201.56-100μg /ml 0.78-150μg /ml 0.78-200μg /ml 0.78-150μg /ml 0.78-200μg /ml 0.78-200μg /ml R 2=0.961
R 2=0.981
R 2=0.995
R 2=0.977
R 2=0.996
R 2=0.961
40
1.56-150μg
/ml 1.56-200μg /ml 0.78-200μg
/ml 1.56-200μg /ml 1.56-200μg /ml 0.78-200μg /ml R 2=0.957
R 2=0.965
R 2=0.971
R 2=0.963
R 2=0.987
R 2=0.955
图2　SAA 标准曲线
Fig.2　Sandard curve of SAA
图3　CRP 标准曲线
Fig.3　Sandard curve of CRP
表2　回收率检测结果(x ±s )
Tab.2　Recovery rate detection result (x ±s )
Test result
SAA
High value Median value Low value CRP
High value Median value Low value Predicted concentration(μg /ml)150
5010
150
5010
Detection concentration(μg /ml)
152.5±5.050.4±2.910.3±0.7153.9±5.351.7±3.510.5±0.6Recovery rate(%)
101.6100.7102.7102.6103.3104.7
图4　SAA 荧光免疫层析法与散射比浊法的相关性分析Fig.4　Correlation analysis between SAA fluorescence im⁃
munochromatography and scattering
nephelometry
图5　CRP 荧光免疫层析法与散射比浊法的相关性分析Fig.5　Correlation analysis between CRP fluorescence im⁃
munochromatography and scattering nephelometry
2.2.3　准确度　采用本方法制备的SAA㊁CRP 联合检测免疫层析试纸条回收率检测结果如表2所示,SAA 高㊁中㊁低值回收率分别为101.6%㊁
100.7%㊁102.7%;CRP 高㊁中㊁低值回收率分别为102.6%㊁103.3%㊁104.7%,均符合回收率85%~115%的要求㊂
2.2.4　交叉反应　从实验结果可知滴加不同浓度SAA 样品时,只有T1线和C 线有荧光条带,而T2线没有条带出现;在滴加仅含有CRP 的样品时,只有T2线和C 线出现荧光条带,而T1线无条带出现㊂表明,SAA 和CRP 两种抗原进行联合检测时没有交叉反应,互不干扰㊂
2.3　方法学比对　与西门子BN ProSpec ®特定蛋白分析系统对比分析SAA㊁CRP 检测结果如图4㊁5㊂两种方法检测SAA 的相关方程为:y =0.9731x+2.0745,R 2=0.9851;CRP 的相关方程为:y =0.9807x +1.0082,R 2=0.9804㊂表明本方法制备的SAA㊁CRP 联合检测免疫层析试纸条检测SAA㊁CRP 与西门子BN ProSpec ®特定蛋白分析系统相关性较好㊂3　讨论
感染性疾病发病急㊁进展快,若早期未及时诊断治疗,病情进展可能危及生命㊂临床上常以CRP 作为指标鉴别细菌和病毒感染,指导医师有针对性应用抗生素[7],但多项研究表明,其单独检测特异性不高[8,9]㊂SAA 是由肝脏合成的急性时相蛋白[10],在细菌或病毒感染早期均可升高,而CRP 在病毒感
染时一般不增高[11]㊂崔海涛等[12],潘克女等[13]研究发现SAA 和CRP 的联合检测相对于单独检测CRP 对感染性疾病的早期诊断敏感性更高㊁特异性更好,可为早期细菌和病毒感染的鉴别诊断提供有力的证据,减少不必要的抗生素应用㊂目前SAA㊁CRP 常用的检测方法有免疫比浊法㊁酶联免疫吸附法,由于免疫比浊法需配备大型检测设备,酶联免疫吸附法操作繁琐,使床旁快速检测及社区基层医院的推广应用受到限制㊂
本研究以镧系稀土元素Eu 3+羧基时间分辨荧光微球作为标记物,与葛宇新等[14]以CdTe 量子点为标记物建立的C 反应蛋白荧光免疫层析检测方法相比,显著增强了荧光强度,提高了荧光稳定性,保证了检测结果的灵敏度和特异性㊂本研究采用
EDC㊁NHS 两步法活化荧光微球,先加入EDC 活化微球表面羧基,与蛋白质或抗体形成O⁃酰基脲中间体后,再加入NHS 溶液,进一步形成更稳定的N⁃羟基琥珀酰亚胺酯,显著提高了微球抗体偶联物的稳定性㊂此外,在课题组前期技术积累的基础上,优化了微球复溶液配方,解决了试纸条研发中普遍遇到的稳定性差的关键问题㊂通过检测低㊁中㊁高定值SAA㊁CRP 样本,进行批间㊁批内精密性研究,SAA㊁CRP 批内㊁批间精密性(CV)均<15%,符合精密性要求㊂经优化SAA㊁CRP 配对抗体标记㊁包被比例,
使本研究建立的SAA㊁CRP 荧光免疫层析联合检测试纸条检测CRP 的线性范围可达0.78~200μg /ml,较葛宇新等[14]建立的C 反应蛋白荧光免疫层析检测方法(线性范围为0.1~1000ng /L)宽,检测SAA 灵敏度可达0.35μg /ml,较李启欣等[15]建立的血清淀粉样蛋白A 免疫荧光层析法灵敏度(3mg /L)高㊂通过筛选特异性优良的SAA㊁CRP 配对抗体,使SAA㊁CRP 联合检测时彼此无交叉反应,互不干扰,可在满足急诊需求的前提下使CRP 和SAA 的临床检验更便捷㊁更精准㊂
本研究选用80例CRP㊁SAA 含量从低值到高值定值血清作为样本,使用本研究建立的联合检测方法与西门子BN ProSpec ®特定蛋白分析系统(散射
比浊法)同时检测,显示测定血清中SAA和CRP相关系数分别为0.9851㊁0.9804,两者线性良好㊂同时由于时间原因,本方法存在检测样本量有限等问题,后期需大样本重复验证㊂综上所述,本方法精密度㊁准确性㊁系统间一致性评价的结果均满足临床使用的要求,可作为国内该项目联合检测的新一代快速检测试剂,值得广泛推广和运用,同时也为其他标志物的联合检测提供了借鉴㊂
参考文献:
[1]　Urieli⁃Shoval S,Linke R,Matzner Y.Expression and function of
serum amyloid A,a major acutephaseprotein,in normal and disease states[J].Curr Opin Hematol,2000,7(1):64⁃69. [2]　Díaz MG,García RP,Gamero DB,et ck of accuracy of
biomarkers and physical exa mination to detect bacterial infection in febrile infants[J].Pediatr Emerg Care,2016,32(10): 664⁃668.
