大豆中脲酶活性的测定
大豆制品脲酶活性测定
（2）仪器与器皿
酸度计（pH计）：具有玻璃电极、 甘汞电极
恒温水浴：须能保持温度30±0.5℃ 试管：20×150mm并配有橡皮塞
（50mL）
（3）试剂
磷酸缓冲液0.05mol/L：称取 3.403gKH2PO4溶于100mL蒸馏水中。 再称取4.355gK2HPO4溶于100mL蒸馏 水中，合并两者并配成1000mL，用 强酸或强碱调节pH=7.0。
此时溶液应具有明亮的琥珀色； （过 段时间溶液会变为深橘红色，
可滴入稀硫酸溶液搅拌之，直至溶 液再次变为琥珀色）
（3）方法：
将一满匙样品放入表面皿中， 摊平，将以调好的尿素-酚红试剂滴 入表面皿中的样品上，直至完全浸 湿，停留5min，观察样品的颜色反 应。
如果红斑面积多于20%，则认为 该样品脲酶活性超标，为不合格产 品。
三、测定原理： 脲酶活性测定实际上是在一定条件
下(pH=7.0，T=30℃)，测定每克试 样、每分钟分解尿素所产生的氨的 量。
脲酶 NH2CONH2→→2NH3↑+CO2
•
四、测定方法： （一）定性法： 1、酚红法 （1）原理：
酚红指示剂在pH 6.4-8.2时由黄变 红，大豆制品中所含的脲酶pH=7.0， T=30℃时可将尿素水解产生氨，释 放的氨可使酚红指示剂变红，根据 变红的时间长短来判断脲酶活性的 大小。
空白试验：不加尿素，其他同上。
品质判定：如果溶液为明显的粉红 色，则认为该大豆制品脲酶活性超 标，为不合格产品。
•0-1min变红，活性非常强（＞ 1.0）；
•1-2min变红，活性大概0.5-1.0； • 2-5min变红，活性大概0.3-0.5。
（4）注意事项： • 1.粉碎样品时，不应产生大量热，
脲酶活性的测定
大豆制品中脲酶活性的测定定性法：酚红法一、原理：酚红指示剂在pH 6.4-8.2时由黄变红，大豆制品中所含的尿素酶在pH=7.0，T=30℃时可将尿素水解产生氨，释放的氨可使酚红指示剂变红，根据变红的时间长短来判断脲酶活性的大小。
二、仪器和试剂：粉碎机：粉碎时不产生强烈发热；分析天平；25ml纳式比色管；恒温水浴锅；0.1%酚红指示剂：0.1g苯酚红溶于100ml 95%乙醇溶液；结晶尿素；三、方法：将试样粉碎，准确称取0.05±0.001g试样于25ml纳式比色管，加入0.2g结晶尿素及5滴酚红指示剂，加入25ml蒸馏水，摇动10s，立即置于30±0.5℃水浴锅中，开始计时，观察溶液颜色变化， 5min 后，取出比色管，摇匀，观察溶液颜色。
空白试验：不加尿素，其他同上。
品质判定：如果溶液为明显的粉红色，则认为该大豆制品脲酶活性超标，为不合格产品。
•0-1min变红，活性非常强（＞1.0）；•1-2min变红，活性大概0.5-1.0；•2-5min变红，活性大概0.3-0.5。
四、注意事项：1.粉碎样品时，不应产生大量热，否则会影响结果判定；2.称量样品时，一定要将样品混合均匀，否则会造成试验误差；3.试样和空白试验同时操作，过程要迅速，防止时间影响。
尿素-酚红法一、原理：酚红指示剂在pH 6.4-8.2时由黄变红，大豆制品中所含的尿素酶可将尿素水解产生氨，释放的氨可使酚红指示剂变红，根据变红样品占所有样品的比例来判断脲酶活性的大小。
二、仪器和试剂：表面皿；0.2N氢氧化钠溶液：称取0.8g氢氧化钠溶于100ml蒸馏水；1.0N硫酸溶液：移取7.0ml浓硫酸溶于500ml蒸馏水；尿素-酚红试剂：用500ml烧杯将0.8g酚红溶于20ml 0.2N氢氧化钠溶液，用蒸馏水稀释至约300ml，加入60g尿素，并溶解之，转移至2L容量瓶，冲洗烧杯数次,加蒸馏水至约1.5L，加入9.4ml 1.0N 硫酸溶液，用蒸馏水定容至2L；此时溶液应具有明亮的琥珀色；（过段时间溶液会变为深橘红色，可滴入稀硫酸溶液搅拌之，直至溶液再次变为琥珀色）三、方法：将一满匙样品放入表面皿中，摊平，将以调好的尿素-酚红试剂滴入表面皿中的样品上，直至完全浸湿，停留5min，观察样品的颜色反应。
大豆制品中脲酶活性的测定
制作人：刘力、李亚杰
背景
大豆制品中含有大量抗营养因子，影响到动物的正常生长 发育。其中最主要的是胰蛋白酶抑制因子，不耐热，但在 点击添加标题 生产加工过程中，过度的加热在灭活抗营养因子的同时， 导致蛋白质变性，特别是赖氨酸、精氨酸和胱氨酸等严重 点击添加标题 变性，大大降低了大豆制品的消化率和生物学价值。抗胰 蛋白酶活性是直接反映大豆制品中抗营养因子水平及加热 程度的可靠指标，但由于该法费时、所用试剂昂贵，在生 点击添加标题 产上不适用。而脲酶活性与抗胰蛋白酶活性呈高度正相关， 方法较简便、快速、经济，国内外常用脲酶活性作为检验 点击添加标题 大豆制品加热程度和抗营养因子水平的判断指标。
注意事项
若样品粗脂肪含量高于 点击添加标题 10%，则应先进行不 加热的脱脂处理后，在测定脲酶活性； 点击添加标题 称量样品时，一定要将样品混合均匀，否则 会造成试验误差； 点击添加标题 试样和空白试验同时操作，过程要迅速，防 止时间影响。 点击添加标题
问题
反应时间（30min ）对脲酶活性是否有影响？ 点击添加标题
仪器设备
粉碎机：粉碎时应不生强热，如球 点击添加标题 磨机。
点击添加标题 点击添加标题
点击添加标题
测定步骤
样品中脲酶活性的测定：称取0.2 g（准确至0.0001 g）样品（如果活性很
高，可称取0.05 g试样）玻璃试管中，加10 mL尿素缓冲液，立即盖好试管 盖剧烈振摇后，马上置于30±0.5 ℃水浴锅内，准确计30 min±10 s。取下 点击添加标题 后立即加入10 mL盐酸（0.1 mol/L），振摇后迅速冷却至20℃，将试管内容 物全部转入50 mL烧杯中，用20 mL蒸馏水冲洗数次，以0.1 mL的氢氧化钠 标准滴定溶液用酸度计滴定至 pH 4.70。记录氢氧化钠标准滴定溶液消耗量。 点击添加标题 如果选用指示剂，试管中内容物全部移入250 mL锥形瓶中，滴加8~10滴混 合指示剂，以0.1 mol/L氢氧化钠标准滴定溶液滴定至蓝绿色，记录氢氧化 点击添加标题 钠滴定溶液消耗量。 空白测定：称取样品后立即加入10 mL盐酸溶液，之后不加。
大豆制品脲酶活性测定.
