啤酒酵母的蔗糖酶的提取提纯及测定
实验3 酵母蔗糖酶的制备
实验3 酵母蔗糖酶的制备一、实验目的1、学习、掌握提取啤酒酵母中的蔗糖酶2、学习用紫外分光光度法测定蛋白质含量二、实验原理酵母中得到，特异地催化非还原糖中的α—呋喃果糖苷键水解，具有相对专一性。
不仅能催化蔗糖水解生成葡萄糖和果糖，也能催化棉子糖水解，生成密二糖和果糖。
啤酒酵母中含有大量的蔗糖酶，通过研磨破细胞壁，使酶游离出来，用水萃取酶，然后用有机溶剂沉淀酶蛋白得到粗制品，还可用柱层折进一步纯化得到精制品。
三、实验器材1、试剂：二氧化硅、去离子水(使用前冷至4℃左右)、冰块、食盐、1mol/L乙酸、95％乙醇。
2、材料：啤酒酵母、3、仪器：研体、恒温水浴锅、高速冷冻离心机。
四、实验步骤1 研磨水提取(1)准备一个冰浴，将研钵稳妥地放入冰浴中。
(2)称取1g啤酒醉母和适量(约5mg)二氧化硅一起放入研钵中，二氧化硅要预先研细。
(3)缓慢加入预冷的30m1去离子水．每次加2m1左右，边加边研磨．至少用30分钟，至酵母细胞大部分研碎，将蔗糖酶充分转入水相。
(4) 将混合物转入离心管中，平衡后．用高速冷冻离心机离心，4℃，10000r／min，离心15min。
(5) 用滴管小心地取出水相，转入另一个清洁的离心管中，4℃，10000r／min，离心15min。
(6) 将上清液转入量筒，量出体积。
用广泛pH试纸检查上清液PH，用lmol/L乙酸将pH调至5.0，称为“级分I”。
（级分I总共量了28ml）留出5m1测定酶活力及蛋白含量，剩余部分转入清洁离心管中。
2 热处理和乙醇沉淀(1)预先将恒温水浴调到50℃，将盛有级分I的离心管稳妥地放入水浴中，50℃下保温30min,在保温过程中不断轻摇离心管。
(2)取出离心管，于冰浴中迅速冷却，4℃．10000r／min，离心10min 。
(3)将上清液转入小烧杯中，放人冰盐浴(没有水的碎冰撒入少量食盐)，缓慢地加入等体积预冷至—20℃的95％乙醇，同时轻轻搅拌．再在冰盐浴中放置l0min、以沉淀完全。
酵母蔗糖酶提取纯化及酶活测定的改进方法
一、背景介绍酵母蔗糖酶是一种重要的酶类，它在葡萄糖代谢途径中起着关键作用。
酵母蔗糖酶的提取纯化及酶活测定是生物化学与分子生物学研究中常见的实验操作。
在这个过程中，酵母蔗糖酶的纯化程度和酶活测定的准确性直接影响着后续的实验结果。
二、传统提取纯化及酶活测定方法存在的问题1. 低纯度：传统的提取纯化方法往往不能够完全去除其他蛋白质或杂质，导致提取的酵母蔗糖酶纯度较低。
2. 酶活测定不精准：常见的酶活测定方法对于活性较低的酶样本测定效果较差，难以得到准确的酶活性数据。
3. 操作繁琐：传统方法需要多次离心、沉淀和洗涤等步骤，耗时且操作繁琐。
三、改进方法鉴于传统方法存在的问题，我们提出了一种改进的酵母蔗糖酶提取纯化及酶活测定方法，主要包括以下几个关键步骤：1. 酵母蔗糖酶提取（1）酵母细胞破碎：采用超声波破碎或高压破碎技术，将酵母细胞有效破碎，释放出蔗糖酶。
（2）蛋白质沉淀：利用差速离心法或特定沉淀剂沉淀出目标蛋白质，提高酶的纯度。
2. 酶活测定（1）比色法测定：采用改良的Folin-Phenol比色法，提高对酶活性的测定准确性。
（2）酶活性计算：采用新的酶活性计算公式，更准确地反映酶的活性水平。
四、结果与讨论我们采用改进方法对酵母蔗糖酶进行提取纯化及酶活测定，得到的结果表明，与传统方法相比，改进方法在以下几个方面有了显著改善：1. 提取纯化效果显著：采用改进方法提取的酵母蔗糖酶纯度明显提高，杂质含量大幅降低。
2. 酶活测定更准确：采用改进方法测定的酶活性数据更为准确可靠，对活性较低的酶样本也能够进行精准测定。
3. 操作简便高效：改进方法简化了提取纯化的操作步骤，减少了操作时间，提高了实验效率。
五、结论我们的改进方法在酵母蔗糖酶提取纯化及酶活测定中取得了良好的效果，显著提高了酶的纯度和活性测定的准确性，为相关领域的研究提供了重要的实验技术支持。
该方法的推广应用将有助于推动相关研究领域的发展，促进酵母蔗糖酶的深入研究和应用。
从啤酒酿造酵母中提取蔗糖酶及酶的性质研究
质 进 行 了研 究 。
ห้องสมุดไป่ตู้
关键词 ： 酵母 ； 蔗糖酶 ； Ｓ ＤＳ法提 取 ； 酶｝ 生 质 中 图分 类 号 ： Ｔ Ｓ ２ ６ １ ． １ １ ； Ｔ Ｓ ２ ６ １ ． ９ ； Ｔ Ｓ ２ ０ １ ． ２ 文献 标 识 码 ： Ｂ
Ｒｅ ｓ ｅ ａ ｒ ｃ ｈ ｏ ｎ Ｅｘ ｔ ｒ ａ ｃ ｔ ｉ ｏ ｎ Ｔ ｅ ｃ ｈ ｎ ｏ ｌ ｏ ｇ ｙ ａ ｎ ｄ Ｅ ｎ ｚ ｙ ｍｅ Ｑｕ ａ ｌ ｉ ｔ ｙ ｏ ｆ Ｉ ｎ ｖ ｅ ｒ ｔ ａ ｓ ｅ Ｆ ｒ ｏ ｍ
ｅ ｎ ｚ ｙ ｍｅ ｏ ｂ ｔ ａ ｉ ｎ ｅ ｄ ｗ ａ ｓ ｐ ｒ ｅ ｃ ｉ ｐ ｉ ｔ ａ ｔ ｅ ｄ ｂ ｙ ｅ ｔ ｈ ａ ｎ ｏ ｌ ， ａ ｎ ｄ ｕ ｓ ｅ ｄ Ｑ － Ｓ ｅ ｐ ｈ ａ ｒ ｏ ｓ ｅ Ｆ Ｆ ａ ｎ ｉ ｏ ｎ — ｅ ｘ ｃ ｈ ａ ｎ ｇ ｅ ｃ ｏ ｌ ｕ ｍ ｎ ｃ ｈ ｒ ｏ ｍａ ｔ ｏ ｇ ｒ ａ ｐ ｈ ｙ ｍ ｅ ｔ ｈ ｏ ｄ ｏ ｆ ｉ ｎ ｃ ｒ ｅ ａ ｓ ｉ ｎ ｇ
关于蔗糖酶活性的研究 生物化学实验
对啤酒酵母的蔗糖酶的相关测试与研究兰德新（同组：李建鑫）浙江工业大学海洋学院食工1201摘要：目的学习测试与研究蔗糖酶的相关技术，以20克新鲜啤酒酵母菌为原料进行一系列实验。
方法蔗糖酶的提取及初步提纯，蔗糖酶的纯化——Q Sepharose-柱层析法，蔗糖酶活力的测定，Folin-酚法测定蔗糖酶蛋白质含量测定及比活力计算，微量凯氏定氮法测蔗糖酶中总蛋白氮，SDS-PAGE测定蔗糖酶中蛋白质的相对分子质量。
结果通过这一阶段性的综合实验，学会了提取及初步提纯酶及胞内酶的提纯，酶活力的测定方法，蛋白质的测定方法和蛋白质相对分子质量的测定方法。
为我们将来的实验奠定了技术上的基础。
关键词：蔗糖酶，Q Sepharose-柱层析法，酶活力，Folin-酚法，微量凯氏定氮法，SDS-PAGE文献综述:蔗糖酶能催化水解蔗糖生成果糖和葡萄糖，果糖的甜度较高，约为蔗糖的1.36~1.60倍，在工业上具有较高的经济价值，葡萄糖也是我们的主要碳源，并且在植物中蔗糖酶分解的果糖和葡萄糖能为植物的生长和发育提供碳源和能源。
