外源基因在大肠杆菌中的表达.
试验十外源基因在大肠杆菌中的诱导表达及检测
一. 实验目的
1.学习SDS-PAGE测定蛋白质分子量的原理 • 2.掌握垂直板电泳的操作方法
•
二. 实验原理
• SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳:是在聚丙烯酰胺 凝胶系统中引进SDS（十二烷基磺酸钠）
• 1967年，Shapiro等人首先发现，如果在聚丙烯酰 胺凝胶电泳(聚丙烯酰胺凝胶中主要取决于三种因 素：蛋白大小，形状和电荷)系统中加入一定量的 十二烷基硫酸钠（SDS），则蛋白质分子的电泳迁 移率主要取决于蛋白质的分子量大小？
每个蛋白标准的分子量对数对它的相对迁 移率作图得标准曲线，量出未知蛋白的迁 移率即可测出其 具有可靠性
注意的问题
蛋白质电泳
常用的SDS-PAGE：单一亚基组成的蛋白质
非变性PAGE：多个不同亚基组成的蛋白质
聚丙烯酰胺具有神经毒性，操作时要戴手套
SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)按照缓冲液 的pH值和凝胶孔径的差异及有无浓缩效应分为连续 系统和不连续系统两大类 连续系统电泳体系中缓冲液pH值及凝胶浓度相 同，带电颗粒在电场作用下，主要靠电荷和分子筛 效应 不连续系统中由于缓冲液离子成分，pH，凝胶 浓度及电位梯度的不连续性，带电颗粒在电场中泳 动不仅有电荷效应，分子筛效应，还具有浓缩效应， 因而其分离条带清晰度及分辨率均较前者佳
Gel
5%
200 97 66 45
10%
200 97 66
15%
200 97 66
45
29
29 45 29
将通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离的蛋白质转移到 硝酸纤维素/PVDF膜上，然后与能特异性识别待检 蛋白的抗体进行反应，洗涤去除没有结合的特异 性抗体后，加入标记的、能识别特异性抗体的种
基因工程-外源基因在大肠杆菌中的表达1
基因工程刘夫锋2019.11.18基因工程5 2 3 4 1 6789重组DNA 技术与基因工程的基本概念重组DNA技术与基因工程的基本原理重组DNA技术所需的基本条件重组DNA技术的操作过程目的基因的克隆与基因文库的构建外源基因在大肠杆菌中的表达外源基因在酵母菌中的表达外源基因在哺乳动物细胞中的表达外源基因表达产物的分离纯化6.1 大肠杆菌作为表达外源基因受体菌的特征6 外源基因在大肠杆菌中的表达6.1 大肠杆菌作为表达外源基因受体菌的特征6 外源基因在大肠杆菌中的表达大肠杆菌表达外源基因的优势遗传背景清楚，适合大规模发酵基因克隆表达系统成熟完善培养成本低廉、繁殖迅速、培养简单、操作方便和遗传稳定被美国FDA批准为安全的基因工程受体生物K-12MG1655的全基因组测序，共有4405个开放型阅读框丰富的寄主菌株和载体系列大肠杆菌表达外源基因的劣势缺乏对来源于真核生物蛋白质的复性功能缺乏对来源于真核生物蛋白质的翻译后修饰加工系统内源性蛋白酶会降解三维构象不正确的异源蛋白细胞周质内含有种类繁多的内毒素，痕量就会引起人体热激反应6.1 大肠杆菌作为表达外源基因受体菌的特征6 外源基因在大肠杆菌中的表达外源基因在大肠杆菌中高效表达6 外源基因在大肠杆菌中的表达强化蛋白质生物合成抑制蛋白产物降解维持或恢复蛋白质特异性空间构象外源基因数量（拷贝数）基因转录水平mRNA 翻译速率的时序性控制6.2 外源基因在大肠杆菌中高效表达的原理6 外源基因在大肠杆菌中的表达启动子终止子核糖体结合位点密码子质粒拷贝数基因的基本组成6.2 外源基因在大肠杆菌中高效表达的原理6 外源基因在大肠杆菌中的表达启动子(Promoter)-启动基因转录需要的一段DNA 序列位于基因的编码区上游，与基因的编码方向一致，被细胞内转录因子和RNA聚合酶识别后，可开启基因转录的一段特殊的DNA序列。
启动子E. Coli 中常用的启动子-35 区序列-10 区序列P l L P recA P trp P lac P traA P tac启动子T T G A C A G A T A C T T T G A T A T A T A A T T T G A C A T T A A C T T A G A C A T A A T G T T T T A C A T A T A A T T T G A C AT A T A A T启动子的启动效率：P tac = 3 P trp = 11 P lac启动子启动子的可控性P乳糖启动子P lac 的可控性：OP O高效转录阻遏蛋白诱导乳糖异丙基-b -D-硫代半乳糖苷（IPTG ）野生型的P lac 与其控制区O lac 偶联在一起，在没有诱导物存在时，整个操纵子处于基基底水平转录底水平表达；诱导物可以使启动子P lac 介导的转录大幅提高。
基因工程-外源基因在大肠杆菌中的表达2
基因工程5 2 3 4 16789重组DNA 技术与基因工程的基本概念重组DNA技术与基因工程的基本原理重组DNA技术所需的基本条件重组DNA技术的操作过程目的基因的克隆与基因文库的构建外源基因在大肠杆菌中的表达外源基因在酵母菌中的表达外源基因在哺乳动物细胞中的表达外源基因表达产物的分离纯化6.3 大肠杆菌基因工程菌的构建策略6 外源基因在大肠杆菌中的表达包涵体型异源蛋白的表达分泌型异源蛋白的表达融合型异源蛋白的表达寡聚型异源蛋白的表达整合型异源蛋白的表达蛋白酶抗性或缺陷型表达系统的构建细胞定位包涵体型异源蛋白的表达重组异源蛋白的细胞定位胞质型、周质型（内膜与外膜之间的空隙）和胞外型将重组异源蛋白引导至何种特定的细胞间隔各有利弊。