（5）计算 UA=pH(B管)-pH(A管)
2、滴定法 （1）原理： 将粉碎的大豆制品与中性尿素缓 冲溶液混合，在30℃保持30min后， 尿素酶催化尿素水解产生氨，用过 量的盐酸溶液中和氨，再用氢氧化 钠标准溶液回滴。
（2）脲酶活性定义 在30℃和pH＝7的条件下，每分 钟每克大豆制品分解尿素后，所释 放的氨态氮的毫克数。
（3）方法： 粉碎→称取0.05±0.001g→放入试 管→加入尿素0.2g、指示剂5滴→加 蒸馏水25mL→摇动10s→立即置于 30±0.5℃水浴锅→计时观察溶液变 红时间→5 min后取出试管，摇匀继 续观察
空白试验：不加尿素，其他同上。 品质判定：如果溶液为明显的粉红 色，则认为该大豆制品脲酶活性超 标，为不合格产品。 •0-1min变红，活性非常强（＞ 1.0）； •1-2min变红，活性大概0.5-1.0； • 2-5min变红，活性大概0.3-0.5。
高温、高湿、高压，粒度小，时间 长脲酶活性低。但是，加工过度， 一些氨基酸会被破坏。所以脲酶活 性过高（豆制品过生）或过低（豆 制品过熟）都表明豆制品质量较差。
三、测定原理： 脲酶活性测定实际上是在一定条件 下(pH=7.0，T=30℃)，测定每克试 样、每分钟分解尿素所产生的氨的 量。
脲酶 NH2CONH2→→2NH3↑+CO2
此时溶液应具有明亮的琥珀色； （过 段时间溶液会变为深橘红色， 可滴入稀硫酸溶液搅拌之，直至溶 液再次变为琥珀色）
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
（3）方法： 将一满匙样品放入表面皿中， 摊平，将以调好的尿素-酚红试剂滴 入表面皿中的样品上，直至完全浸 湿，停留5min，观察样品的颜色反 应。 如果红斑面积多于20%，则认为 该样品脲酶活性超标，为不合格产 品。
大豆脲酶活性的两种不同测定方法的研究
万方数据
１．３．２滴定法（国标：标准编号Ｇ１３ｆＩ＇１３５６７８７—１９９７）嗍 ①实验原理：将粉碎的大豆样品与中性尿素缓
冲液混合，在（３０±０．５）ｏＣ下保持３０ ｒａｉｎ，样品中的脲 酶催化尿素分解产生氨，用过量的盐酸中和吸收氨。 再用氢氧化钠标准溶液回滴到溶液ｐＨ值为４．７０。
摘 要 将大豆粉在１４０℃温度下热处理不同时间，用滴定法和ｐＨ增值法测定了其中脲酶活 性。结果表明，同一样品用滴定法和ｐＨ增值法测得的脲酶活性在数值上不相等，不能直接互用，但在 一定条件下可以进行数值的相互代换。
关键词大豆；脲酶活性；滴定法；ｐＨ增值法 中图分类号￥８１６．４２
大豆是优质的植物性蛋白质饲料．它含有３５％。 ４０％的蛋白质、１５％。２０％的脂肪和２０％。３０％的碳 水化合物，并含有丰富的矿物质与维生素，因此素有 “植物肉”、“绿色的牛乳”之美誉，是目前世界范围内 动物饲料原料中最常用的植物性蛋白质类饲料【ｌ】。但 同时．大豆中也含有影响动物对饲料中营养物质的消 化、吸收和利用的抗营养因子，如脲酶、胰蛋白酶抑制 因子等。并且当抗营养因子的含量超过动物的耐受范 围时还会影响到动物的健康和生产性能。为此，我国 制定了专门的国家标准，如我国《饲料用大豆》标准 （ＧＢｌ０３８４—８９）规定：“饲料用大豆需加热后使用，脲 酶活性不得超过０．４ ＮＨ３ｍｇ／（ｇ·ｍｉｎ）”；我国《饲料用 大豆饼》标准（ＧＢｌ０３７９－－８９）和《饲料用大豆粕》标准 （ＧＢｌ０３８０－－８９）规定：“大豆饼和大豆粕的脲酶活性都 不得超过０．４ ＮＨｃｎｇ／（ｇ·ｍｉｎ）”。目前，在我国较广泛 使用的脲酶活性的测定方法主要有滴定法和ｐＨ增 值法，其中，滴定法是国家标准方法（标准编号ＧＢ／Ｔ １３５６７８７－－１９９７），具有仲裁性。但是由于滴定法要求 精度高，所用试剂品种较多，且配制复杂，测定过程中 操作时间较长，操作步骤较严格，给检测人员的批次 测定带来不便，难以迅速地指导生产。所以在实际生 产中，一般多用ｐＨ增值法测定脲酶活性。ｐＨ增值法 由于测定结果的准确度和精确度都不高，因此，不具 有仲裁性。为了更好的了解两种方法的利与弊．本文
不同方法测定大豆脲酶活性的比较研究
不同方法测定大豆脲酶活性的比较研究杨奇慧舒璐钟剑锋摘要：用滴定法和增值法测定大豆粉在85℃和140℃下分别热处理0、45、90、135、180min的脲酶活性，并用0.2%KOH溶解法测定大豆粉在不同热处理下的蛋白质溶解度。
结果表明：在85℃条件下，处理0～180min 大豆粉的脲酶活性和蛋白质溶解度随着时间延长无明显变化；而在140℃条件下，大豆粉的脲酶活性和蛋白质溶解度随着处理时间的延长显著降低。
通过测定结果可见，同一样品用滴定法和增值法测得的脲酶活性在数值上不相等，不能互用，但蛋白质溶解度更能反映大豆粉受热过度的程度。