因此人们对蔗糖酶的研究越来越多，做了很多的实验来研究蔗糖酶的性质[2] , 其中在“蔗糖酶水解蔗糖的研究”这篇文章中，作者通过一系列对比实验，得出蔗糖酶的几个性质如下：蔗糖酶的活性达1.575×105u/ml；其表观Km（米氏常数）值约为0.015mol/1；初速度反应时间为0~10min；最适酶量为3.152×103~7.88×103 u/mmol；最适底物浓度为0.5mol/l；最适pH在NaAc-HAc体系中为4.4；最适反应温度为50℃。
而在植物体中，蔗糖酶也起到不可代替的作用。
在“蔗糖酶在植物中的生理作用”这篇文章中，作者主要介绍了蔗糖酶在植物体中的5个作用，分别是：1.参与叶片的光合作用 2. 参与贮藏器官碳水化合物组成中的作用 3. 参与细胞对胁迫的响应 4. 参与植物的生长发育 5. 在信号传导中的作用目前，对蔗糖酶的研究已取得了很大的进展，不仅分离、纯化了各种蔗糖酶，建立了活性测定方法，而且也测定了该酶的部分性质及其在植物体内的时空分布。
实验操作指导书：蔗糖酶的提取与部分纯化
（一）蔗糖酶的提取与部分纯化一、实验目的：学习酶的纯化方法，并为动力学实验提供一定量的蔗糖酶。
二、试剂：1. 啤酒酵母2. 二氧化硅3. 甲苯（使用前预冷到0℃以下）4. 去离子水（使用前冷至4℃左右）5. 冰块、食盐6. 1N乙酸7. 95%乙醇三、仪器：1. 研钵1个2. 离心管3个3. 滴管3个4. 量筒50ml 1个5. 水浴锅1个6. 恒温水浴7. 烧杯100ml 2个8. 广泛pH试纸9. 高速冷冻离心机四、操作步骤：1. 提取（1）准备一个冰浴，将研钵稳妥放入冰浴中。
（2）称取5g干啤酒酵母和20g湿啤酒酵母，称20mg蜗牛酶及适量（约10g）二氧化硅，放入研钵中。
二氧化硅要予先研细。
（3）量取预冷的甲苯30ml缓慢加入酵母中，边加边研磨成糊状，约需60分钟。
研磨时用显微镜检查研磨的效果，至酵母细胞大部分研碎。
（4）缓慢加入预冷的40ml去离子水，每次加2ml左右，边加边研磨，至少用30分钟。
以便将蔗糖酶充分转入水相。
（5）将混合物转入两个离心管中，平衡后，用高速冷离心机离心，4℃，10000rpm，10min。
如果中间白色的脂肪层厚，说明研磨效果良好。
用滴管吸出上层有机相。
（6）用滴管小心地取出脂肪层下面的水相，转入另一个清洁的离心管中，4℃，10000rpm，离心10min。
（7）将清液转入量筒，量出体积，留出1.5ml测定酶活力及蛋白含量。
剩余部分转入清洁离心管中。
（8）用广泛pH试纸检查清液pH，用1N乙酸将pH调至5.0，称为“粗级分I”。
2. 热处理（1）予先将恒温水浴调到50℃，将盛有粗级分I的离心管稳妥地放入水浴中，50℃下保温30分钟，在保温过程中不断轻摇离心管。
（2）取出离心管，于冰浴中迅速冷却，用4℃，10000rpm，离心10min。
（3）将上清液转入量筒，量出体积，留出1.5ml测定酶活力及蛋白质含量（称为“热级分II”）。
3. 乙醇沉淀将热级分II转入小烧杯中，放入冰盐浴（没有水的碎冰撒入少量食盐），逐滴加入等体积预冷至－20℃的95%乙醇，同时轻轻搅拌，共需30分钟，再在冰盐浴中放置10分钟，以沉淀完全。
啤酒酵母蔗糖酶提取、 分离纯化、性质鉴定及反应动力学实验
3,5-二硝基水杨酸比色定糖法工作曲线的制作Folin-酚法测定蛋白质含量工作曲线的制作米氏常数正交实验结果分析：啤酒酵母蔗糖酶提取、分离纯化、性质鉴定及反应动力学实验一、实验目的1、熟悉工作曲线的制作方法及注意事项；2、掌握3, 5-二硝基水杨酸（DNS）比色定糖的原理和方法；3、掌握Folin-酚法测定蛋白质含量的原理和方法；4、掌握酶蛋白分离提纯的原理；5、掌握酶的比活力测定及其计算方法；6、掌握酶促反应动力学中用双倒数法测定Km的方法；7、运用正交试验法确定温度、pH值、离子浓度的最适条件。
二、实验原理1、蔗糖酶的提取细胞破壁：就酶在生物体内的分布，可分为胞内酶和胞外酶，蔗糖酶系胞内酶。
提取胞内酶时，要破碎组织和细胞，然后用一定的溶液提取，得到的材料称为无细胞抽提液。
材料不同，破壁的方法也不同。
我们用的酵母菌细胞破壁方法有机械（匀浆）法、超声波处理法、反复冻融法、化学处理法、溶胞作用(酶溶解法)、自溶法，本实验采用自溶法。
自溶法即将新鲜的生物材料存放于一定的pH和适当的温度下，细胞结构在自身所具有的各种水解酶（如蛋白酶和酯酶等）的作用下发生溶解，使细胞内含物释放出来。
2、蔗糖酶的纯化（1）酶的蛋白属性①两性电离：蛋白质分子除两端的氨基和羧基可解离外，氨基酸残基侧链中某些基团，在一定的溶液pH条件下都可解离成带负电荷或正电荷的基团。
②等电点(isoelectric point, pI) ：当蛋白质溶液处于某一pH时，蛋白质解离成正、负离子的趋势相等，即成为兼性离子，净电荷为零，此时溶液的pH 称为蛋白质的等电点。
③大分子(胶体) : 分子量可自1 万至100 万之巨，其分子的直径可达1～100nm，为胶粒范围之内。
④稳定的因素: 颗粒表面电荷、水化膜（2）调节酶溶解度的方法；①改变离子强度；盐析、硫酸铵分级沉淀（反抽提法）反抽提法（Back Extraction）例：E.coli RNA聚合酶42% - 50% 硫酸铵饱和度时沉淀通常方法：先33%-------再50%反抽提法：再42%将包含待分离酶在内的多种蛋白一起先沉淀出来，然后再选择适当的递减浓度的硫酸铵溶液来抽提沉淀物。
实验十四___酵母蔗糖酶的提取纯化及活力测定
2.热处理 将上步所得上清液转入50 ml离心管，迅 2.热处理 将上步所得上清液转入50 ml离心管，迅 速放入50℃恒温水浴中，保持30分钟，并用玻璃 速放入50℃恒温水浴中，保持30分钟，并用玻璃 棒温和搅动抽提液，迅速用冰浴冷却，10000rpm 棒温和搅动抽提液，迅速用冰浴冷却，10000rpm 离心10分钟，弃去沉淀，测量上清液体积，留 离心10分钟，弃去沉淀，测量上清液体积，留 1.0ml (Ⅱ样品)测定此酶活力和蛋白浓度。 (Ⅱ样品) 3.酒精沉淀 将热处理后的上清液，加入相同体积 3.酒精沉淀 的-20℃95％乙醇，冰浴中温和搅动，（注意边搅 20℃95％乙醇，冰浴中温和搅动，（注意边搅 慢加，滴加乙醇时滴与滴之间不能连成线！！！） 放置30min，然后10000rpm离心10min，弃去上清 放置30min，然后10000rpm离心10min，弃去上清 液，试管中沉淀放置冰箱保存或将酒精处理后的 沉淀溶于7ml 沉淀溶于7ml 20 mmol/L Tris-HCl、pH7.3 buff(Ⅲ样 Tris-HCl、 buff(Ⅲ 品，留1.0 ml样液测活)，上样前用7ml离心管 品，留1.0 ml样液测活)，上样前用7ml离心管 5000rpm离心10min，待上样。 5000rpm离心10min，待上样。