优选胞质，原因是在胞质型表达的表达水平高。
包涵体型异源蛋白的表达（胞质型）分泌型异源蛋白的表达（周质型或胞外型）融合型异源蛋白的表达寡聚型异源蛋白的表达整合型异源蛋白的表达蛋白酶抗性或缺陷型表达系统的构建单独表达融合表达包涵体型异源蛋白的表达包涵体及其性质在某些生长条件下，大肠杆菌能积累某种特殊的生物大分子，它们致密地集聚在细胞内，或被膜包裹或形成无膜裸露结构，这种水不溶性的结构称为包涵体（Inclusion Bodies ，IB ）。
富含蛋白质的包涵体多见于生长在含有氨基酸类似物培养基的大肠杆菌细胞中，由这些氨基酸类似物所合成的蛋白质往往会丧失其理化特性和生物功能，从而集聚形成包涵体。
由高效表达质粒构建的大肠杆菌工程菌大量合成非天然性的同源或异源蛋白质，后者在一般情况下也以包涵体的形式存在于细菌细胞内。
除此之外，包涵体中还含有少量的DNA 、RNA 和脂多糖等非蛋白分子。
包涵体型异源蛋白的表达以包涵体形式表达目的蛋白的优缺点高效表达重组异源蛋白包涵体表达形式的优点：以包涵体形式表达的重组异源蛋白可达细菌蛋白总量的20%-60%。
具有固相特性，从而简化外源基因表达产物的分离纯化包涵体的水难溶性及其密度远大于其它细胞碎片和细胞成份，菌体经超声波裂解后，直接通过高速离心即可将重组异源蛋白从细菌裂解物中分离出来。
实验九 外源基因在大肠杆菌中的诱导表达和降解物阻遏作用
实验九外源基因在大肠杆菌中的诱导表达和降解物阻遏作用【实验目的】1.了解外源基因在原核细胞中表达的基础理论。
2.掌握乳糖操纵子的调节机制和操作方法。
【实验原理】1.外源基因在原核细胞中的表达蛋白质通常是研究的最终目标，因此蛋白质的表达在基因工程中占有非常重要的地位。
常用的表达系统有原核细胞和真核细胞。
原核细胞表达系统主要使用大肠杆菌，真核细胞表达系统主要有酵母细胞、哺乳动物细胞和昆虫细胞。
这些表达系统各有优缺点，应根据实验目的和实验室条件加以选择。
本实验主要介绍以大肠杆菌为代表的原核细胞表达系统。
（1）大肠杆菌表达系统的特点：生物学特性和遗传背景清楚，易于操作；已开发较多的克隆载体可供选择；容易获得大量的外源蛋白（外源蛋白可占细菌总蛋白50％左右）。
（2）蛋白质在原核细胞中的表达特点：原核细胞有其固有的RNA聚合酶，识别原核基因的启动子。
因此，在用原核细胞表达目的基因（无论是真核基因还是原核基因）时，一般应使用原核启动子。
原核基因的mRNA含有SD序列，启动蛋白质的合成。
而在真核基因上则缺乏该序列。
因此，一些商品化原核表达载体上设计有SD序列，以方便真核基因的表达。
原核细胞没有mRNA转录后加工的能力。
因此，在原核细胞中表达真核基因时，应使用cDNA 为目的基因。
原核细胞缺乏真核细胞对蛋白质进行翻译后加工的能力。
如表达产物的功能和蛋白质的糖基化、高级结构的正确折叠有关，必须慎重使用原核表达系统。
外源基因在大肠杆菌中高效表达时，表达产物往往在胞浆聚集，形成均一密度的包涵体。
包涵体的形成有利于保护表达产物不被胞内的蛋白酶降解，而且可以通过包涵体和胞内其他蛋白质密度不同来纯化包涵体蛋白。
但包涵体蛋白不具有该蛋白的所有生物学活性，往往需要通过变性复性的方法恢复活性，有时只能回复部分活性。
（3）蛋白质在原核细胞表达的调控启动子是转录水平调控的主要因素。
根据启动子起始mRNA合成效率的不同，可分为强、弱启动子，但是启动子的强弱是相对于不同基因而言的。
外源基因在大肠杆菌中表达简略实验步骤
目的基因在大肠杆菌中的诱导表达一般程序如下：获得目的基因－准备表达载体－将目的基因插入表达载体中（测序验证）－转化表达宿主菌－诱导靶蛋白的表达－表达蛋白的分析－扩增、纯化、进一步检测。
[主要试剂]1、LB培养基。
2、100mM IPTG（异丙基硫代-β-D-半乳糖苷）：2.38g IPTG溶于100ml ddH2O 中,0.22μm滤膜抽滤，-20℃保存。
[操作步骤]1、通过PCR方法获得目的基因：以含目的基因的克隆质粒为模板，按基因序列设计一对引物（在上游和下游引物分别引入不同的酶切位点，本实验中为Ba mHⅠ和HiindⅢ），PCR循环获得所需基因片段。
PCR反应体系为：模板（含R基因的重组质粒）1μl上游引物PR11μl下游引物1μldNTP（2.5mmol/L）5μl10×PCR buffer（含Mg2+）10μlTaq酶1μlddH2O补至100μlPCR反应条件为：94℃变性3min；94℃变性3min、52℃复性40sec、72℃延伸1min，30个循环；最后72℃延伸8min。
2、构建重组表达载体（1）载体酶切：将表达质粒pR SETA用限制性内切酶（同引物的酶切位点）进行双酶切，酶切产物行琼脂糖电泳后，用凝胶回收Ki t或冻融法回收载体大片段。
（2）R基因PCR产物双酶切后回收，在T4 DNA连接酶作用下连接入载体。
连接反应体系为：pRSETA1μlR基因片段3μlT4 DNA连接酶（5U/μl）1μl5×buffer2μlddH2O补至10μl3、获得含重组表达质粒的表达菌种（1）将连接产物转化大肠杆菌DH5α，根据重组载体的标志（抗Amp）作筛选，挑取单斑，碱裂解法小量抽提质粒，双酶切初步鉴定。
（2）测序验证目的基因的插入方向及阅读框架均正确,进入下步操作。
wp_240768786基因在大肠杆菌中的过表达实验的实验内容