关键词：大豆粉；脲酶活性；蛋白质溶解度；pH增值法；滴定法众所周知，大豆含有较丰富的蛋白质、脂肪、碳水化合物等，是饲料生产中主要的植物蛋白质源之一，具有较高营养价值。
但是，大豆中含有多种抗营养因子，如蛋白酶抑制因子、植物凝集素、胃肠胀气因子、抗维生素因子、抗原蛋白等，这些抗营养因子阻碍营养物质在动物体内的利用，尤其是胰蛋白酶抑制因子的存在不仅会降低饲料营养成分的消化率和适口性，而且也会影响动物对蛋白质的消化吸收，对动物生长发育也产生不良的影响。
但是，胰蛋白酶抑制因子的测定较困难，而豆粕中脲酶活性与胰蛋白酶抑制因子活性呈正相关，所以通常通过测定脲酶活性来反映蛋白酶抑制因子的活性。
目前，脲酶活性的测定方法有滴定法（国标法）、pH增值法等，目前，对脲酶活性不同测定方法差异性的研究较少，本文拟对两种方法进行研究，以比较不同方法对测定结果的影响，为实际生产和理论研究提供依据和参考。
1 材料和方法1.1 实验材料大豆粉：将生大豆粉碎，过60目标准筛。
在85℃和140℃下分别处理0、45、90、135和180min冷却后装入封口袋保存备用。
1.2 化学试剂本实验所用试剂均为分析纯（AR），实验用水为蒸馏水。
1.3 测定方法1.3.1 pH增值法实验原理：将研细的试样与尿素缓冲液混合，尿素在尿素酶作用下水解产生氨，使溶液pH 值改变，改变的程度与脲酶活性大小相关，因此可以用其与空白溶液的差值表示脲酶活性高低，单位为△pH值。
大豆中脲酶活性的测定
5.计算
溶液PH值与试剂空白PH值之差即为脲酶活 性，公式如下:
UA=B-A B——B管的PH值 A——A管的PH值
滴定法
a.原理: 将粉碎的大豆制品与中性的尿酸缓冲液 混合，在30℃保持30min，尿酸酶催化尿素产生 氨，用过量的盐酸中和氨，再用氢氧化钠溶液回 滴。酶的活性用1克分析材料在30℃下1min 产 生氨态氮的毫克数表示。（mgN/g）
e.结果计算
UA＝14×C(V0-V)/(30×m) C——氢氧化钾标准溶液浓度, mol/L； V0——空白试验消耗氢氧化钾的体 积, ml； V——测定试验消耗的氢氧化钾的 体 积, ml； m——试验质量, g。
比色法
原理: 向含有EDTA二钠盐的PH=7的缓冲 液的分析悬浮液中加入尿素溶液，在30℃ 下保温5min，加入磷钨酸终止酶作用并沉 淀蛋白质。产生的氨在次溴酸钠和麝香草 酚作用下形成蓝色的靛麝香草酚，借以比 色。
快速测定方法2
在培养皿上放入少量的豆饼粕, 在样品上 滴入少量指示剂并搅拌, 将其平铺于培养皿中, 放置5min后观察结果。 无任何红点出现, 再放置25min仍然无红点出现, 说明豆粕过熟； 有少量红点出现, 说明脲酶活性较低, 豆粕可用； 样品表面有25％被红点覆盖, 豆粕可用； 样品表面有50％被红点覆盖, 应慎用； 样品表面有75％－100％被红点覆盖, 脲酶活性过 高, 豆粕过生, 不可用；
2.实验仪器与器皿
PH计，带玻璃的电极，甘汞电极，恒温 水浴，50ml试管
3.试剂
磷酸缓冲液: 称取3.403克磷酸二氢钾，溶 于100ml的水中。再称取4.335克的磷酸 氢二钾，溶于100ml的水中，合并两者并 配制成1000ml，用酸或者碱调节PH=7。
大豆制品中尿素酶活性的两种快速检测法
大豆制品中尿素酶活性的两种快速检测法饲料公司酚红法1原理酚红指示剂在pH6.4~8.2时由黄变红，大豆制品中所含的尿素酶，在室温下可将尿素水解产生氨。
释放的氨可使酚红指示剂变红，根据变红的时间长短来判断尿素酶活性的大小。
2仪器和试剂2.1粉碎装置粉碎时应不产生强烈发热（如研钵、球磨机）；2.2天平感量0.01 g；2.3 试管直径18 mm，150 mm；2.4尿素；2.5酚红试剂1g/L乙醇溶液。
3测定步骤将试样研细，称取0.02 g试样，称准至0.01 g，转入试管中。
加入0.02 g结晶尿素及2滴酚红指示剂，加20~30 mL蒸馏水，摇动10 s。
观察溶液颜色，并记下呈粉红色的时间。
4尿素酶活性的测定结果表示1 min内呈粉红色为：活性很强；1~5 min内呈粉红色为：活性强；5~15 min内呈粉红色为：有点活性；15~30 min内呈粉红色为：没有活性。
注：通常，10 min以上不显粉红色或红色的大豆制品，其尿素酶活性即认为合格。
饲料公司pH-增值法本法是美国、日本和前苏联等国常用方法。
尿素水解释放的氨是碱性的，可使溶液pH值升高。
试样反应30 min后，与空白溶液的pH之差数，可间接用来表示氨量的多少。
1. 仪器设备1.1 恒温水浴须能保持温度于30℃±0.5℃；1.2 酸度计（pH计）具有玻璃电极、甘汞电极、可测试5 mL 的溶液。