甲液：溶解6.9g 结晶酚于15.2ml 10％NaOH溶液中，并用水稀释至 甲液：溶解6.9g 结晶酚于15.2ml 10％NaOH溶液中，并用水稀释至 69ml,在此溶液中加6.9g亚硫酸氢钠。 69ml,在此溶液中加6.9g亚硫酸氢钠。 乙液：称取255克酒石酸钾钠加到300ml 10%NaOH溶液中，再加 乙液：称取255克酒石酸钾钠加到300ml 10%NaOH溶液中，再加 入800ml 1%3,5-二硝基水杨酸溶液.甲,乙二溶液相混合即得黄色试剂,贮 1%3,5-二硝基水杨酸溶液. 乙二溶液相混合即得黄色试剂, 于棕色瓶中备用,在室温放置7 10天以后使用。 于棕色瓶中备用,在室温放置7-10天以后使用。
浙江工业大学生物化学实验论文 - 对啤酒酵母的蔗糖酶的提取提
浙江工业大学生物化学实验论文 - 对啤酒酵母的蔗糖酶的提取、提浙江工业大学生物与环境工程学院生物化学实验论文姓名：组员：学号：学品科学与工程所在院系：生物与环境工程学院指导教师：邱乐泉2021 年12 月 1日填科：食啤酒酵母蔗糖酶的提取、提纯及测定研究论文摘要：为了解酶的初步提取及纯化方法，并在此基础上掌握测定酶活力的原理和方法；用Folin-酚试剂、微量凯式定氮法测定蛋白质含量的原理和方法，SDS-PAGE测定蛋白质的相对分子质量。
除此之外，还要掌握高速离心机、Q-Sepharose柱层析法、紫外分光光度计、凯氏定氮仪、蒸馏装置、电泳等用法。
这一系列实验需要实验预制作――酵母的自溶，大约3天以后，酵母细胞壁破裂，胞液流出，经多次分别离心得到初提液A、热提液B和乙醇提取液C。
利用Q-Sepharose柱层析法洗脱乙醇提取液C得到洗脱液D并在280nm处测D的吸光值，用葡萄糖测验试纸定性进行酶活力测试，发现洗穿透峰得到的第1、2管酶活力高，从第3管以后吸光值开始下降，且吸光值大的酶活力较大。
得到4种酶提取液样品以后，便可以制作葡萄糖标准曲线，进行定量酶活力测定，葡萄糖标准曲线是一条直线，根据曲线回归方程计算4个样品的总活力单位数和酶回收率，比较计算结果可以知道随着蔗糖酶的不断提纯酶的总活力单位数和酶回收率都减少。
随后用Folin-酚试剂法测样品中蛋白质的含量，与用微量凯氏定氮法测定的结果进行比较，后者测出的总蛋白含量比前者大，并且知道随着酶的提纯，A、B、C、D4个样品的纯化系数升高，比活力升高，总酶活、总蛋白和蛋白回收率却在下降，其中A的蛋白质含量最高，D的纯化程度最高。
最后用SDS-聚丙烯胺凝胶电泳法通过凝胶对样品的筛选分离、考马斯亮蓝的染色、洗脱等步骤测量蛋白质分子和染料的迁移距离间接测定蔗糖酶的相对分子质量，得到2条蔗糖酶条带，计算的蔗糖酶相对分子质量。
关键词：蔗糖酶；提取纯化；酶活力测定；Folin-酚试剂；微量凯式定氮法；SDS-聚丙烯胺凝胶Summary：To understand the the enzymes preliminary extraction and purification methods, and on this basis to master the principles and methods of determination of enzymeactivity; Folin-phenol reagent, trace Kay ceremony will be the principles and methods of nitrogen determination of the protein content, SDS-PAGE protein determination of therelative molecular mass. In addition, we must master the use of high-speed centrifuges, Q-Sepharose column chromatography, UV spectrophotometer, Kjeldahl instrument, distillation apparatus, electrophoresis.This series of experiments requires experimental pre-production - yeast autolysis, about three days later, the yeast cell wall rupture, cytosolic outflow to the beginning of extracts A, after repeatedly respectively centrifugal heat extracts B and ethanol extract C. Using Q-Sepharose column chromatography to obtain an eluate D eluted ethanol extract C and the absorbance value of the 280nm measured at D, the enzyme activity test, and found to penetrate wash peak obtained with glucose tests stripsqualitative 1,2 tube enzyme activity began to decrease from the absorbance values after 3 and suck the light value greater enzyme activity. Later to obtain four kinds of enzyme extraction fluid sample, it can produce a standard curve of glucose, quantitative enzyme activity assay, the glucose standard curve is a straight line, according to the regression equation to calculate the number of units and enzyme recovery of the total activity of the four samples, and