wp_240768786基因在大肠杆菌中的过表达实验的实验内容基因在大肠杆菌中的过表达实验是一种常用的实验方法，通过引入外源表达载体，将感兴趣的基因在大肠杆菌中过量表达，从而研究该基因在生物体中的功能、调控机制和相互作用等方面的问题。
本文将介绍基因在大肠杆菌中过表达实验的实验内容。
一、实验前的准备工作1.选择合适的表达载体：通常采用静态表达载体，如pUC19，pBluescript等，或动态表达载体，如pET系列，pGEX系列等。
2.克隆目标基因：使用PCR或其他克隆方法从原始样本中扩增出目标基因，并通过酶切与载体连接。
3.转化大肠杆菌：利用热激转化、电穿孔转化等方法将重组载体转化到大肠杆菌中。
二、基因克隆与构建表达载体1.通过PCR扩增基因：设计引物，利用PCR技术从模板DNA中扩增目标基因。
2.准备载体：选择适当的表达载体，并通过限制性内切酶酶切开，以便与PCR扩增的基因片段连接。
3.构建重组载体：将PCR扩增的目标基因片段与线性化的载体连接，利用连接酶如T4 DNA连接酶处理，并通过热激转化等方法将重组载体转化到大肠杆菌中。
三、大肠杆菌中的基因过表达1.筛选阳性克隆：将转化后的大肠杆菌克隆在含有适当抗生素的培养基上培养，选择阳性克隆并进行验证。
2.静态表达或动态表达：根据需要选择适当的表达载体和表达系统。
四、鉴定表达产物1.确定表达水平：通过聚合酶链式反应（PCR）、蛋白质质谱、Western blot、酶联免疫吸附实验（ELISA）等方法，检测表达基因的存在和表达水平。
2.验证表达产物功能：通过下游分析，如活性酶测定、免疫组化、免疫印迹等方法，评估过表达产物的功能和活性。
五、研究过表达基因的功能和调控机制1.功能研究：通过过表达基因后的表型观察，如细胞生长、代谢物产量、酶活性增加等，评估基因表达对细胞生理过程的影响。
2.亚细胞定位：通过融合表达产物与荧光标记或标示剂相结合等方法，观察基因表达产物在细胞中的定位，从而推测其功能和组织定位。
外源基因在大肠杆菌中的高效表达
实验十八外源基因在大肠杆菌中的高效表达一、实验目的1. 掌握外源基因在大肠杆菌中表达的特点和方法。
2. 复习SDS-PAGE的制备及其分离原理。
二、实验原理一种高效的原核表达载体需要包括一个强大并且可以严紧调节的启动子；一位于翻译起始密码子5’端大约9bp的SD序列；位于目的基因3’末端的一个高效转录终止子。
此外，载体还需要一个复制起点，筛选标记和利于对启动子活性进行严紧调节的基因。
这些元件的作用往往具有基因特异性，因此要根据不同的情况加以取舍。
E.coli表达载体的基本结构见下图：1．有效的转录起始与基因的高效表达有效的转录起始是外源基因能否在宿主细胞中高效表达的关键性步骤之一。
最理想的强的可调控的启动子应该是：在发酵的早期阶段表达载体的启动子被紧紧地阻遏，这样可以避免出现表达载体不稳定，细胞生长缓慢或由于产物表达而引起的细胞死亡等问题。
对于原核细胞而言，可分为可诱导型启动子，比如lac，trp，tac，phoA等，和组成型启动子如T7噬菌体启动子。
2．mRNA 的有效延伸和转录终止与基因的高效表达转录开始后，mRNA 开始进行有效延伸，终止以及稳定的积累，在这个过程中，转录物内的衰减和非特异性终止能诱发转录中的mRNA分子提前终止。
衰减子位点具有简单终止子的特性，在原核细胞中其处于操纵子的启动子和第一个结构基因之间，为保证mRNA转录安全，在表达载体的组建中要尽量避免其存在。
正常的转录终止子序列的存在也是外源基因高效表达的一个因素，其作用是防止不必要的转录，使mRNA的长度限制到最小，增加表达质粒的稳定性。
对于真核细胞而言，表达载体上含有转录终止序列和poly A加入位点，使外源基因高效表达的重要因素。
3．有效的翻译起始与基因的高效表达在原核细胞中使翻译起始达到最大效率的一般原则：1) AUG(ATG)是最首选的起始密码子。
GUG、UUG、AUU和AUA有时也用作起始密码子，但非最佳选择。
2) SD序列中至少含有AGGAGG序列中的四个碱基。
外源基因在大肠杆菌中的表达
PL 和 PR 表达系统
转录调控的机理
由 l 噬菌体 PE 启动子控制的 cI 基因的产物是 PL 、 PR 启动子转录的
阻遏物。cI 基因的产物在大肠杆菌宿主中的浓度取决于一系列宿主与 噬菌体因子之间的错综复杂的平衡关系。由于通过细胞因子来控制cI 基因产物的产生和消失是相当困难的。
由于 PL 和 PR 表达系统诱导时不加化学诱导剂，成本又低廉，最初几 个在大肠杆菌中制备的药用重组蛋白质都采用 PL 或 PR 表达系统。
缺陷 在热脉冲诱导过程中，大肠杆菌热休克蛋白的表达也会被激活，其 中一些是蛋白水解酶，有可能降解所表达的重组蛋白。 在大体积发酵培养菌体时，通过热平衡交换方式把培养温度从30℃ 提高到 42℃ 需要较长的时间，这种缓慢的升温方式影响诱导效 果，对重组蛋白表达量有一定的影响。
T7 表达系统
大肠杆菌 T7 噬菌体具有一套专一性非常强的转录体系，利用这一 体系中的元件为基础构建的表达系统称为 T7 表达系统。
T7 表达系统
T7 噬菌体基因 1 编码的 T7 RNA 聚合酶选择性的激活 T7 噬菌体启 动子的转录。
T7 RNA 聚合酶活性高，其合成 RNA 的速度比大肠杆菌 RNA 聚合 酶快 5倍左右。并可以转录某些不能被大肠杆菌 RNA聚合酶有效转 录的序列。
对宿主菌的要求
用溶源化 l 噬菌体的大肠杆菌作 PL、PR 启动子表达载体的宿主菌
