第十三章-酶类药物的分析

葡萄糖＋ATP
G-6-P ＋ADP …… (2)
G-6-P + NADP+
葡萄糖酸-6-磷酸 ＋ NADPH ＋ H+ …(3)
(1) 被测反应，(2)辅助反应，HK（己糖激酶）辅助酶，(3) 指示反应， G-6-PDH（6—磷酸葡萄糖脱氢酶）指示酶。
酶的比活力 每毫克酶蛋白所含酶活力， U/mg。
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Michaelis-Menten快速平衡学说
底物浓度的增加，反应 速度上升呈双曲线。
在低底物浓度时，反应 速度呈直线上升，表现 为一级反应。
在高浓度时，反应速度 达到一个极限值，呈现 零级反应。
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米氏方程
酶反应动力学方程式：
V——反应初速度 Vm——最大反应速度 K表s示—酶米与氏底常物数的，亲K和s力=K。－1/K1， Ks为ES的解离常数， Ks为反应速度V是最大反应速度Vm一半时所需底物浓
专用于酶的鉴别方法：
酶活性试验：与特异性底物反应（胰蛋白酶）。
沉淀试验：胃蛋白酶
动物试验：透明质酸酶水解粘多糖。
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酶类药物的检查
酶类药物是生化产品和微生物发酵产品，在 生产过程中可能带入微量的脂肪类物质、其 他的酶类和大分子杂质，影响酶质量，需有 含量限度。
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酶类药物的检查
（一）脂肪含量限度检查
度，即V=1/2 Vm时，Ks=[S]。
10Βιβλιοθήκη riggs-Haldane稳态学说
ES的形成速度与ES的解离速度相等，达到动态平
衡，即“稳态”，反应方程式：
Km取代了Ks，当V=1/2 Vm时，Km=[S]。 Km也可表示为底物与酶的亲和力。
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第二节 酶类药物的鉴别与检查
鉴别方法常用蛋白质鉴别方法，如在碱性条件 下的双缩脲反应。
还原型辅酶（NADH和NADPH）在340nm处有 紫外吸收，氧化型辅酶（NAD+和NADP+）在 340nm处无紫外吸收.
利用340nm处每分钟吸收度升高或降低的速率与 酶活性成正比的关系，推算出酶的活力单位。
包括：
直接测定法
偶联法
三联酶活测定
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直接测定法
大多数需NADH（NADPH）参加的脱氢酶， 可利用紫外分光光度法直接测定反应体系在 340nm处吸收度的变化，计算酶活力单位。
丙酮酸＋NADH＋H+
乳酸＋NAD+
340nm处吸收度降低的速率与NADH的氧化速 率成正比，与LDH的活力成正比。
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偶联法
此类酶催化反应不需NAD+或NADP+，但当与需 NAD+或NADP+的脱氢酶反应偶联以后，能用紫外 分光光度法测定.
由脱氢酶引起的反应为指示反应，脱氢酶是指示酶， 指示酶活力要比测定酶活力至少大100倍。
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三、酶的化学组成
分为简单酶和结合酶两大类。 结合酶类中除含有蛋白外，还含有某种热稳定
的非蛋白质的小分子物质，二者结合起来，称 为“全酶”，才呈现生物催化活性。
结合酶 = 酶蛋白 + 辅助因子
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四、酶的催化反应机制
1．酶-底物复合物的形成 在酶促反应中，反应 底物首先与酶分子上活性部位结合，形成酶-底 物复合物，降低反应的活性能，使酶促反应顺 利进行。
检查方法，乙醚浸提，干燥，精密称定，脂肪 不得过规定的含量。
（二）其他酶类含量限度检查 胰蛋白酶、糜蛋白酶均是从牛、猪的胰脏中提
取的蛋白分解酶。提取胰蛋白酶时又易带入微 量的糜蛋白酶。
（三）大分子活性物质含量限度检查
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胰蛋白酶制品中糜蛋白酶的含量
每2500U胰蛋白酶中不得多于50U的糜蛋白酶。
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注意事项
缺点：无法了解整个反应 过程是否都是零级反应。
注意事项： 1、底物饱和 2、时间
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二、连续监测法
在酶反应过程中，连续记录不同时间的底物消耗量 或产物生成量。
（一）、需NAD+或NADP+作指示的连续监测法 （二）、不需NAD+或NADP+作指示的连续监测法
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（一）、需NAD+或NADP+作指示的连续监测法：
连续监测法
（一）、需NAD+或NADP+作指示的连续监测法：
直接测定法
偶联法
三联酶活测定
（二）、不需NAD+或NADP+作指示的连续监测法：
固定浓度法
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一、固定时间法
在适宜的条件下，使酶和底物共同保温一定 时间，然后测定产物生成的量或底物消耗的 量从而间接推算出酶的含量（或活力）。
[E]表示酶浓度，[P]为反应产物浓度，t 表 示酶作用时间，K为常数。
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一、酶的特性
1．酶是高效催化剂。 2．酶对底物的结构具有严格的选择性。 （1）相对专一性： （2）绝对专一性: （3）立体异构专一性: 3．酶催化反应的反应条件温和。 4．酶的催化活性在生物体内受多种因素的调节。
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二、酶的分类
氧化还原酶 转移酶 水解酶 裂合酶 异构酶 合成酶（或称连接酶）
糜蛋白酶专属水解芳香氨基酸（L-酪氨酸、L-
苯丙氨酸）的羧基形成的肽键、酰胺键和酯键。
用N-乙酰-L-酪氨酸乙酯（N-Acetyl-L-
Tyrosine Ethylester，ATEE）作底物，通过 分光光度法测定此酶对底物的水解速率来检查 该酶的含量限度。
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第三节 酶活力测定方法
固定时间法
2．酶-底物复合物加速反应速率的原因 （1）定向作用与底物浓缩 （2）酶使底物分子变形 （3）酸碱催化 （4）共价催化 。
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五、酶催化反应动力学
酶的活力单位 酶活性单位（U）是酶活性 高低的一种量度，用U/g或U/ml表示。
酶活力单位定义：在规定的条件下，每分 钟能转化1μmol底物所需要的酶量，称一 个酶的活力单位。
大家好
酶类药物的分析
第一节 概述 第二节 酶类药物的鉴别与检查 第三节 酶活力测定方法 第四节 酶活力测定方法设计 第五节 典型酶类药物的检测
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第一节 概述
在生物体内，酶能降低生化反应活化能，加快可逆 反应的进行速度，使之尽快达到平衡。
一、酶的特性 二、酶的分类 三、酶的化学组成 四、酶的催化反应机制 五、酶催化反应动力学
例如：谷草转氨酶的测定：
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三联酶活测定
引入一个辅助酶反应，将被测酶反应系统与指示酶反应系统联 系起来，组成一个“三合一”酶反应系统，使底物转化率、辅 助酶反应和NADH（NADPH）氧化速率之间成正比函数关系， 辅助酶和指示酶的活力必须大大超过测定酶活力。
例如：磷酸肌酸+ADP
肌酸＋ATP…… (1)