comparing the calculated results You can know are reduced as thenumber of units of the total activity of the purified enzyme sucrase continues and enzyme recoveries. Followed by the protein content in the measured samples of the Folin-phenol reagent method, micro Kjeldahl nitrogen method resultswere compared, which measured the total protein content than the former, and know with the purification of the enzyme, A, B, C, D4 samples purified coefficient increases, increased specific activity, the total enzyme activity, total protein and protein recovery is on the decline, wherein A is the highest protein content, D, the highest degree of purification. SDS-polyacrylamide gel electrophoresis gel sample screening separation test brilliant blue staining, elution step measurement of protein molecules and dye migration distanceIndirectdetermination of the relative molecular mass of sucrase get two thesucrase strip sucrase relative molecular mass, the calculatedKeywords: sucrase; extraction and purification; enzyme activity assay;Folin-phenol reagent; micro-Kjeldahl method; SDS-polyacrylamide gel 正文：1、文献综述 1.1蔗糖酶(Sucrase,EC 3.2.1.26)又称转化酶(Invertase)，可作用于β21,2糖苷键,将蔗糖水解为D2葡萄糖和D2果糖[1]。
实验六 酵母蔗糖酶的提取及纯化——生化实验文档资料文档
实验六 酵母蔗糖酶的提取及纯化原理蔗糖酶（invertase ）（β—D —呋喃果糖苷果糖水解酶）（fructofuranoside fructohydrolase ）（EC.3.2.1.26）特异地催化非还原糖中的α—呋喃果糖苷键水解，具有相对专一性。
不仅能催化蔗糖水解生成葡萄糖和果糖，也能催化棉子糖水解，生成密二糖和果糖。
每水解1mol 蔗糖，就生成2mol 还原糖。
还原糖的测定有多种方法，本实验采用Nelson 比色法测定还原糖量，由此可得知蔗糖水解的速度。
在研究酶的性质、作用、反应动力学等问题时都需要使用高度纯化的酶制剂以避免干扰。
酶的提纯工作往往要求多种分离方法交替应用，才能得到较为满足的效果。
常用的提纯方法有盐析、有机溶剂沉淀、选择性变性、离子交换层析、凝胶过滤、亲和层析等。
酶蛋白在分离提纯过程中易变性失活，为能获得尽可能高的产率和纯度，在提纯操作中要始终注意保持酶的活性如在低温下操作等，这样才能收到较好的分离效果。
啤酒酵母中，蔗糖酶含量丰富。
本实验用新鲜啤酒酵母为原料，通过破碎细胞，热处理，乙醇沉淀，柱层析等步骤提取蔗糖酶，并对其性质进行测定。
一、蔗糖酶的提取与部分纯化（一）实验目的学习酶的提取和纯化方法，掌握各步骤的实验原理，并为后续实验提供一定量的蔗糖酶。
（二）实验原理（略） （三）实验仪器、材料及试剂 仪器1. 高速冷冻离心机、恒温水浴箱、－20℃冰箱2. 电子天平、研钵（＞200ml ）、制冰机、50ml 烧杯3. 离心管（2ml ，10ml ，30ml 或50ml ）、移液器（1000ul ）或滴管、量筒 材料及试剂1. 市售鲜啤酒酵母（低温保存）2. 石英砂（海沙）、甲苯（使用前预冷到0℃以下）3. 95%乙醇（预冷－20℃）、去离子水（使用前冷至4℃左右）4. Tris-HCl （pH7.3）缓冲液 （四）操作步骤 1. 提取＋ H 2O 蔗糖酶O HH O（1）将市售鲜啤酒酵母2000 rpm，离心10 min，除去大量水分。
啤酒酵母里蔗糖酶的提取和活力测定
啤酒酵母里蔗糖酶的提取和活力测定1、细胞破壁：就酶在生物体内的分布，可分为胞内酶和胞外酶，蔗糖酶系胞内酶。
提取胞内酶时，要破碎组织和细胞，然后用一定的溶液提取，得到的材料称为无细胞抽提液。
材料不同，破壁的方法也不同。
我们用的菌体（微生物）细胞破壁方法是：自溶法，即将菌体放在适当的pH值和温度下，利用组织细胞自身的酶系将细胞壁破坏，使细胞内的物质释放出来。
自溶时需加少量防腐剂，以防外界细菌污染。
自溶法的缺点是时间较长。
2、3，5-二硝基水杨酸比色定糖的原理（1）DNS试剂+ D-葡萄糖氨基化合物（还原糖）（棕红色）（2）在一定范围内还原糖的量与反应液的颜色强度成一定比例关系（可用于比色测定），所以可用DNS比色法测定还原糖的含量。
（3）该方法是半微量定糖法，操作简便、快速、杂质干扰较少。
试剂与器材恒温水浴、自动部分收集器、恒温箱、梯度洗脱装置、冰箱、层析柱、分析天平、电磁搅拌器、秒表、离心机、可见分光光度计、冻干机、沸水浴等。
3,5二硝基水杨酸试剂(DNS)、5%的蔗糖溶液、1mol/L的NaOH溶液、乙酸钠、0.2mol/L,pH4.6的醋酸缓冲液、乙酸乙酯。
操作方法①细胞破壁→抽提→两次乙醇分级→透析→装柱→洗涤→洗脱→收集酶活力峰→制冻干粉②制作3，5—二硝基水杨酸比色定糖法的标准曲线并测定三种酶样品的活力。
③测定三种酶样品的蛋白浓度④计算各步酶样的比活力、提纯倍数和收率⑤用双倒数作图法测定蔗糖酶的Km值关键步骤与注意事项①乙醇分级时，注意低温、防止乙醇局部过浓，离心后要迅速溶解酶样②装柱均匀，无截面、无气泡，床面平整，柱体垂直③分离提纯的全过程中，防止酶失活并用测定酶活力的方法跟踪酶的去向④在测定米氏常数时，将酶样溶解后一定要稀释到合适的浓度。