此为一种精密仪器，须装有温度补正器，其敏感度应为±0.02 pH单位或更佳。
仪器操作及pH值测定均应依照制造商的说明，该pH计应在测定前以标准缓冲液加以校正。
1.2试管20 mm×150 mm并配有橡皮塞。
2. 试剂2.1 取0.05 mol/L磷酸盐缓冲液溶解3.403 g磷酸二氢钾（KH2PO4）于约100 mL新蒸馏水中，溶解4.335 g磷酸氢二钾（K2HPO4）于约100 mL的蒸馏水中，然后将此两种溶液合并配成1000 mL。
脲酶活性的测定
2、空白试验： 准确称取0.200±0.001g样品于 称量瓶中，加入10ml0.05mol/L磷 酸盐缓冲溶液，加塞混合，置于 30℃水浴中。
3、样品试验与空白试验的制备应相 隔5分钟，并且每隔5分钟搅拌内 容物一次。
4、30分钟后，相隔5分钟将样品与空 白试验的称量瓶从水浴中取出，将 上层液体移入5ml烧杯中，在从水 浴中取出刚达5分钟时，分别测定 此种上层液体的PH值。
六、结果的计算
1பைடு நூலகம்计算公式：
样品试验的PH值与空白试验的PH值 两者之间的差异，则为脲酶活性的指数， 即：
脲酶活性 = 试样的PH测定值-空白的PH测定值
2、重复性：
每个样品应取两个平行样测定， 以其算术平均值为结果。
七、注意事项
1、关于酸度计的使用
2、称量瓶应塞紧 3、关于固定质量称量法 4、通常： 0.02<△PH≤0.3 加工适度 △PH<0.02 加工过度 △PH>0.3 加工不够 BACK
三、仪器及试剂
1、仪器
分析天平、样品粉碎机、样品分析 筛、恒温水浴、酸度计、称量瓶、 移液管、角匙等
2、试剂
0.05mol/L磷酸盐缓冲液、尿素缓 冲溶液等
四、试样的选取和制备
选取具有代表性的试样，粉碎至40 目，用“四分法”缩减至200～300g， 密闭保存，以防试样组分变化或变质。
五、测定步骤
实验三 大豆制品中脲酶活性的测定
2010.10.30
一、实验目的
1、掌握大豆制品中脲酶活性的测 定原理 2、熟悉掌握用PH增值法测定大豆 制品中脲酶活性
大豆制品脲酶活性测定解读
样品粉碎：至少60%通过400微米 试验筛。 （4）操作步骤 准确称取0.400±0.00lg样品2份， 分别置于2支试管中。一支试管加入 20mL磷酸缓冲液，作为空白试验（A 管），另一支加入20mL尿素缓冲液 （B管）。
盖塞混匀，在30℃恒温水浴中准 确保持30min。在此期间，每隔5min 摇匀一次。取出立即在流水中冷却， 5min内测定溶液pH值。
（4）注意事项： • 1.对于样品较粗、具有大块状的样品， 最好将其稍微粉碎，亦不可太细， 否则不容易观察； • 2.样品一定要铺平，容易观察； • 3.溶液保质期为3个月，最好1个月内 用完； • 4.此方法容易受颗粒度影响。
（二）定量法 1、 pH增值法 （1）原理： 脲酶水解尿素产生氨，使溶液的 pH值升高，通过测定样品溶液的pH 值和空白的pH值之差来计算脲酶的 活性。脲酶活性定义为：在30℃和 pH=7的条件下，每分钟每克大豆制 品分解尿素后所释放的氨态氮的毫 升数。
高温、高湿、高压，粒度小，时间 长脲酶活性低。但是，加工过度， 一些氨基酸会被豆制品质量较差。
三、测定原理： 脲酶活性测定实际上是在一定条件 下(pH=7.0，T=30℃)，测定每克试 样、每分钟分解尿素所产生的氨的 量。
脲酶 NH2CONH2→→2NH3↑+CO2
（5）计算 UA=pH(B管)-pH(A管)
2、滴定法 （1）原理： 将粉碎的大豆制品与中性尿素缓 冲溶液混合，在30℃保持30min后， 尿素酶催化尿素水解产生氨，用过 量的盐酸溶液中和氨，再用氢氧化 钠标准溶液回滴。
（2）脲酶活性定义 在30℃和pH＝7的条件下，每分 钟每克大豆制品分解尿素后，所释 放的氨态氮的毫克数。
（3）方法： 粉碎→称取0.05±0.001g→放入试 管→加入尿素0.2g、指示剂5滴→加 蒸馏水25mL→摇动10s→立即置于 30±0.5℃水浴锅→计时观察溶液变 红时间→5 min后取出试管，摇匀继 续观察
大豆脲酶活性的两种不同测定方法的研究
烈摇 动， 于（０ ０５ ）ｃ 置 ３ ± ． ｃ恒温水 浴中 ， ０ 每隔 ５ｍ ｎ振摇 ｉ
王忠艳 ， 单位及 通讯地址 同第一作者。
收稿 日期 ：０ ７ ２ ｌ ２ ｏ 一ｌ 一 ０
因子 等 ． 且 当 抗 营 养 因子 的 含 量 超 过 动 物 的 耐 受 范 并 围时 还 会 影 响 到 动 物 的 健 康 和 生 产 性 能 。 为 此 ． 国 我
