cDNA全场扩增解析

设计引物
RACE（Rapid Amplification of cDNA Ends）技术进行基因cDNA全长扩增
文昌鱼LITAF基因全长的克隆
3’RACE
中间片段
LITAF基 因
5’RACE
Lipopolysaccharide-Induced TNF Factor
总RNA抽提
所有接触总RNA的试剂、器材等（包括配试剂用的H2O）均经0.1% DEPC （焦碳酸二乙酯 ）水处理，玻璃器皿于180℃烘箱烘烤6-8小时。 提取总RNA按mirVana™ miRNA Isolation Kit（Ambion公司）说明书于超净台中 操作（如图），提取的RNA分取部分进行纯度和完整性检测，其余于-80℃保 存。

ห้องสมุดไป่ตู้
Ambion（FirstChoice® RLM-RACE Kit） Invitrogen（GeneRacerTM Kit） TaKaRa（3’-Full RACE Core Set Ver.2.0 and 5’Full RACE kit ） Clontech（SMARTer™ RACE cDNA Amplification Kit）
Outer引物 Inner引物
确定读码框的 方向
RACE引物设计的要点

23－28nt 50－70％GC Tm值≥65度，Tm值≥70度可以获得好的结果 需要实验者根据已有的基因序列设计5‘和3‘RACE 反应的基因特异性引物（GSP1和 GSP2).由于两个引物的存在，PCR的产物是特异性的。
Oligo capping 法
碱性磷酸酶
烟草酸性焦 磷酸酶

Oligo capping method方法（又称RLM-RACE）是由日本东 京大学铃木等人开发，可以更精确的定位转录起始位点。 目前基于该方法的试剂盒有TaKaRa（5’-Full RACE kit D315）和Ambion（Firstchoice RLM-RACE kit AM1700）
3’RACE原理示意图
试剂盒中的接头与引物

3’-RACE ：3'-RACE较简单，首先将 mRNA或 总RNA用PolyT引物反转录，根据一般基因具有 polyA尾巴的特点，选用特异引物(根据已知序列设 计)和PolyT引物PCR即可。大多实验者反映一次 PCR可以搞定。
3’RACE引物的设计
PCR法进行中间片段的扩增

以反转录好的cDNA作为模板，利用合成好的特异 性引物或兼并引物进行中间片段的扩增。
切胶回收
克隆转化
挑取单菌落
公司测序
菌落PCR检测
测序结果的分析
去载体获得克隆片段
将测序得到的片段与用来设计引物的片段进行比对
进一步验证克隆得到的基因是否为目的基因
根据blast的结果初步确定克隆的基因为自己的目的基因，该基因片段 接下来用于RACE引物的设计
cDNA Synthesis And Gene Cloning
金萍 南京师范大学生命科学学院 动物遗传资源研究所
cDNA扩增流程
组织样品
浓度（C）和纯度（A260/280）检测
RNA提取
cDNA合成
RNA保护试剂
设计 特异 引物
PCR 扩增
凝胶回收DNA
纯化的DNA
PCR法筛选阳性克隆
Express sequence tag，EST

3’RACE的扩增
3’RACE
切胶回收
504bp
克隆转化
挑取单菌落
公司测序
菌落PCR检测
3’RACE序列的分析
将测序得到的结果去载体与接头
接下来，将3’RACE结果与中间片段采用DNAMAN软件 进行拼接
点击此图标进 行序列拼接
点击此处输 入需要拼接 的核酸序列
点击此处开 始进行拼接
点击“导出”按钮 输出拼接好的序列
SMART法
该技术是基于以下两个观察发展起来的： a、不同反转录酶包括MMLV合成的cDNA 3’端保真度不高； b、不同的反转录酶具有不同的加尾特性，MMLV特意的在cDNA末端 加上3-4个dCTP。

该方法的突出优点就是操作简便，成功率较高，全长分子的 比例较高。cDNA第一链的合成和加尾一步即完成，避免了 其他方法中对mRNA和cDNA链的反复操作，降低了mRNA 降解和合成产物丢失的风险，使本来就含量甚微的全长分子 得到最大保存，所以这种方法得到了广泛认可，应用最多。 如果加上RNA提取时间，这种技术可以在3个小时内得到加 上接头的cDNA产物，最大限度地降低了mRNA的降解风险。
RACE的基本概念

cDNA末端快速扩增(rapid amplification of cDNA ends, RACE)技术是基于PCR技术由已知的部分 cDNA序列来获得完整cDNA序列的一种方法，为 Frohman在1985年首次报道。

3’RACE 和5’RACE
常用的RACE试剂盒

引物设计




可以根据数据库中已有数据设计特异性引物或基因不同物种 中的保守结构域设计兼并引物 一般引物的长度为18-30bp，常用的长度为20-24bp，过长或 过短都不合适。 引物的GC含量一般为45-55%，过高或过低都不利于引发反 应。上下游引物的GC含量不能相差太大。 引物所对应模板序列的Tm值最好在50-70℃之间，当然由于 模板序列本身的组成决定其Tm值可能偏低或偏高，可根据 具体情况灵活运用。
总 R N A 提 取 过 程
安全柜
总RNA的浓度 和纯度检测
总RNA的完整性检测
琼脂糖凝胶电泳检测得到两
28S 18S 条清晰的谱带，分别为28S 和18S。说明提取的总RNA完 整性好，可进行下游实验操 作。
LITAF基因中间片段的克隆
cDNA模版的合成
1）RNA 2）oligodT引物、random引物 3）反转录酶（M-MLV……） 4）Rnase Inhibitor 5）dNTP 6）H2O
介绍常用的5’RACE试剂盒

Ambion（FirstChoice® RLM-RACE Kit） Clontech（SMARTer™ RACE cDNA Amplification Kit）
5’-RACE试剂盒一般基于以下几种技术：SMART、Oligo capping method、self-ligation和anchored PCR。