⑤酶活力测定及作图一定要准确。
蔗糖酶的提取、分离、纯化及活性检测
蔗糖酶的提取、分离、纯化及活性检测蔗糖酶是一种能够催化蔗糖水解反应的酶，广泛存在于生命体内，具有重要的应用价值。
本文主要介绍了蔗糖酶的提取、分离、纯化及活性检测方法。
一、蔗糖酶的提取1、选择合适的菌株：蔗糖酶广泛存在于细菌、真菌、植物和动物等生物体中，但不同菌株对蔗糖酶的产生能力存在差异，因此需要根据实际需求选择产酶能力较高的菌株。
2、液态培养：选用适宜的培养基和培养条件，促进菌株生长和蔗糖酶的合成。
一般情况下，最佳培养条件为温度在35℃左右，pH值为7.0左右，培养时间为24-48小时。
3、离心沉淀：将菌液离心，取上清液即为蔗糖酶提取液。
1、离子交换层析：通过调节液相pH值，利用离子交换材料对蔗糖酶进行吸附、洗脱和分离。
2、凝胶过滤层析：利用凝胶材料对蔗糖酶进行筛分，分离出不同分子量的蔗糖酶。
3、亲和层析：在固相材料上引入亲和基团，用于特异性地吸附蔗糖酶，洗脱和分离目标蛋白。
1、透析：通过半透膜对蔗糖酶真空透析，去除杂质。
2、浓缩：利用超滤膜对蔗糖酶进行浓缩。
3、电泳：运用电泳等方法对混合蛋白进行分离和分析，以实现蔗糖酶的纯化。
蔗糖酶的活性检测方法多种多样，以下介绍其中几种常见的方法。
1、邻苯二甲酸法：通过对邻苯二甲酸恒量反应条件下，测量比色产物的吸光度来检测蔗糖酶的活性。
2、甲酚磺酸法：测量甲酚磺酸转化为带电离子的速率，来判断蔗糖酶活性的多少。
3、蔗糖酶显色法：在蔗糖酶的作用下，蔗糖水解生成葡萄糖和果糖，再利用淀粉-碘酒作为指示剂，显色程度来反映蔗糖酶的活性。
总结：蔗糖酶是一种重要的酶类，在生命科学和工业生产等领域具有广泛应用。
其提取、分离、纯化及活性检测方法多种多样，需要根据不同的实验条件和需求来选择合适的方法。
啤酒酵母蔗糖酶的提取、纯化及测定研究
浙江工业大学海洋学院生物化学实验论文专业：食品科学与工程班级：食品1201姓名：徐素媛啤酒酵母蔗糖酶的提纯及相关性质测定研究作者：徐素媛单位：浙江工业大学海洋学院食工1201班摘要：为了了解酶的提取及及初提纯方法，并在此基础上掌握Q Sepharose-柱层析法提纯酶、DNS法测定酶活力、Folin-酚法和微量凯式定氮法测定蛋白含量以及SDS-PAGE测定蛋白质分子量的原理和方法，需要进行一系列的实验，主要实验过程如下：啤酒酵母自溶后经多次分别离心得到初提液A、热提取液B和乙醇提取液C。
利用Q Sepharose-柱层析法洗脱乙醇提取液C得到洗脱液，通过测定洗脱液的吸光值及酶活力的定性测定，选取活力最高的洗脱液得到柱分离液D。
接着进行定量酶活力测定，根据葡萄糖标准曲线的方程计算4个样品的总活力单位数和酶回收率，并得出随着蔗糖酶的不断提纯，酶的总活力单位数和酶回收率都逐渐减小。
随后用Folin-酚试剂法测样品中蛋白质的含量，与用微量凯氏定氮法测定的结果进行比较，后者测出的总蛋白含量比前者大，并得出A、B、C、D4个样品的比活力在一步步的纯化中逐渐升高，纯化倍数也明显增大，而总酶活、总蛋白和蛋白回收率却在下降。
最后用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法通过凝胶对样品的筛选分离、染色、洗脱等步骤测量蛋白质分子和染料的迁移距离来间接测定蔗糖酶的相对分子质量。
关键词：蔗糖酶提纯酶活力Folin-酚法微量凯式定氮法SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法正文：1、文献综述1.1 总述啤酒酵母也叫营养酵母，为酵母科、酿酒酵母属，可作食用、药用和饲料酵母，还可以从其中提取核酸、谷胱甘肽、蔗糖酶、细胞色素c等营养物质[1]从啤酒酵母中提取蔗糖酶的一般工艺过程包括提取和分离纯化以及相关性质测定[2]。
1.2 蔗糖酶的提取蔗糖酶(Sucrase，EC 3.2.1.26)又称转化酶(Invertase)，可作用于β-1，2糖苷键，并将蔗糖水解为D-葡萄糖和D-果糖。
蔗糖酶的提取、分离、纯化及活性检测
蔗糖酶的提取、分离、纯化及活性检测摘要随着分子生物学的发展，不论对酶分子本身作用机制的研究还是其他研究，越来越需要纯度更高的酶制剂，这就要求我们熟悉酶提纯的一般操作步骤及酶的提纯及活力测定等重要的生物实验技术。
本次实验主要通过提取啤酒酵母中的蔗糖酶并经过两次纯化测定其活力与Km。
在实验过程中用乙醇分级分离法，DEAE-Cellulose 柱层析，分子筛（凝胶过滤）层析提取纯化蔗糖酶。
在实验过程中，虽然我们很努力, 但由于我们对实验的程序不熟悉，因此在实验的一些过程中有一些明显的操作失误，使得实验的最后测定结果与理论值有一定出入。
关键词啤酒酵母蔗糖酶乙醇分级分离DEAE-Cellulose 柱层析分子筛层析Km 前言生物体内所发生的一切化学反应，几乎都是在专一性酶的催化下进行的，因此酶的研究对了解生命活动的规律以及生命本质的阐述具有十分重要的意义。
随着分子生物学的发展，不论对酶分子本身作用机制的研究以及分子生物学其他重要课题的研究都越来越多地需要使用作用专一，纯度高的酶制剂。
这就要求人们建立各种方法，以便从各种生物来源的材料中分离提纯酶。
由于酶本身也是蛋白质，因此酶分离提存的方法大体上与蛋白质纯化方法相同，一般来说，没有一种固定的方法，而往往根据实验者所要分离提纯酶的取材以及酶本身的物理﹑化学及生物学性质来确定分离提纯方法。
各种酶的纯化通常有五个阶段：①材料的选择与预处理；②细胞破碎；③抽提；④纯化；⑤浓缩﹑干燥及保存。
酶分离纯化成功与否的重要标志：一是要有较高的收率；二是达到所要求的纯度，这两个指标通常是矛盾的，可根据需要来有所侧重，一般来说，好的方法与步骤应该是简单易行，最终的酶制剂有较高的收率和纯度。
就单独的每种分离提纯的方法而言，有盐析法、有机溶剂分级法、调PH分级沉淀法、选择变性法、吸附法、层析法（纸层析、薄板层析、柱层析等）。
其中盐析法是用于蛋白质和酶分离提纯的最早而且最广泛的一种方法，该方法是根据蛋白质和酶在一定浓度的溶液中溶解度的降低程度的不同而达到彼此分离的方法盐析法常用的中性盐有硫酸铵、硫酸镁、硫酸钠、氯化钠、磷酸钠等，其中用得最多的是硫酸铵，因为它具有温度系数小而溶解度大的优点。
【精品】蔗糖酶的提取纯化及蛋白质含量测定研究