１ 大 豆 粉 样 品 ． １将 普通 市售生 大豆粉 碎 （ 非强 热 ） ４ 过 ０目标 准分 析 筛 。在 １０ｃ 分 别 处 理 ０ ３ ６ ９ １ 、５ １ 、 １ ４ｃ下 、 、 、 、２ １ 、８ ２ 、
测定 ， 可及 时修 订配合 饲料生 产过程 中对大 豆及其 制
品 的正 确 加工 及使 用方 法 ． 经济 、 有效 地 消 除抗 营养
因 子 的 抗 营养 作 用 。
１ 材 料 与 方 法
同时 ， 大豆 中也含有 影响 动物对饲 料 中营养物 质的消 化、 吸收和利 用 的抗 营养 因子 ， 如脲 酶 、 蛋 白酶 抑制 胰
（ Ｂ１３ ４ ８ ） 定 ： 饲 料 用 大 豆 需 加 热 后 使 用 ， ６ 、２ ７ 、８ ８ 、４ ８ ｉ ， Ｇ ０ ８－ ９ 规 “ 脲 ９ ７ 、５ ７ 、 １８ 、７ｍ ｎ 冷却 后装入封 口袋备用 。
１２ 化 学 试 剂 ．
大豆 饼 》 准 （Ｂ ０ ７ － ８ ） 《 料用 大豆 粕 》 准 标 Ｇ １ ３９ ９和 饲 标 ｆ Ｂ ０ ８ － ８） Ｇ １３ ０ ：９规定 ：大 豆饼 和大 豆粕 的脲 酶活 性都 － － “
２ ２ ３ ３ ３ ３ ４２、 ５、 ８、 ４、 ７、 ０、 ３、 ６、 ９、 ４ ４ ５１、４ 、 ７、 ０、 ３、 ６、 ５ ５ ６ ６ ６
大豆制品中尿素酶活性测定方法_1
大豆制品中尿素酶活性测定方法中华人民共和国专业标准蛋白酶活力测定法ZBX66030-87Measurementofproteinaseactivity本方法适用于酿造酱油时在制品菌种、成曲的蛋白酶活力测定。
1福林法试剂及溶液:以下试剂都为分析纯福林试剂(Folin试剂):于2000mL磨口回流装置内,加入钨酸钠(Na2WO4·2H2O)100g,钼酸钠(Na2MoO4·2H2O)25g,蒸馏水700mL,85%磷酸50mL,浓盐酸100mL,文火回流10h。
取去冷凝器,加入硫酸锂(Li2SO4)50g,蒸馏水50mL,混匀,加入几滴液体溴,再煮沸15min,以驱逐残溴及除去颜色,溶液应呈黄色而非绿色。
若溶液仍有绿色,需要再加几滴溴液,再煮沸除去之。
冷却后,定容至1000mL,用细菌漏斗(No4～5)过滤,置于棕色瓶中保存。
此溶液使用时加2倍蒸馏水稀释。
即成已稀释的福林试剂。
碳酸钠溶液:称取无水碳酸钠(Na2CO3),定容至1000mL。
三氯乙酸(TCA)溶液:称取三氯乙酸(CCL3COOH),定容至1000mL。
磷酸盐缓冲液:称取磷酸二氢钠(NaH2PO4·2H2O),定容至1000mL,即成溶液(A液)。
称取磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O),定容至1000mL,即成溶液(B液)。
取A液28mL和B液72mL,再用蒸馏水稀释1倍,即成的磷酸盐缓冲液。
2%酪蛋白溶液:准确称取干酪素2g,称准至,加入氢氧化钠10mL,在水浴中加热使溶解(必要时用小火加热煮沸),然后用磷酸盐缓冲液定容至100mL即成。
配制后应及时使用或放入冰箱内保存,否则极易繁殖细菌,引起变质。
100μg/mL酪氨酸溶液:精确称取在105℃烘箱中烘至恒重的酪氨酸,逐步加入6mL1N盐酸使溶解,用盐酸定容至100mL,其浓度为1000μg/mL,再吸取此液10mL,以盐酸定容至100mL,即配成100μg/mL的酪氨酸溶液。
06[1].8大豆制品中脲酶活性的测定
![06[1].8大豆制品中脲酶活性的测定](https://img.taocdn.com/s3/m/c2d680c44028915f804dc2f7.png)
1适用范围本标准适用于由大豆制得的产品和副产品中尿素酶活性的测定。
本法可确认大豆制品的湿热处理程度。
2参考标准GB8622 -883定义本标准所指尿素酶活性定义如下：在30±0.5℃和pH7的条件下，每分钟每克大豆制品分解尿素所释放的氨态氮的毫克数。
4原理将粉碎的大豆制品与中性尿素缓冲溶液混合，在30℃保持30 min，尿素酶催化尿素水解产生氨的反应。
用过量盐酸中和所产生的氨，再用氢氧化钠标准溶液回滴。
5仪器设备5.1样品筛：孔径200 μm；5.2酸度计：精度0.02 pH，附有磁力搅拌器和滴定装置；5.3恒温水浴：可控温30±0.5℃；5.4试管：直径18 mm，长150 mm，有磨口塞子；5.5精密计时器；5.6粉碎机：粉碎时应不生强热（例如球磨机）；5.7分析天平：感量0.1 mg；5.8移液管：10 mL。
6试剂和溶液6.1尿素（GB 696—77）：分析纯；6.2磷酸氢二钠（GB 1263—77）：分析纯；6.3磷酸二氢钾（GB 1274—77）：分析纯；6.4尿素缓冲溶液（pH6.9至7.0）：4.45 g磷酸氢二钠（5.2）和3.40 g磷酸二氢钾（5.3）溶于水并稀释至1000 mL，再将30 g尿素（5.1）溶在此缓冲溶液中，可保存1个月。