N4830-1，POP2136 等菌株已经溶源化 cI 857(ts) l 噬菌体， 可用作表达外源基因时的宿主菌。 把 cI 857(ts) 基因组装在表达载体上 宿主菌选择范围更大
PL 和 PR 表达系统存在的问题
这两个启动子受在培养基中的无机磷（Pi）浓度调控（Pi﹥5mmol/L 时抑制，Pi﹤1mmol/L 时激活)，具有较高的转录水平。
大肠杆菌表达
大肠杆菌表达引言大肠杆菌（Escherichia coli）是一种常见的细菌，广泛应用于基因工程和蛋白质表达领域。
大肠杆菌表达系统具有高效、经济且易于操作的特点，因此被广泛用于重组蛋白的生产。
本文将介绍大肠杆菌表达系统的基本原理及其在蛋白质表达中的应用。
大肠杆菌表达系统的基本原理大肠杆菌表达系统采用重组DNA技术，将外源基因插入到大肠杆菌的表达载体中。
表达载体通常包含一个启动子、一个转录终止子、一个选择性抗生素抗性基因和一个参考基因。
启动子能够促使外源基因的转录，转录终止子能够终止转录过程，选择性抗生素抗性基因则能够确保只有带有外源基因的细菌存活下来。
参考基因用于对比表达水平，以评估外源基因的表达效果。
大肠杆菌表达系统的步骤大肠杆菌表达系统的基本步骤如下：1.选择适当的表达载体：根据需要选择合适的表达载体，包括质粒和噬菌体。
2.插入目标基因：将目标基因插入到表达载体中，通常使用限制酶切和连接酶法完成插入。
3.转化大肠杆菌：将重组载体导入大肠杆菌细胞中，通常使用热激转化或电转化的方法。
4.选择性培养：将转化后的菌液接种到选择性培养基上，以筛选含有外源基因的细菌。
5.表达蛋白质：使用适当的培养条件和诱导方法，促使含有外源基因的细菌表达目标蛋白质。
6.蛋白质纯化：利用亲和层析、离子交换层析等技术，对目标蛋白质进行纯化。
大肠杆菌表达系统的应用大肠杆菌表达系统在蛋白质表达领域具有广泛的应用。
以下是一些常见的应用领域：1.重组蛋白质的生产：大肠杆菌表达系统可用于大规模生产重组蛋白质，如重组人胰岛素等。
2.蛋白质结构和功能研究：通过大肠杆菌表达系统，可以表达和纯化具有特定结构和功能的蛋白质，用于研究其结构和功能。
3.抗原制备：大肠杆菌表达系统可以用于表达和纯化目标蛋白质，作为疫苗的抗原。
4.酶的生产：利用大肠杆菌表达系统表达酶，可以实现酶的大规模生产，用于工业生产和生物催化等领域。
总结大肠杆菌表达系统是一种高效、经济且易于操作的蛋白质表达系统。
实验七 外源基因在大肠杆菌中的诱导表达
大肠杆菌包涵体的分离与蛋白质纯化
1 细菌的裂解： 常用方法有：① 高温珠磨法；② 高压匀浆；③ 超声破碎法； ④ 酶溶法；⑤ 化学渗透等。前三种方法属机械破碎法，并且方 法① 、② 已在工业生产中得到应用，后三种方法在实验室研究 中应用较为广泛。 下面介绍酶溶法和超声破碎法的实验步骤。
1、酶溶法。常用的溶解酶有溶菌酶；β-1,3 -葡聚糖酶；β-1,6 -葡聚糖酶；蛋白酶；壳 多糖酶；糖昔酶等。溶菌酶主要对细菌类有作用，而其他几种酶对酵母作用显著。 主要步骤为： ① 4 ℃ ，5000rpm 离心，15 min ，收集诱导表达的细菌培养液（100 mL ）。弃 上清，约每克湿菌加3 mL 裂解缓冲液，悬浮沉淀。 ② 每克菌加8μL PMSF 及80μL 溶菌酶，搅拌20 min ；边搅拌边每克菌加4 mg 脱 氧胆酸（在冷室中进行）。 ③ 37 ℃ ，玻棒搅拌，溶液变得粘稠时加每克菌20μL DNase I。室温放置至溶液不 再粘稠。 2、超声破碎法。声频为15-20 kHz 的超声波在高强度声能输入下可以进行细胞破碎， 在处理少量样品时操作简便，液体量损失较少，同时还可对染色体DNA 进行剪切 ，大大降低液体的粘稠度。 ① 收集1 L 诱导表达的工程菌，40 ℃ ，5000r pm 离心，15 min ；弃上清，约每 克湿菌加3 mLTE 缓冲液。 ② 按超声处理仪厂家提供的功能参数进行破菌；10 000g 离心，15min ，分别收集 上清液和沉淀。 ③ 分别取少量上清和沉淀，加入等体积的2× 凝胶电泳加样缓冲液，进行SDS PAGE 。 注意事项：超声破碎与声频、声能、处理时间、细胞浓度、菌种类型等因素有关， 应根据具体情况掌握；超声波破菌前，标本经3 -4 次冻溶后更容易破碎。
实验七 外源基因在大肠杆菌中的诱导表达
分子生物学实验技术-3-外源基因在大肠杆菌中的表达
分子生物学实验技术三、外源基因在大肠杆菌中的表达（一）含有表达质粒的重组细菌的诱导表达实验安排：每组做一份（5人/组）。
操作步骤：1、将重组质粒和对照载体分别转化BL21（DE3）感受态细胞，待长出菌落后在转化的平皿中各挑取一个单菌落接种于3 mL含Amp的LB液体培养基中，37℃培养过夜。
2、将培养的细菌按1∶50比例加入到5 mL含Amp的新鲜LB液体培养基中，37℃振荡培养至OD600≌0.4-1.0（最好0.6，大约需3 h）。
3、取1ml菌液作为未诱导的对照组，余下的加入IPTG诱导剂至终浓度为0.5 mM作为实验组，两组继续37℃振荡培养3 h。
4、分别取菌液1 mL于1.5 mL Ep管中，12000⨯g离心30 s，收获菌体。
5、用100 μL无菌去离子水将菌体吹散混匀，然后加100 µL 2⨯SDS凝胶加样缓冲液，混匀后沸水浴5 min。
6、通过SDS-PAGE电泳检测外源蛋白的表达情况。
注意事项：1、IPTG的最佳诱导浓度的确定：将IPTG以不同浓度（0.2-2.0 mM）加入菌液中进行诱导，通过SDS-PAGE电泳检测外源蛋白的表达情况，选择外源蛋白表达量最高时的IPTG浓度作为其最佳诱导浓度。