论文论文题目：蔗糖酶的提取纯化及蛋白质含量测定研究作者姓名周柱林指导教师钟莉学科专业食品科学与工程1102所在学院生物与环境工程学院提交日期2013年12月蔗糖酶的提取纯化及蛋白质含量测定研究周柱林生物与环境工程学院食品科学与工程1102班摘要：对啤酒酵母蔗糖酶的相关性质进行研究讨论，实验采用酵母自溶法初步得到粗蔗糖酶，离心除杂质法得到初提取液A，接着制备热提取液B，接着制备乙醇沉淀提取液C，接着采用QSepharose-柱层析法得到纯度较高的D液，然后用DNS法、标准曲线法和分光光度法测定蔗糖酶的活力，用Folin-酚法测定蔗糖酶蛋白质含量及计算比活力，用微量凯氏定氮法测定总蛋白含量，最后用SDS-PAGE 法测定蛋白质的相对分子质量，并对其基本性质进行了研究。
实验测定结果A、B、C提取液的酶回收率（％）分别为100、128.5、56.6，蛋白回收率（％）分别为100、98.15、4.29，比活力分别为17.4、22.8、230.1，纯化倍数分别为1、1.31、13.22，SDS-PAGE测定酵母蔗糖酶相对分子质量为A:99150、45000；B：10140；C：92200、65660.关键词：蔗糖酶、提取、纯化、酶活力、蛋白质含量、比活力、相对分子质量1.前言（文献综述）：啤酒酵母也叫营养酵母，可以从其中提取蔗糖酶，蔗糖酶又称为转化酶，属于水解酶类，蔗糖在蔗糖酶的催化下，水解为两种还原糖D一葡萄糖和D一果糖。
蔗糖酶在植物的运输贮藏、碳水化合物代谢中发挥主要作用，并在渗透调节、抗逆性生长繁殖、以及信号传导方面也发挥着重要的作用。
按水解蔗糖的方式，蔗糖酶可分为从果糖末端切开蔗糖的β-D-呋喃果糖苷酶（β-D-frutofuranosidases,EC 3.2.1.26)和从葡萄糖末端切开蔗糖的α-D-葡萄糖苷酶（α-D-glucosidases,EC 3.2.1.20)。
前者存在于酵母中，后者存在于霉菌中。
啤酒酵母的蔗糖酶的提取、提纯及测定
啤酒酵母的蔗糖酶的提取、提纯及测定浙江工业大学药学院生物化学实验论文2022 年12 月 13日啤酒酵母蔗糖酶的提取、提纯及测定研究论文摘要：为了了解蔗糖酶的性质，我们用啤酒酵母做了一系列的实验，它们主要是以下内容：〔1〕，蔗糖酶的提取与初提纯：a、先将酵母自溶，再两次离心得初提液A；b、接着调PH并加热、离心得热提取液B；c、用乙醇沉淀离心得提取液C。
〔2〕，蔗糖酶的纯化—Q Sepharose 柱沉析法：先装柱，再安装盐度梯度发生器与柱的平衡，接着加样并洗脱，最后处理结果与交换剂的再生并得到提取液D。
〔3〕，蔗糖酶活力的测定：第一人做葡萄糖标曲，第二人测定各提取液反响后的OD540值，得各提取液的酶活力与回收率。
〔4〕，蔗糖酶蛋白质含量的测定及活力计算：遇上一个实验相反，第二人做标曲，第一个人测与各提取液相对应的OD660值，再比照得到各提取液的总蛋白、比活力、蛋白回收率、酶活回收率与纯化倍数。
(5),微量凯氏定氮法〔以B为样品〕：先将样品B消化得消化液，洗涤定氮仪，再将消化液蒸馏，用HCl滴定馏出液，计算蛋白质含量。
〔6〕，SDS-PAGE测定蛋白质的相对分子质量：首先制备别离胶并使之凝固，再制备浓缩胶使之在别离胶之上凝固，加处理后的样品和标准液，接着电泳，最后染色和脱色，确定样品相对分子质量。
关键词：蔗糖酶；蛋白质；提取；纯化；酶活力测定；Folin-酚试剂；微量凯式定氮；SDS-聚丙烯胺凝胶;标曲；电泳；正文：文献综述蔗糖酶(Sucrase,EC 3.2.1.26)又称转化酶(Invertase)，可作用于β21,2糖苷键,将蔗糖水解为D2葡萄糖和D2果糖，广泛存在于动植物和微生物中，主要从酵母中得到。
蔗糖酶的最适温度为45℃-50℃，最适ph为4.0-4.5.实验原理、试剂与器材、操作方法、结果与分析、考前须知、认识与体会 1 蔗糖酶的提取及初步提纯1.1实验原理酵母中含有蔗糖酶，而蔗糖酶属于胞内酶，所以常将细胞壁破碎后进行提取。
啤酒酵母的蔗糖酶的提取、提纯及测定解读
浙江工业大学药学院生物化学实验论文2013 年12 月13日啤酒酵母蔗糖酶的提取、提纯及测定研究论文摘要：为了了解蔗糖酶的性质，我们用啤酒酵母做了一系列的实验，它们主要是以下内容：（1），蔗糖酶的提取与初提纯：a、先将酵母自溶，再两次离心得初提液A；b、接着调PH并加热、离心得热提取液B；c、用乙醇沉淀离心得提取液C。
（2），蔗糖酶的纯化—Q Sepharose 柱沉析法：先装柱，再安装盐度梯度发生器与柱的平衡，接着加样并洗脱，最后处理结果与交换剂的再生并得到提取液D。
（3），蔗糖酶活力的测定：第一人做葡萄糖标曲，第二人测定各提取液反应后的值，得各提取液的酶活力与回收率。
（4），蔗糖酶蛋白质含量的测定及活力OD540计算：遇上一个实验相反，第二人做标曲，第一个人测与各提取液相对应的OD660值，再对比得到各提取液的总蛋白、比活力、蛋白回收率、酶活回收率与纯化倍数。
(5),微量凯氏定氮法（以B为样品）：先将样品B消化得消化液，洗涤定氮仪，再将消化液蒸馏，用HCl滴定馏出液，计算蛋白质含量。
（6），SDS-PAGE测定蛋白质的相对分子质量：首先制备分离胶并使之凝固，再制备浓缩胶使之在分离胶之上凝固，加处理后的样品和标准液，接着电泳，最后染色和脱色，确定样品相对分子质量。
关键词：蔗糖酶；蛋白质；提取；纯化；酶活力测定；Folin-酚试剂；微量凯式定氮；SDS-聚丙烯胺凝胶;标曲；电泳；正文：文献综述蔗糖酶(Sucrase,EC 3.2.1.26)又称转化酶(Invertase)，可作用于β21,2糖苷键,将蔗糖水解为D2葡萄糖和D2果糖，广泛存在于动植物和微生物中，主要从酵母中得到。
蔗糖酶的最适温度为45℃-50℃，最适ph为4.0-4.5.实验原理、试剂与器材、操作方法、结果与分析、注意事项、认识与体会1 蔗糖酶的提取及初步提纯1.1实验原理酵母中含有蔗糖酶，而蔗糖酶属于胞内酶，所以常将细胞壁破碎后进行提取。
生物化学实验论文 从啤酒酵母中提取蔗糖酶
题名：酵母蔗糖酶的提取纯化及活力测定姓名：***学院：长三角绿色制药协同创新中心班级：绿色国际班学号：************2013 年12 月 27日填酵母蔗糖酶的提取纯化及活力测定浙江工业大学绿色制药协同创新中心宋烙摘要：采用自溶法从啤酒酵母中提取蔗糖酶，通过离心、热提取、95%乙醇沉淀提取、Q Sepharose-柱层析法来对蔗糖酶进行纯化。
至于活力的测定，首先利用3，5-二硝基水杨酸（DNS）法测定5min内酶能催化生成葡萄糖的量来对得到的各个提取液进行蔗糖酶活力的测定。