6.5盐酸（GB 622—77）：分析纯，c（HCl）＝0.1 mol/L溶液；6.6氢氧化钠（GB 629—77）：分析纯，c（NaOH）＝0.1 mol/L标准溶液，按GB 601标准溶液制备方法的规定配制。
7试样的制备用粉碎机（4.6）将10 g试样粉碎，使之全部通过样品筛（4.1）。
对特殊试样（水分或挥发物含量较高而无法粉碎的产品）应先在实验室温度下进行预干燥，再进行粉碎，当计算结果时应将干燥失重计算在内。
8测定步骤称取约0.2 g已粉碎的试样，称准至0.1 mg，转入试管（4.4）中（如活性很高只称0.05 g试样），移入 10 mL尿素缓冲溶液（5.4），立即盖好试管并剧烈摇动，马上置于30±0.5℃恒温水浴（4.3）中，准确计时保持30 min。
大豆制品脲酶活性测定 PPT
（4）注意事项： • 1.粉碎样品时，不应产生大量热，
否则会影响结果判定； • 2.称量样品时，一定要将样品混合
均匀，否则会造成试验误差； • 3.试样和空白试验同时操作，过程
要迅速，防止时间影响。
2、尿素酚红法 （1）原理：酚红指示剂在pH 6.4-8.2
时由黄变红，大豆制品中所含的尿 素酶可将尿素水解产生氨，释放的 氨可使酚红指示剂变红，根据变红 样品占所有样品的比例来判断脲酶 活性的大小。
（2）仪器和试剂： • 粉碎机：粉碎时不产生强烈发热 • 分析天平：感量0.01g • 25ml纳式比色管 • 恒温水浴锅 • 0.1%酚红指示剂：0.1g苯酚红溶于
100ml 95%乙醇溶液 • 结晶尿素：分析纯
（3）方法：
粉碎→称取0.05±0.001g→放入试 管→加入尿素0.2g、指示剂5滴→加 蒸馏水25mL→摇动10s→立即置于 30±0.5℃水浴锅→计时观察溶液变 红时间→5 min后取出试管，摇匀继 续观察
大家有疑问的，可以询问和交流
可以互相讨论下，但要小声点
空白试验：不加尿素，其他同上。
品质判定：如果溶液为明显的粉红 色，则认为该大豆制品脲酶活性超 标，为不合格产品。
•0-1min变红，活性非常强（＞ 1.0）；
•1-2min变红，活性大概0.5-1.0； • 2-5min变红，活性大概0.3-0.5。
（4）注意事项： • 1.对于样品较粗、具有大块状的样品，
最好将其稍微粉碎，亦不可太细， 否则不容易观察； • 2.样品一定要铺平，容易观察； • 3.溶液保质期为3个月，最好1个月内 用完； • 4.此方法容易受颗粒度影响。
脲酶活性的测定
Department of Animal science
动物营养与饲料学
脲酶测定
4、30分钟后，相隔5分钟将样品与空 白试验的称量瓶从水浴中取出，将 上层液体移入5ml烧杯中，在从水 浴中取出刚达5分钟时，分别测定 此种上层液体的PH值。
●
Department of Animal scien握大豆制品中脲酶活性的测 定原理 2、熟悉掌握用PH增值法测定大豆 制品中脲酶活性
●
Department of Animal science
动物营养与饲料学
脲酶测定
二、 测定原理
将粉碎的大豆制品与中性尿素缓冲溶 液混合，在30℃保持30分钟，尿素酶催化 尿素水解产生氨，由于尿素水解释放的氨 是碱性的，可使溶液PH值升高，试样溶液 与空白溶液的PH值之差，即可间接表示出 氨量的多少。 NH2CONH2+ 尿素酶 2NH3 ↑ + CO2
BACK
动物营养与饲料学
脲酶测定
●
Department of Animal science
七、注意事项
1、关于酸度计的使用
●
Department of Animal science
动物营养与饲料学
脲酶测定
2、称量瓶应塞紧 3、关于固定质量称量法 4、通常： 0.02<△PH≤0.3 加工适度 △PH<0.02 加工过度 △PH>0.3 加工不够
●
Department of Animal science
动物营养与饲料学
脲酶测定
六、结果的计算
1、计算公式：
样品试验的PH值与空白试验的PH值 两者之间的差异，则为脲酶活性的指数， 即：
脲酶活性 = 试样的PH测定值-空白的PH测定值
10大豆制品中尿素酶活性测定方法GBT8622-1988(精)
• 3 原理 将粉碎的大豆制品与中性尿素缓冲溶液 混合，在30℃保持30min，尿素酶催化尿 素水解产生氨的反应。用过量盐酸中和 所产生的氨，再用氢氧化钠标准溶液回 滴。