2、最佳诱导时间的选择：在菌液中加入最佳浓度的IPTG诱导6 h，其间每隔1 h（在第1、2、3、4、5、6 h）分别取菌液1 mL，通过SDS-PAGE电泳检测外源蛋白的表达情况，选择外源蛋白表达量最高时的诱导时间作为其最佳诱导时间。
（二）SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）实验安排：示范性操作。
实验原理：细菌体中含有大量蛋白质，具有不同的电荷和分子量。
强阴离子去污剂SDS与某一还原剂（如巯基乙醇或二硫苏糖醇DTT）并用，通过加热使蛋白质解离，大量的SDS结合蛋白质，使其带相同密度的负电荷，在聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）上，不同蛋白质的迁移率仅取决于分子量。
采用考马斯亮兰快速染色，可及时观察电泳分离效果。
外源蛋白在大肠杆菌中的表达
外源蛋白在大肠杆菌中的表达
大肠杆菌是一种常见的细菌，广泛存在于自然界中。
它是一种重要的研究对象，因为它具有许多有用的特性，例如易于培养、生长速度快、遗传变异性高等。
在大肠杆菌中，外源蛋白的表达是一项重要的研究领域。
外源蛋白是指来自于其他生物体的蛋白质，它们可以通过基因工程技术被导入到大肠杆菌中进行表达。
这种技术可以用于生产各种重要的蛋白质，例如药物、酶、抗体等。
外源蛋白的表达需要通过转化、选择、培养等步骤来完成。
转化是指将外源DNA导入到大肠杆菌中的过程。
这可以通过化学方法、电穿孔、热激等方式来实现。
选择是指筛选出表达外源蛋白的细胞。
这可以通过添加抗生素、荧光素等物质来实现。
培养是指将筛选出的细胞进行培养，使其表达外源蛋白。
外源蛋白的表达可以通过多种方式来实现。
最常用的方法是利用质粒载体来表达外源蛋白。
质粒是一种小型的DNA分子，可以在大肠杆菌中自主复制。
质粒中可以携带外源DNA序列，使其在大肠杆菌中得到表达。
此外，还可以利用噬菌体载体、整合载体等方式来表达外源蛋白。
外源蛋白的表达不仅可以用于生产各种重要的蛋白质，还可以用于研究蛋白质的结构和功能。
例如，可以利用大肠杆菌表达外源蛋白
来研究其结构和功能，从而为药物研发提供重要的信息。
外源蛋白在大肠杆菌中的表达是一项重要的研究领域。
通过基因工程技术，可以实现外源蛋白的高效表达，为生产各种重要的蛋白质和研究蛋白质的结构和功能提供了重要的手段。
实验八 外源基因在大肠杆菌中的诱导表达和检测
实验八外源基因在大肠杆菌中的诱导表达和检测（12学时，9小时）Ⅰ外源基因在大肠杆菌中的诱导表达一、实验目的：通过本实验了解外源基因在原核细胞中表达的特点和方法。
二、实验原理：将外援基因克隆在含有T7启动子的表达载体中，让其在E.coli中表达。
先让宿主菌生长，lacⅠ产生的阻遏蛋白与lac操纵基因结合，从而不能进行外源基因的转录和表达，此时宿主菌正常生长。
然后向培养基中加入lac操纵子的诱导物IPTC（异丙基硫代-β-D-半乳糖）,阻遏蛋白不能与操纵基因结合，则外源基因大量转录并高效表达。
表达蛋白可经SDS-PAGE和（或）活性分析进行检测（本实验Ⅱ、Ⅲ）或做蛋白印迹，用抗体识别表达蛋白。
三、仪器、材料和试剂四、实验步骤1.预培养：挑去一含pETBlue-2-AKP表达质粒的单菌落到3ml含50ug\ml Carb、34ug\mlCam 和1%葡萄糖的LB液体培养基中，37℃、190r\min振荡培养过夜。
2.将过夜培养的菌液1ml接种于100ml含50ug\mlCarb、34ug\mlCam和1%葡萄糖的TM 液体培养基中，37℃、250r\min振荡至A6000.6~0.8.3.向其中加入IPTG至终浓度为200ug\l，37℃培养4h。
4. 6000r\min离心10min，弃上清液。
5.收集菌体细胞沉淀，-20℃冻存。
（注：为了比较分析应做一个不含目的基因仅含载体的对照菌的表达）Ⅱ活性分析检测表达蛋白一、实验目的：通过本实验了解碱性磷酸酶的活性方法及如何通过活性来监测蛋白的诱导表达。
二、实验原理：磷酸酶能水解底物分子上的磷酸集团从而使底物分子脱磷酸化。
对硝基酚磷酸为含磷化合物，能被磷酸酶水解为对硝基酚和游离的磷酸集团。
对硝基酚磷酸在碱性条件下为无色化合物而对硝基酚则为黄色化合物，在410nm处有光吸收值，利用此反应的颜色变化可以测定磷酸酶的酶活性从而来检测碱性磷酸酶的诱导表达情况。
三、仪器、材料和试剂：四、实验步骤：1.向菌体细胞沉淀中加入15mL Buffer A,重悬菌体。
实验三 外源基因在大肠杆菌中的诱导表达与检测
实验四 外源基因在大肠杆菌中 的诱导表达与检测
讲Hale Waihona Puke ：王聪艳一、实验目的：1、了解外源基因表达常用的载体及其特点。 2、通过本实验掌握原核基因表达产物分离的 方法。 3、通过本实验掌握原核基因表达检测的方法。
3、蛋白质样品的制备
分别取1 ml菌液，12000 r/min，离心2 min，弃上清， 再取1mi重复一次，加入100 μl 上样缓冲液悬浮沉淀， 置水浴煮沸5 min，冰上放置5 min，12000 r/min，离 心5 min，取上清点样。
4、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测 在电泳槽中加入电极缓冲液，连接电源，电泳至 溴酚蓝行至电泳槽前沿时停止(需约4 h)。 5、染色、脱色 将胶从玻璃板中取出，用考马斯亮兰染色液室温 染色1-2 h。将胶从染色液中取出，在脱色摇床慢摇脱 色，更换两次脱色液后，将胶置于含冰乙酸(1:1000) 的蒸馏水中，脱色至条带清晰。