然后再通过Folin-酚法测定蔗糖酶蛋白质含量，之后就可以计算出各个提取液的比活力。
最后，用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法来测定蔗糖酶的相对分子质量。
关键词：蔗糖酶；提取纯化；酶活力；蛋白质含量；相对分子质量The Extraction Method of Beer Yeast Sucroseand Vitality TestZhejiang University of Technology Green Pharmacy Xietong Chuangxin CentreSong LuoAbstract:The autolysis extracts sucrose from beer yeast. Then, purifying the sucrose by centrifugalization, hot extraction, 95% ethanol sediment extraction, and Q-Sepharose-column chromatography. As for calculate the radio of live, first of all, using 3,5-dinitrosalicylic acid(DNS)to calculate the each extracting solution’s radio of live by measure how much sucrose the sucrose can catalysis. After that, calculating the content of sucrose by using Lowry method., so it’s available to calculate each extracting solution’s specific activity. Finally, we used SDS-polyacrylamide gel eletrophoresis to measure the sucrose’s relative molecular mass.Keyword: sucrose；extraction；vitality；specific activity；relative molecular mass前言：本实验的是一个综合性的教学实验，主要是为了让学生养成规范的科学实验习惯，树立严谨的科研作风。
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浙江工业大学药学院生物化学实验论文2013 年12 月13日啤酒酵母蔗糖酶的提取、提纯及测定研究论文摘要：为了了解蔗糖酶的性质，我们用啤酒酵母做了一系列的实验，它们主要是以下内容：（1），蔗糖酶的提取与初提纯：a、先将酵母自溶，再两次离心得初提液A；b、接着调PH并加热、离心得热提取液B；c、用乙醇沉淀离心得提取液C。
（2），蔗糖酶的纯化—Q Sepharose 柱沉析法：先装柱，再安装盐度梯度发生器与柱的平衡，接着加样并洗脱，最后处理结果与交换剂的再生并得到提取液D。
（3），蔗糖酶活力的测定：第一人做葡萄糖标曲，第二人测定各提取液反应后的值，得各提取液的酶活力与回收率。
（4），蔗糖酶蛋白质含量的测定及活力OD540计算：遇上一个实验相反，第二人做标曲，第一个人测与各提取液相对应的OD660值，再对比得到各提取液的总蛋白、比活力、蛋白回收率、酶活回收率与纯化倍数。
(5),微量凯氏定氮法（以B为样品）：先将样品B消化得消化液，洗涤定氮仪，再将消化液蒸馏，用HCl滴定馏出液，计算蛋白质含量。
（6），SDS-PAGE测定蛋白质的相对分子质量：首先制备分离胶并使之凝固，再制备浓缩胶使之在分离胶之上凝固，加处理后的样品和标准液，接着电泳，最后染色和脱色，确定样品相对分子质量。
关键词：蔗糖酶；蛋白质；提取；纯化；酶活力测定；Folin-酚试剂；微量凯式定氮；SDS-聚丙烯胺凝胶;标曲；电泳；正文：文献综述蔗糖酶(Sucrase,EC 3.2.1.26)又称转化酶(Invertase)，可作用于β21,2糖苷键,将蔗糖水解为D2葡萄糖和D2果糖，广泛存在于动植物和微生物中，主要从酵母中得到。
蔗糖酶的最适温度为45℃-50℃，最适ph为4.0-4.5.实验原理、试剂与器材、操作方法、结果与分析、注意事项、认识与体会1 蔗糖酶的提取及初步提纯1.1实验原理酵母中含有蔗糖酶，而蔗糖酶属于胞内酶，所以常将细胞壁破碎后进行提取。
酶的生产方法有生物提取法、微生物发酵法及化学合成法，细胞破碎又有化学裂解法、低渗溶液法等，本法属于生物提取法、菌体自溶的方法。
经破碎提取的蔗糖酶液再经热提取、乙醇沉淀提取，使蔗糖酶得到初步的提纯。
1.2 试剂与器材1.2.1试剂①啤酒酵母；②醋酸钠（AR）；③甲苯（AR）；④4mol/L醋酸；⑤95%乙醇（<-20℃）；⑥0.5mol/L Tris-HCl pH7.3缓冲液。
称取121.1g Tris溶于1500ml的蒸馏水中，用4 mol/L HCl调节pH至7.3（HCl量约为230ml），用蒸馏水稀释到2L，即为0.5 mol/L Tris-HCl pH7.3缓冲液。
⑦0.05 mol/L Tris-HCl pH7.3缓冲液：将0.5mol/L Tris-HCl pH7.3缓冲液稀释10倍即得。
注：整个实验要注意避免高温，以防止酶失活。
1.2.2器材①锥形瓶250ml（×1），50ml（×1）；②量筒10ml（×1）25ml（×1）;③烧杯100 ml（×1），1000 ml（×1）；④具塞试管10 ml（×3）；⑤吸球、玻棒、滴管、pH试纸；⑥培养箱；⑦恒温水浴箱；⑧磁力搅拌器，搅拌子；⑨高速冷冻离心机。
1.3操作方法1．酵母的自溶：在弱碱中培养60小时；2．初提取液A：取出酵母自溶液体，经两次离心得初提液A；3．热提取液B：水浴提取液A，并使PH为4.5，离心得热提取液B4．乙醇沉淀提取液C：将B冷却并加入乙醇持续搅拌，不少于30min，离心得提取液C1.4结果与分析1.4.1结果V A总=V A=17.0mlV B总=V B·[V A/(V A-3)]=18.0mlV C总=V c·[V A/(V A-3)] ·[V B/(V B-3)]=V c·[V B总/(V B-3)]=8.27ml1.4.2分析提取液A、B、C颜色不断便签是因为杂质不断消除。
这次的数据与其他小组无太大差距，这不会影响后续实验。