• 4 仪器设备 4.1 样品筛：孔径200m； 4.2 酸度计：精度0.02pH，附有磁力搅 拌器和滴定装置； 4.3 恒温水浴：可控温（30±0.5）℃； 4.4 试管：直径18mm，长150mm，有磨口 塞子； 4.5 精密计时器； 4.6 粉碎机：粉碎时应不生强热（例如 球磨机） 4.7 分析天平：感量0.0001g； 4.8 移液管：10mL。
• 6 试样的制备 用粉碎机将10g试样粉碎，使之全部 通过样品筛。对特殊试样（水分或挥发 物含量较高而无法粉碎的产品）应先在 实验室温度下进行预干燥，再进行粉碎， 当计算结果时应将干燥失重计算在内。
• 7 测定步骤 称取约0.2g已粉碎的试样，称准至0.1mg， 转入试管中（如活性很高只称0.05g试样）, 移入10mL尿素缓冲溶液，立即盖好试管并 剧烈摇动，马上置于（30±0.5）℃恒温水 浴中，准确计时保持30min。即刻移入10mL 盐酸溶液，迅速冷却到20℃。将试管内容 物全部转入烧杯，用5mL水冲洗试管两次， 立即用氢氧化钠标准溶液滴定至pH4.70。
10 大豆制品中尿素酶活性测定方法
GB/T 8622-1988
• 1 适用范围 本标准适用于由大豆制得的产品和副产品中 尿酶活性的测定。本法可确认大豆的湿热处 理程度。 • 2 定义 本标准所指尿素酶活性定义如下：在 （30±0.5）℃和pH7的条件下，每分钟每克 大豆制品分解尿素所释放的氨态氮的毫克数。
• 5 试剂和溶液 5.1 尿素：分析纯； 5.2 磷酸氢二钠：分析纯； 5.3 磷酸二氢钾：分析纯； 5.4 尿素缓冲溶液(pH6.9至7.0):4.45g磷 酸氢二钠和3.40g磷酸二氢钾溶于水并稀释 至1000mL，再将30g尿素溶在此缓冲溶液中， 可保存1个月。 5.5 盐酸：分析纯，c（HCL）=0.1mol/L 溶液； 5.6 氢氧化钠：分析纯，c(NaOH)=0.1 mol/L 标准溶液。
大豆中尿酶活性的测定原理
大豆中尿酶活性的测定原理
大豆中尿酶活性的测定原理基于尿酶催化尿素分解产生氨和二氧化碳的反应。
其测定步骤如下：
1.取适量大豆样品，加入磷酸盐缓冲液中，使其均匀混合。
2.分别加入尿素和尿酰酸，使其与大豆中的尿酶反应。
3.等待一定时间后，加入酚和氯化铁，使其产生褐色化合物，然后用紫外光谱仪测量其吸光度。
4.根据标准曲线计算大豆中尿酶的活性。
其中，尿酸的浓度会随着尿酶的活性增加而降低，而产生的氨和二氧化碳则随同反应中的尿酶一同释放出来。
通过相应的化学反应，可以将其转化为吸光度可测量的化合物，最终得到尿酶的活性值。
大豆脲酶实验报告
一、实验目的1. 了解大豆脲酶的提取方法和纯化过程；2. 探究大豆脲酶的活性变化；3. 分析大豆脲酶在不同条件下的稳定性。
二、实验方法1. 实验材料：大豆、蒸馏水、NaCl、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、pH缓冲液、脲、考马斯亮蓝G-250、酶活性测定试剂盒等。
2. 实验步骤：（1）大豆脲酶的提取：称取一定量的大豆，用蒸馏水浸泡过夜，研磨成匀浆，加入适量的磷酸氢二钠和磷酸二氢钠溶液，调节pH至7.0，离心取上清液，即为大豆脲酶粗提液。
（2）大豆脲酶的纯化：取大豆脲酶粗提液，依次用不同浓度的NaCl溶液进行盐析，收集沉淀，复溶于磷酸缓冲液，重复上述操作，直至达到所需纯度。
（3）大豆脲酶的活性测定：采用酶活性测定试剂盒，测定大豆脲酶在不同浓度脲溶液中的活性，以脲的消耗量作为酶活性的指标。
（4）大豆脲酶在不同条件下的稳定性研究：将纯化后的大豆脲酶置于不同pH、温度、离子强度条件下，观察酶活性的变化。
三、实验结果1. 大豆脲酶的提取与纯化：经过提取和纯化，得到纯度较高的大豆脲酶。
2. 大豆脲酶的活性变化：在脲浓度为0.1-1.0 mmol/L时，大豆脲酶活性随脲浓度增加而增强，当脲浓度超过1.0 mmol/L时，酶活性逐渐降低。
3. 大豆脲酶在不同条件下的稳定性：（1）pH稳定性：在pH 6.0-8.0范围内，大豆脲酶活性较高，当pH低于5.0或高于9.0时，酶活性显著降低。
（2）温度稳定性：在37℃时，大豆脲酶活性最高，随着温度升高，酶活性逐渐降低，当温度超过60℃时，酶活性基本消失。
（3）离子强度稳定性：在离子强度为0.1-1.0 mol/L范围内，大豆脲酶活性较高，当离子强度超过1.0 mol/L时，酶活性显著降低。
四、讨论1. 大豆脲酶提取与纯化过程中，采用盐析法可以有效去除杂质，提高酶的纯度。
2. 大豆脲酶活性受脲浓度、pH、温度和离子强度等因素的影响，本研究结果表明，大豆脲酶在适宜的条件下具有较高的活性。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