6、将脱色好的胶板拍照
四、结果分析与讨论
• 分析对照组pET-32a空载体的大肠杆 菌与含有外源基因的菌体经诱导后 的蛋白表达情况
pET系统是在大肠杆菌中克隆和表达重组蛋白的系统。目标基因被克隆到T7噬
菌体强转录和翻译信号控制之下，并通过宿主细胞提供的T7 RNA聚合酶来诱导目标 基因表达。
二、实验仪器、用具、药品
• 聚丙烯酰胺凝胶电泳装置、电磁炉、水浴锅、 • 微量移液器、注射器、 • Ecoli （pET-32a空载体）、 Ecoli （ pET32a 携带外源基因）、 Ecoli （无载体） IPTG 、标准分子量蛋白等。
外源蛋白在大肠杆菌中的表达
外源蛋白在大肠杆菌中的表达一、引言外源蛋白是指不属于宿主生物体自身的蛋白质，通常是由其他生物体合成的蛋白质。
在大肠杆菌中表达外源蛋白已经成为了基因工程和生物技术领域中的一个重要研究方向。
本文将从大肠杆菌表达外源蛋白的原理、方法、策略等方面进行详细阐述。
二、原理1. 大肠杆菌表达系统原理大肠杆菌表达系统是指利用大肠杆菌作为宿主细胞，通过转化外源DNA进入细胞，使其在细胞内得到表达并产生相应的蛋白质。
这个系统包括三个部分：载体、宿主细胞和诱导剂。
2. 质粒载体质粒载体是指一种环状DNA分子，可以携带外源DNA序列并在大肠杆菌中进行复制和表达。
常用的载体有pUC19、pET28a等。
3. 宿主细胞宿主细胞是指被转化了质粒载体的大肠杆菌细胞。
常用的宿主细胞有BL21(DE3)等。
4. 诱导剂诱导剂是指在宿主细胞中引发表达外源蛋白的物质。
常用的诱导剂有IPTG、L-arabinose等。
三、方法1. 克隆外源DNA序列到质粒载体中将外源DNA序列克隆到质粒载体中，形成表达载体。
常用的方法有限制性酶切和连接法、PCR扩增法等。
2. 将表达载体转化到宿主细胞中将表达载体通过热激转化或电转化等方法导入到宿主细胞中，使其在细胞内进行复制和表达。
3. 选择正常表达的克隆通过筛选，选择出正常表达目标蛋白的克隆。
常用的筛选方法有PCR 检测、Western blotting等。
4. 诱导表达目标蛋白在选定的克隆中加入适量的诱导剂，使其开始表达目标蛋白。
通常在温度、时间、浓度等方面进行调节，以得到最佳效果。
四、策略1. 选择合适的载体和宿主细胞根据需要表达的外源蛋白的不同，选择适合的载体和宿主细胞。
例如，如果需要表达带有His标签的蛋白质，可以选择pET28a载体和BL21(DE3)宿主细胞。
2. 优化表达条件通过调节温度、时间、浓度等参数来优化表达条件，以提高目标蛋白的表达量和纯度。
3. 联合表达将多个外源蛋白基因克隆到同一个载体中，使其在同一宿主细胞中进行联合表达。
外源基因在大肠杆菌中诱导表达与检测
外源基因在大肠杆菌中诱导表达与检测原理目的基因被克隆到pET质粒载体上，受噬菌体T7强转录及翻译(可选择)信号控制；表达由宿主细胞提供的T7 RNA 聚合酶诱导。
T7 RNA 聚合酶机制十分有效并具选择性：充分诱导时，几乎所有的细胞资源都用于表达目的蛋白；诱导表达后仅几个小时，目的蛋白通常可以占到细胞总蛋白的50%以上。
在培养体系中加入IPTG 诱导T7 RNA 聚合酶生产，继而质粒上的目的DNA 开始转录。
本实验采用已经构建好的表达载体pET，该载体带有来源于古细菌的单链结合蛋白质（SSB）的序列，经IPTG的诱导，实现外源基因的表达，并通过SDS-PAGE对表达产物进行检测。
一、主要仪器、材料、和试剂1. 仪器恒温摇床，台式高速离心机，恒温水浴锅，垂直板蛋白质电泳装置，生化培养箱，电泳仪，超净工作台，移液器。
2. 材料含有表达载体pET-28的BL21菌株。
3. 试剂IPTG 储液(200mg/ml)：在800μl 蒸馏水中溶解200mg IPTG 后，用蒸馏水定容至1ml，用0.22μm 滤膜过滤除菌，分装于离心管并储于-2 0℃。
二、操作步骤1．重组质粒在大肠杆菌中的诱导表达将已经验证的带有SSB－pET28重组质粒的大肠杆菌BL21在含有卡那霉素LB的平板上划线培养。
挑取长出的单菌落接入液体LB试管中，加入卡那霉素至终浓度为50ug/mL，37℃摇床过夜。
按1％接种量接入100mL LB培养基，加入卡那霉素至终浓度为50ug/mL，37℃摇床培养至菌浓OD 600达到0.6左右，加入IPTG至终浓度为1mM，37℃摇床继续培养4h，诱导SSB蛋白表达。
每隔两个小时取样进行实验。
2. 蛋白质SDS—PAGE在蛋白溶液中加入样品缓冲液，100 oC处理5min，离心取上清5－15mL 点样。
于75V～100V电泳约2h，凝胶在考马斯亮兰G250染液中染色1h，在脱色液中脱色。
外源基因在大肠杆菌中的诱导表达
外源基因在大肠杆菌中的诱导表达【实验目的】熟悉异丙基-β-D 硫代半乳糖苷（Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside，简称IPTG）诱导外源基因在大肠杆菌中表达的原理和方法。
【实验原理】(Q往圣科技3452125268提供12万种免费质粒)在E.coli BL21(DE3)染色体DNA中插入了T7 RNA聚合酶基因，该基因的上游为Lac启动子，在正常条件下，大肠杆菌Lac操纵子中LacI编码的阻遏蛋白结合在该Lac启动子以及pET-15b 质粒T7启动子的附近LacO上，抑制T7 RNA聚合酶基因的表达，从而抑制了pET-15b 上T7启动子下游外源基因的表达。