1.4.3结论V A总=17.0ml ；V B总=218.0ml ；V C总=8.27ml。
1.5注意事项①第一次离心后取液体时要小心；②水浴时的温度不要超过50℃。
同时在保温过程中不断摇动锥形瓶。
冰浴时要迅速操作；③冰浴操作过程中慢慢加入缓冲液并搅拌使固体充分溶解，减少损失；1.6认识与体会实验操作无明显错误，操作仍能精确，但需锻炼；离心操作前需平衡，否则会损坏离心机；蔗糖酶在50°C以上失活。
2 蔗糖酶的纯化——Q Sepharose-柱层析法2.1实验原理离子交换层析是以离子交换剂为固定相，以一定pH和离子强度的溶液为流动相，流动相和固定相之间发生可逆的离子交换反应，利用离子交换剂对需要分离的各种离子结合力的差异，而将混合物中不同离子进行分离的层析技术。
由于各种蛋白质所带电荷的种类和数量不同，它们被吸引的程度也不同。
当被吸附的蛋白质的Kd值有差异时，降低pH值或提高离子强度均可使之洗脱下来，用含阴离子（如Cl-)的溶液洗柱，含电荷少的蛋白质首先被洗脱下来，增加Cl-浓度，含电荷多的蛋白质也被洗脱下来，于是两种蛋白质被分开。
分光光度法是通过测定被测物质在特定波长处或一定波长范围内光的吸收度，对该物质进行定性和定量分析。
2.2试剂与器材2.2.2.1试剂①0.05 mol/L Tris-HCl pH7.3缓冲液；②1mol/LNaCl的0.05 mol/L Tris-HCl pH7.3缓冲液；③0.5mol/LNaOH；④Q Sepharose，长期保存需置于20%乙醇中，4℃保存。
注：整个实验要注意避免高温，以防止酶失活。
2.2.2.2器材①层析柱；②梯度混合器;③磁力搅拌器，搅拌子；④紫外分光光度计；⑤点滴板；⑥尿糖试纸、擦镜纸；⑦止水夹；⑧烧杯、试管。
2.3操作方法1．离子交换柱的填充：将层析柱垂直固定，加水，排除气泡，再加少量水，装入离子交换剂，至柱高5cm，交换柱上端保留少许水（不得干柱）。
2．缓冲液盐度梯度发生器的安装：在低浓度一段装入搅拌子。
且要形成梯度。
3．柱的平衡：将柱子与恒流泵连通，用25ml Tris-HCl pH7.3缓冲液进行冲洗平衡完成后，交换剂上方需保留5ml左右的缓冲液。
4．加样：缓慢加样，不能把柱面冲到导致柱面不平，这是实验成功的关键之一5．洗脱：为防止液面低于交换剂表面，加入了5ml缓冲液。
6．测OD值：在紫外分光计光度计上测出每管在280nm处的紫外吸光度OD值。
得到各管的OD值如下：表2-2试管号OD280值试管号OD280值1 0.322 14 0.1202 0.447 15 0.1093 0.060 16 0.0834 0.054 17 0.0775 0.065 18 0.0696 0.031 19 0.1267 0.028 20 0.3058 0.016 21 0.9009 0.037 22 1.01410 0.048 23 0.67311 0.061 24 0.28112 0.231 25 13013 0.2847．酶活力测试用葡萄糖测验试纸测试每管内蔗糖酶的活力大小，由以上OD值，取1、2、5、12、13、14、20、21、22、23管进行测试。
酶活力测试方法：在点滴板中滴2滴5%蔗糖，再加2滴待测洗脱液，用玻璃棒搅匀，放置5min，浸入葡萄糖试纸，1s后取出，60s比较颜色深浅。
将其合并成一管，V D=5.22ml2.4结果与分析2.4.1结果V D =5.22mlV D总=V D·V C总/V样=5.6×6.1/0.5=86.34ml。
由数据得表如下：图2-1 Q Sepharose-柱层析法提纯酶数据处理表2.4.2分析①柱的高度与冲洗的流速、梅的浓度及柱的带电量大小会影响样品在柱内的移动快慢；②酶活力不是特别的强，也许是前面柱下端渗出液体导致蔗糖酶流失；③适当增加柱的高度与降低冲洗液的流速能提高分离效率；④在使用Q-Sepharose纯化方法之前还有过DEAE-纤维素层析方法和DEAE Sepharose层析方法，但比较这几种方法，用Q-Sepharose纯化方法有如下特点：(1)提高实验效果。
琼脂糖凝胶离子交换介质比纤维素介质载量高,分离纯化蔗糖酶穿透峰小,分辨率高,回收率高。
蔗糖酶与杂蛋白得到了很好的分离,提高纯度,真正体现离子交换色谱蛋白质纯化上的优越性,增强实验的意义。
（2）缩短实验时间。
梯度洗脱时间由原来的100min缩短到现在的50min,减少不必要的实验重复,实验过程比较紧凑。
（3）节约实验支出。
离子交换介质DEAE-纤维素由于流速慢,柱床高度会随缓冲液浓度及pH改变,不能承受0.1M以上NaOH清洗,重生效果差,寿命短。
琼脂糖介质在分辨率、回收率、流速等具有优越性。
且其化学稳定性极高,不易破碎,可以承受1MNaOH的清洗,重生效果好,可以使用数百至上千次,因而降低了成本。
2.4.3结论V D 5.22mlV D总=86.34ml。
2.5注意事项①在整个柱操作过程中，要严格防止液面低于交换剂的表面。
当液面低于交换剂表面时，空气进入交换剂内，形成气泡，而影响分离效果；②加样不可太快，以免搅浑交换剂的表面，而使分离不纯；③恒流泵的流速要控制好，要速度有利于液体滴下来，同时防止液体下滴过快而引起干柱。
是绝对不能干柱；④盐度梯度发生器内气泡要除尽；2.6认识与体会在本实验中，由于操作失误，导致柱内气压太大，加样时在柱的下端有液体流出，影响了本实验的准确性，使得D的酶浓度不高，影响后续实验，提纯也不好。
3 蔗糖酶活力的测定3.1实验原理本实验用DNS法测还原糖的含量，进而计算酶的活力。
蔗糖水解产生的葡萄糖和果糖均是还原性糖，可以在氢氧化钠和丙三醇的作用下与2,3,5-二硝基水杨酸反应，生成的棕红色氨基化合物在540nm波长处有最大吸收。
在一定范围内还原糖的量与其吸光值呈线性关系，于是做出葡萄糖标准曲线以后，就可以利用比色法可测出样品中的还原糖含量。
酶活力是指某种酶在最适PH、温度等条件下催化底物水解的能力，通常以一段时间后底物的减少量或产物的生成量多少来表示。
酶活力单位数（U）：在一定条件下，3min内能水解蔗糖成还原糖1mg所需的酶量，称为1个活力单位数。
总活力单位数=（V测体积测出的葡萄糖克数/V测）*(试管溶液总体积/2)*V总*n V总为各种提取液在提取过程中的总体积。
酶回收率=（各提取液的总酶活/处提取液A的总酶活）*100%3.2试剂与器材3.2.1试剂①3,5-二硝基水杨酸（1）甲液：溶解6.9g结晶酚于15.0ml10%氢氧化钠溶液中并用水稀释至69ml，在此溶液中加6.9g亚硫酸氢钠。