[3]　Lannergård A,Viberg A,Cars O,et al.The time course of body
temperature,serum amyloid A protein,C⁃reactive protein and interleukin⁃6in patients with bacterial infection during the initial3 days of antibiotic therapy[J].Scand J Infect Dis,2009,41(9): 663⁃671.
[4]　Yang AP,Liu J,Yue LH,et al.Neutrophil CD64combined with
PCT,CRP and WBC improves the sensitivity for the early diagnosis of neonatal sepsis[J].Clin Chem Lab Med,2016,54(2): 345⁃351.
[5]　石英杰,王云龙,明　亮,等.HPV16/18E6蛋白荧光免疫层析
联合检测方法的建立[J].免疫学杂志,2018,34(6):534⁃538,546.
Shi YJ,Wang YL,Ming L,et al.Establishment of fluorescence im⁃munochromatography for detection of HPV16/18E6protein[J].
Immunol J,2018,34(6):534⁃538,646.
[6]　王云龙,马雪虎,李玉林,等.荧光免疫层析定量检测髓过氧
化物酶方法的建立[J].中国免疫学杂志,2018,34(11): 1690⁃1693.
Wang YL,Ma XH,Li YL,et al.Establishment of quantitative detection of myeloperoxidase by fluorescence immunochromato⁃graphy[J].Chin J Immunol,2018,34(11):1690⁃1693. [7]　Gao LQ,Liu XH,Zhang DH,et al.Early diagnosis of bacterial
infection in patients with septicopyemia by laboratory analysis of PCT,CRP and IL⁃6[J].Exp Ther Med,2017,13(6):3479⁃3483.
[8]　Nijman RG,Vergouwe Y,Moll HA,et al.Validation of the
Feverkidstool and procalcitonin for detecting serious bacterial
infections in febrile children[J].Pediatr Res,2018,83(2): 466⁃476.
[9]　Bárbara L,dos Anjos,Helena ZW.Evaluation of C⁃reactive protein
and serum amyloid A in the detection of inflammatory and infectious diseases in children[J].Clin Chem Lab Med,2010,48
(4):493⁃499.
[10]　Fu Y,Chen J,Cai B,et al.The use of PCT,CRP,IL⁃6and SAA
in critically ill patients for an early distinction between
candidemia and Gram positive/negative bacteremia[J].J
Infection,2012;64(4):438⁃440.
[11]　Chen SP,Huang YC,Li WC,et parison of clinical features
between coxsackievirus A2and enterovirus71during the
enterovirus outbreak in taiwan,2008:A Children′s Hospital
Experience[J].J Microbiol Immunol Infection,2010,43(2):
99⁃104.
[12]　崔海涛,秦洪伟.PCT㊁CRP联合血清淀粉样蛋白A在细菌性
肺炎与病毒性肺炎中的应用[J].临床血液学杂志(输血与检
验),2018,31(4):603⁃606.
Cui HT,Qin HW.Clinical value of PCT,CRP and SAA test in
diagnosis of bacterial pneumonia and viral pneumonia[J].J Clin
Hematol,2018,31(4):603⁃606.
[13]　潘克女,徐爱芳,何佳慧,等.血淀粉样蛋白A与C⁃反应蛋白
检测在感染性疾病诊断中的应用[J].中国卫生检验杂志,
2018,28(12):1485⁃1487.
Pan KN,Xu AF,He JH,et al.Clinical application of serum
amyloid A and C⁃reactive protein in determination of infectious
diseas[J].Chin J Health Lab Technol,2018,28(12):
1485⁃1487.
[14]　葛宇新,丁秋雨,钟晓骝,等.血清C反应蛋白荧光免疫层析
检测方法的建立[J].长春理工大学学报(自然科学版),
2016,39(6):129⁃133.
Ge YX,Ding QY,Zhong XL,et al.Quantitation determination of
CRP in serum with fluorescence immune chromatography[J].J
Changchun Univ Sci Technol(Natural Science Edition),2016,39
(6):129⁃133.
[15]　李启欣,梁指荣,汤永平,等.血清淀粉样蛋白A免疫荧光层
析法的建立[J].热带医学杂志,2017,17(9):1152⁃
1155,1163.
Li QX,Liang ZR,Tang YP,et al.Establishment of serum amyloid
A lateral flow immunoassay fluorescence chromatography[J].J
Tropical Med,2017,17(9):1152⁃1155,1163.
[收稿2018⁃12⁃21　修回2019⁃03⁃08]
(编辑　倪　鹏)。