固定化微生物

1 引言随着石油工业的迅速发展油气田开发对土壤的污染越来越严重。

石油污染土壤已经是石油及石化企业的重要污染之一，其中的石油污染物对人体及环境具有很高的毒害作用。

土壤污染不仅会破坏其自身结构、改变其物理化学性质，而且会影响作物的产量和品质，并通过食物链危害人类的健康和生命。

因此，修复污染土壤，保障人类健康，已引起各国政府及环境学家的广泛关注，成为当前国内外环保研究的热点。

2 石油污染土壤的现状及危害随着国民经济的迅速发展，人们对石油的需求不断增加，石油的勘探开发、运输及炼制过程中，石油污染问题日益凸显，特别是土壤污染日趋严重。

据报道，目前世界石油总产量每年约有22亿t，其中约有800万t石油进入环境已造成污染，我国石油年产量已超过1亿t，每年新污染土壤10万t，其中每年有近60万t石油进入环境，污染了土壤、地下水、河流和海洋[fll。

石油污染土壤主要由于石油的泄漏和排放引起的，一般集中在油田、油库、炼油厂周围，对土壤的污染大多集中在20cm左右的土壤表层[f2l。

我国许多油区污染严重，例如陇东油区年产原油约200万吨是中国第二大油田的中心区，石油污染面积正在逐年扩大，目前石油污染面积SOO}l000hm2，在重污染区，土壤原油含量高达3510mg/kg，高出临界值(200mg/kg) 17.6倍。

因此，修复石油污染土壤，加快土壤的修复和治理显得尤为重要。

石油是一种成分极其复杂的混合物，主要是由各种不同的碳氢化合物组成，还含有少量的氧、氮、硫、氯、硅和磷等非金属元素以及少量的重金属元素成分。

石油通常指原油和石油初加工产品(包括汽油、煤油、柴油、重油、润滑油等)及各类油的分解产物，主要包括烷烃、环烷烃和芳香烃、烯烃等，其中多环芳香烃类物质被认为具有严重的致癌、致突变、致畸作用，其形态包括气体、挥发性液体、高沸点液体以及固体等[[3,4] o石油进入土壤后，影响土壤环境质量，严重威胁着生态环境、食品安全和人身健康:1）石油吸附在土壤颗粒表面堵塞土壤孔隙，降低了土壤透水性，改变土壤有机质的组成、结构和物理化学性质，引起土壤有机质的变化如碳磷比;2)石油在植物根系表面形成一层粘膜，阻碍植物根系的呼吸与吸收，引起根系腐烂，影响植物的根系生长，致使农作物减产;3)石油积累在土壤低等动物(如蛆叫等)体内导致其死亡，生态平衡遭到破坏;4)土壤中的石油烃由植物根系吸收作用进入其体内并逐渐积累，再由食物链进入动物和人体，使环境生态和人体生命健康受到威胁;5)石油进入土壤在渗透过程中沿着地表扩散、侵蚀土层，使土壤盐渍化、沥青化、板结化;没有被土壤吸附的石油在重力作用下还沿土壤深部迁移，增加污染范围，渗入到地下污染地下水，从而对环境的多个层面产生广泛影响。

近年来的研究表明，石油和石油化工产品，经常以非水相液体(NAPL)的形式污染土壤、含水层和地下水，若未被土壤吸附的NAPL的密度比水大，石油污染物将穿过地表的土壤层，进入含水层，在其底部扩散;而密度比水小的则沿地下水面横向扩展，其可溶性成分逐渐扩散到水中，从而形成一种持久性污染源。

Nayef Z Al-Mutairi等使用毒性实验和蛆叫来监测分析生物修复石油污染土壤过程，发现旧污染的毒性比新污染的大，代谢产物的毒性有逐渐增大后减小最后不变的趋势。

因此，寻求对已污染土壤的经济、有效的治理与清洁措施，加速污染与退化农田生态系统的修复与重建，实现我国农业持续发展、保障人类健康，保护生态，所必须解决的关键问题之一。

3国内外处理石油污染土壤的研究现状分析为了消除环境中石油烃的污染，修复土壤石油污染经历了多层面和多方位的技术革新和研究，人们不断研究发展了多种石油污染土壤的修复方法。