当培养基中存在IPTG时，IPTG与阻遏蛋白结合，使阻遏蛋白成为非活性形式，解除了阻遏蛋白对Lac启动子和T7启动子的抑制，T7 RNA聚合酶基因表达，它与T7启动子结合诱导其下游外源基因的转录，转录产生的mRNA经过翻译表达出目的蛋白。
(基金论文，你提供实验材料，我免费给你做实验，成果归你享有Q往圣科技3452125268 )本实验选用的工程菌为转化了pET-15bcrtE的E.coli BL21(DE3)。
pET-15crtE是通过将噬夏孢欧文氏菌（Erwiniauredovora）编码牻牛儿基牻牛儿焦磷酸合成酶的crtE，在Nde I和Xho I 位点克隆到pET-15b中而构建的，crtE的起始密码子（ATG）与pET-15b上的多聚组氨酸标签（His-tag）的编码序列融合。
crtE基因全长906 bp，编码蛋白（包括His-tag）的分子量约为35kDa。
【器材与试剂】(Q往圣科技3452125268提供12万种CRISPR/cas9免费送)1.实验仪器细菌培养箱，摇床，台式离心机，微量移液器，电泳仪，电泳槽，电炉(Q往圣科技3452125268提供Science的CRISPR/cas9免费质粒加慢病毒包装) 2．实验试剂蛋白胨，酵母提取物，NaCl，1 mol/L NaOH，氨苄青霉素钠，1 mol/L IPTG(微孔滤膜过滤除菌), 30%凝胶贮液：29%丙烯酰胺，1% N,N-亚甲双丙烯酰胺；10%十二烷基硫酸钠（SDS），N,N, N’,N’-四甲基乙烯二胺（TEMED），10%过硫酸铵，标准分子量蛋白，蛋白电泳缓冲溶液：25 mmol/L Tris, 250 mmol/L 甘氨酸，0.1% SDS,pH8.3；1.5 mol/L Tris-Cl(pH8.0)，1 mol/L Tris-Cl(pH6.8),蛋白栽样缓冲液（2×）：50 mmol/L Tris-Cl(pH6.8)，100 mmol/L 二硫苏糖醇（DTT），2% SDS，10%甘油，0.1%溴酚蓝；染色液：0.2%考马斯亮蓝 R250，40%(v/v)甲醇，10%（v/v）乙酸；脱色液：40%(v/v)甲醇，10%（v/v）乙酸3．实验材料 pET-15b，pET-15bcrtE，E.coli BL21(DE3)【实验步骤】(Q往圣科技3452125268提供12万种Science的CRISPR/cas9免费质粒加慢病毒包装)1．将pET-15b，pET-15bcrtE分别转化E.coli BL21(DE3)，涂布在含100 µg/mL 氨苄青霉素钠的LB培养基平板上，37℃，培养至菌落清楚。
外源基因在大肠杆菌中表达简略实验步骤
目的基因在大肠杆菌中的诱导表达一般程序如下：获得目的基因－准备表达载体－将目的基因插入表达载体中（测序验证）－转化表达宿主菌－诱导靶蛋白的表达－表达蛋白的分析－扩增、纯化、进一步检测。
[主要试剂]1、LB培养基。
2、100mM IPTG（异丙基硫代-β-D-半乳糖苷）：IPTG溶于100ml ddH2O中,μm 滤膜抽滤，-20℃保存。
[操作步骤]1、通过PCR方法获得目的基因：以含目的基因的克隆质粒为模板，按基因序列设计一对引物（在上游和下游引物分别引入不同的酶切位点，本实验中为BamHⅠ和HiindⅢ），PCR循环获得所需基因片段。
~PCR反应体系为：PCR反应条件为：94℃变性3min；94℃变性3min、52℃复性40sec、72℃延伸1min，30个循环；最后72℃延伸8min。
2、构建重组表达载体（（1）载体酶切：将表达质粒pRSETA用限制性内切酶（同引物的酶切位点）进行双酶切，酶切产物行琼脂糖电泳后，用凝胶回收Kit或冻融法回收载体大片段。
（2）R基因PCR产物双酶切后回收，在T4 DNA连接酶作用下连接入载体。
连接反应体系为：3、获得含重组表达质粒的表达菌种（1）将连接产物转化大肠杆菌DH5α，根据重组载体的标志（抗Amp）作筛选，挑取单斑，碱裂解法小量抽提质粒，双酶切初步鉴定。
（2）测序验证目的基因的插入方向及阅读框架均正确,进入下步操作。
否则应筛选更多克隆，重复亚克隆或亚克隆至不同酶切位点。
（3）以此重组质粒DNA转化表达宿主菌BL21（DE3）的感受态细胞。
4、诱导表达；1、挑取含重组质粒的菌体单斑至2ml LB（含Amp50μg/ml）中37℃过夜培养。
2、按1∶100比例稀释过夜菌，一般将1ml菌加入到含100mlLB培养基的300ml 培养瓶中, 37℃震荡培养至OD600≌（最好，大约需3hr）。
3、取部分液体作为未诱导的对照组，余下的加入IPTG诱导剂至终浓度1mM 作为实验组，两组继续于37℃、200rpm震荡培养3hr。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
细胞周质内含有种类繁多的内毒素
5 外源基因在大肠杆菌中的表达
B 外源基因在大肠杆菌中高效表达的原理
启动子
终止子
核糖体结合位点 密码子 质粒拷贝数
启动子 启动子最佳距离的探测
A
目的基因
E
E
启动子
目的基因 E E
A 酶切开
Bal31酶解
启动子 启动子的筛选
采用鸟枪法战略，将合适大小的DNA片段
克隆到启动子探针质粒pKO1上。 受体细胞染色体DNA上的galE、galT与质
Ptac = 3 Ptrp = 11 Pla可控性： 野生型的Plac与其控制区 Olac偶联在一起，在没有