豆粕的蛋白质含量为45%左右，是一 种优质的蛋白质饲料，但是由于其中的抗 营养因子较多，极大的限制了豆粕在饲料 中的应用。
大豆中的抗营养因子
胰蛋白酶抑制剂 植物红细胞凝集素 皂甙 胃肠胀气因子 植酸 抗维生素 致甲状腺肿因子
这些抗营养因子大多是不耐热的，
在大豆饼粕的加工过程中由于加热而失 活，从而降低或者失去其有害作用 ，因 此，在大豆加工生产饲用饼粕时，必须 对大豆粕进行充分而又适当的加热，这 样才能使其中的抗营养因子失活 。
评价大豆饼粕的指标
脲酶活性： 检测豆粕的加热程度是否足以 破坏其中的抗营养因子的指标。 蛋白质溶解度：反映豆粕是否加热过度的 一个指标。
快速测定方法1
酚红法
称取0.2克的样品于试管中，加入 0.2克的尿素，再加入2滴酚红指示剂及 20ml蒸馏水，摇动10分钟，观察溶液的 颜色。 1分钟内呈粉红色，脲酶活性很强； 1-5分钟呈粉红色，脲酶活性强； 5-15分钟呈粉红色，活性有点强； 15-30无色，没有活性。 通常10分钟以上不显粉红色的大豆 饼粕其脲酶活性丧失。
c.试剂：尿素 磷酸氢二钠 磷酸二氢钾 尿素缓冲液（PH6.9至7.0） 4.45克磷酸 氢二钠和3.40克的磷酸二氢钾溶于水并稀 释至1000ml，再将30克尿素溶于此缓冲 液中。 盐酸 氢氧化钠 0.1mol/L标准溶液
操作方法
称取0.2克已粉碎的样品，转入试管中， 加入10ml的尿素缓冲液，立即盖好试管并剧烈 振动，马上置于30℃的恒温水浴中，准确计时 保持30分钟。然后加入10ml0.1mol/L盐酸溶液， 迅速冷却到20℃，将试管内容物全部转入烧杯， 用5ml水冲洗试管2－3次，立即用标准氢氧化 钾标准液滴定至PH=4.70。 另取试管作为空白管，加入10ml的尿素缓 冲液，然后加入10ml0.1mol/L盐酸溶液。称取 与上述试样量相当的试样，迅速加入此试管中， 立即盖好试管并剧烈振动，马上置于30℃的恒 温水浴中，准确计时保持30分钟，冷却到20℃， 将试管内容物全部转入烧杯，用5ml水冲洗试 管2－3次，立即用标准氢氧化钾标准液滴定至 PH=色法 滴定法 PH增值法 快速检测法
PH增值法
1.实验原理： 脲酶水解尿素产生氨，使溶液的PH值 升高，通过测定样品溶液的PH值和空白的 PH值之差来计算尿酶活性。脲酶活性定义 为：在30 摄氏度和PH为7的条件下，每分 钟每克大豆制品分解尿素后，所释放的氨 态氮的毫升数。
2.实验仪器与器皿 PH计，带玻璃的电极，甘汞电极，恒温 水浴，50ml试管 3.试剂 磷酸缓冲液：称取3.403克磷酸二氢钾， 溶于100ml的水中。再称取4.335克的磷 酸氢二钾，溶于100ml的水中，合并两者 并配制成1000ml，用酸或者碱调节PH=7。 尿素缓冲液：称取15克尿素，溶于500ml 磷酸缓冲液中，调节PH=7
4.操作步骤
准确称取0.4克样品2份，分别置于2支试
管中。一支试管加入20ml 的磷酸缓冲液，作为
空白试验（A管），另一支加入20ml尿素缓冲
液（B管）。盖塞混匀，在30℃恒温水浴中准
确保持30min。在此期间，每隔5min摇匀一次。
取出立即在流水中冷却，5min内测定溶液的
PH值。
5.计算
溶液PH值与试剂空白PH值之差即为脲酶活 性，公式如下： UA=B-A B——B管的PH值 A——A管的PH值
滴定法
a.原理：将粉碎的大豆制品与中性的尿酸 缓冲液混合，在30℃保持30min，尿酸酶 催化尿素产生氨，用过量的盐酸中和氨， 再用氢氧化钠溶液回滴。酶的活性用1克 分析材料在30℃下1min 产生氨态氮的毫 克数表示。（mgN/g） b.仪器与器皿：样品筛，酸度计，恒温水 浴锅，试管，10ml移液管
快速测定方法2
在培养皿上放入少量的豆饼粕，在样品上 滴入少量指示剂并搅拌，将其平铺于培养皿中， 放置5min后观察结果。 无任何红点出现，再放置25min仍然无红点出 现，说明豆粕过熟； 有少量红点出现，说明脲酶活性较低，豆粕可 用； 样品表面有25％被红点覆盖，豆粕可用； 样品表面有50％被红点覆盖，应慎用； 样品表面有75％－100％被红点覆盖，脲酶活 性过高，豆粕过生，不可用；
e.结果计算
UA＝14×C(V0-V)/(30×m) C——氢氧化钾标准溶液浓度， mol/L； V0——空白试验消耗氢氧化钾的体 积， ml； V——测定试验消耗的氢氧化钾的 体 积，ml； m——试验质量，g。
比色法
原理：向含有EDTA二钠盐的PH=7的缓 冲液的分析悬浮液中加入尿素溶液，在 30℃下保温5min，加入磷钨酸终止酶作 用并沉淀蛋白质。产生的氨在次溴酸钠和 麝香草酚作用下形成蓝色的靛麝香草酚， 借以比色。