P O 诱导 基底水平转录 阻遏蛋白
诱导物存在时，操纵子
处于基底水平表达；诱
乳糖 异丙基-b-D-硫 代半乳糖苷（IPTG）
导物可以使启动子Plac介
导的转录。葡萄糖代谢使cAMP
减少，也能阻遏Plac介导的基因 转录。因此，基因工程中使用 的乳糖启动子均为抗葡萄糖代
Plac
O
高效转录
谢阻遏的突变型，即Plac UV5。
Plac UV5
O
启动子 启动子的可控性
色氨酸启动子Ptrp的可控性：
色氨酸启动子 Ptrp受色氨酸 -阻遏 蛋白复合物的阻遏，转录呈基底 状态。在培养系统中去除色氨酸 或者加入3-吲哚丙烯酸（IAA）， Ptrp 除去色氨酸 Otrp 或加3-吲哚丙烯酸 （IAA） 高效转录 Ptrp Otrp 高效转录 色氨酸 阻遏蛋白 基底水平转录
核糖体结合位点 核糖体结合位点的结构
大肠杆菌核糖体结合位点包括下列四个特征结构要素： 位于翻译起始密码子上游 10个碱基内的序列 5 ’-UAAGGAGG 3’， 即Shine-Dalgarno（SD）序列，它通过识别大肠杆菌核糖体小亚基中 的 16S rRNA 3’ 端区域 3 ’ AUUCCUCC 5’ 并与之专一性结合，将
变基因cI857控制PL。cI857阻遏蛋
白在42℃时失活脱落，PL便介导 色氨酸 表达
目的基因的表达。但在大型细菌 培养罐中迅速升温非常困难，因
此常使用一个双质粒控制系统，
Ptrp
A
PL
B
用色氨酸间接控制目的基因表达
终止子 强化转录终止的必要性
外源基因在强启动子的控制下表达，容易发生转录过头现象，即RNA聚合酶滑 过终止子结构继续转录质粒上邻近的DNA序列，形成长短不一的mRNA混合物
重组DNA技术与基因工程
1 2 3 4 5 6 重组DNA技术与基因工程的基本概念 重组DNA技术所需的基本条件 重组DNA技 外源基因在酵母中的表达
5 外源基因在大肠杆菌中的表达
A 大肠杆菌作为表达外源基因受体菌的特征
大肠杆菌表达外源基因的优势
终止子 强终止子的选择与使用
目前外源基因表达质粒中常用的终
止子是来自大肠杆菌rRNA操纵子上的
rrnT1T2以及T7噬菌体DNA上的Tf。对 于一些终止作用较弱的终止子，通常 可以采用二聚体终止子串联的特殊结 构，以增强其转录终止作用。 终止子也可以象启动子那样，通 过特殊的探针质粒从细菌或噬菌体基 基因组DNA中克隆筛选。
粒上报告基因galk的表达产物联合作用， 可将培养基中的半乳糖酵解成红色素物质
转化galE+、galT+、galK-的大肠杆菌受体菌株
终止密码子 Apr pKO1 galK
ori
含有外源启动子活性的重组克隆
启动子 启动子的构建
启动子 PlL PrecA PtraA Ptrp Plac Ptac -35 区序列 T T G A C A T T G A T A T A G A C A T T G A C A T T T A C A T T G A C A -10 区序列 G A T A C T T A T A A T T A A T G T T T A A C T T A T A A T T A T A A T
过长转录物的产生在很大程度上会影响外源基因的表达，其原因如下：
转录产物越长，RNA聚合酶转录一分子mRNA所需的时间就相应增加，外源基因 本身的转录效率下降；
如果外源基因下游紧接有载体上的其它重要基因或 DNA功能区域，如选择性标
记基因和复制子结构等，则 RNA聚合酶在此处的转录可能干扰质粒的复制及其它生 物功能，甚至导致重组质粒的不稳定性； 过长的mRNA往往会产生大量无用的蛋白质，增加工程菌无谓的能量消耗； 更为严重的是，过长的转录物往往不能形成理想的二级结构，从而大大降低外源 基因编码产物的翻译效率。
ori 筛选Apr、Tcs的转化子
Apr pCP1 Tcr
核糖体结合位点
外源基因在大肠杆菌细胞中的高效表达不仅取决于转录启动的频 率，而且在很大程度上还与mRNA的翻译起始效率密切相关。大肠杆 菌细胞中结构不同的mRNA分子具有不同的翻译效率，它们之间的差 别有时可高达数百倍。mRNA翻译的起始效率主要由其5‘ 端的结构 序列所决定，称为核糖体结合位点（RBS），大约涉及30个碱基的长 度
便可有效地解除阻遏抑制作用。
在正常的细菌培养体系中，除去 色氨酸是困难的，因此基因工程 中往往添加IAA诱导Ptrp介导的目 基因的表达。
Ptrp
Otrp
启动子 启动子的可控性
l 噬菌体启动子PlL的可控性：
噬菌体启动子PL受CI阻遏蛋白阻 遏，很难直接诱导控制。在基因 工程中常使用温度敏感型的 cI突 Ptrp A 阻遏作用 目的基因 cI857 PL B
导的转录大幅提高。
P O
高效转录
启动子 启动子的可控性
乳糖启动子Plac的可控性：
野生型的Plac上游附近拥有代谢
激活因子（ CAP ）结合区，小 分子 cAMP 激活 CAP ， CAP 结 启动子控制区，进而促进Plac介 Plac O cAMP 高效转录
CAP
葡萄糖代谢
cAMP浓度降低
基底水平转录
全基因组测序，共有4405个开放型阅读框架 基因克隆表达系统成熟完善 繁殖迅速、培养简单、操作方便、遗传稳定 被美国FDA批准为安全的基因工程受体生物
5 外源基因在大肠杆菌中的表达
A 大肠杆菌作为表达外源基因受体菌的特征
大肠杆菌表达外源基因的劣势
缺乏对真核生物蛋白质的复性功能 缺乏对真核生物蛋白质的修饰加工系统 内源性蛋白酶降解空间构象不正确的异源蛋白