目前石油污染土壤的处理大体主要分为三种方式:物理法，化学法和生物法。

3.1物理法物理法是修复石油污染土壤技术中常用方法之一，主要包括热处理法(焚烧法)、换土法、隔离法等，但这些方法均存在一定的缺陷和局限性，使其应用受到不同程度的限制。

例如热处理法在净化土壤时破坏土壤结构和组分，且焚烧过程会产生有毒有害物质而对环境造成二次污染;隔离法只是阻止石油烃在土壤中的迁移，没有改变石油烃的结构，因此不能作为一种永久性的处理方法;换土法一般仅适用于小面积污染特别严重的土壤的治理，特别是事故后的简单处理，并且换土法消耗的人工费用较高，难以应用于大面积土壤污染的处理。

3.2化学处理法化学处理法也是目前修复石油污染土壤中比较常用的方法[f 12l，主要包括:1)萃取法:根据相似相溶原理，利用有机溶剂萃取、分离、回收污染土壤中的石油烃，并实现废物的资源化，比较适合于受石油烃污染较严重的土壤。

2)土壤洗涤法:破碎污染土壤，混入足够的水和洗涤剂，过滤土壤、水和洗涤剂相互作用的浆液，将洗去石油烃后的土壤重新归入环境。

3)化学氧化法:向被石油烃污染的土壤中喷撒或注入化学氧化剂，使其与污染物质发生化学反应来实现净化的目的，该方法适合土壤和地下水同时被石油烃污染的治理。

这些化学处理方法除油效果较好，但是操作复杂，并且加入的化学试剂很容易引起土壤的二次污染，破坏土壤环境的正常生态系统，因此其实际应用受到了很大的限制。

3.3生物修复法物理法和化学法虽小范围内可以产生较好效果，但存在处理费用高，二次污染严重以及不适合工业化推广等缺陷。

因此从20世纪80年代末和90年代初期，国外开始致力于以物理化学方法为辅的生物修复技术，即物理化学法与生物修复法联合修复污染物。

生物修复技术由于具有安全，高效、无二次污染，经济效益好等优点，被人们认为是进行污染土壤生物修复的最有效、最有前途的一种污染治理技术。

石油污染生物修复技术作为一种新兴的处理技术，目前还没有统一的分类方法，生物修复主要包括微生物修复、植物修复和植物一微生物联合修复。

3.3.1微生物修复微生物修复一般是指利用土壤中的土著微生物或向污染环境添加经驯化的外源高效降解菌，有时也添加基因工程菌，在优化的环境条件下，加速其分解有机污染物，修复被污染的土壤，具体可以分为原位生物修复和异位生物修复两部分。

1)原位修复是指不移动受污染的土壤，在原位投放氮、磷营养物质或供氧，促进土著微生物的生长繁殖，或接种经驯化培养的高效微生物，利用其代谢作用有效的降解土壤中的污染物，包括投菌法、生物培养法、生物通气法等。

投菌法是向受污染的土壤中投入高效降解菌，同时提供微生物生长所需营养，包括以N, P为主的常量营养元素和微量营养元素。

其微生物可以是自然界筛选的微生物，也可以是基因工程菌。

生物培养法是以就地污染土壤作为接种物的好氧生物过程，即定期向土壤投加HaOa和营养，过氧化氢在代谢过程中作为电子受体，以满足土著降解菌的需要，将污染物彻底矿化成COz和Ha0。

生物通气法又称土壤曝气，是基于将空气(空气中加入氮、磷等营养元素)强行排入土壤中，然后抽出，土壤中的挥发性毒物也随之去除，是一种强迫氧化的生物降解方法。

2)异位生物修复是将受污染的土壤挖出，在污染场地以外或运送至专门的修复场地进行处理的方法，主要包括:堆肥处理法、生物反应器法、预制床法等。

土壤堆肥处理法是将受石油污染的土壤与适当的材料相混合并堆放，依靠堆肥过程中微生物作用来降解石油烃类的过程，同时加入了土壤调理剂以提高微生物的生长和石油生物降解的能量。

生物反应器法是将受污染土壤置于专门的反应器中进行处理，反应器可使土壤与微生物及其它添加物如营养盐、表面活性剂等彻底混合，能很好地控制降解条件，因而处理速度快、效果好。

预制床法具有滤液收集和控制排放系统，使得污染物的迁移量降到最小。

3.3.2植物修复植物修复技术是利用植物根系的吸收作用以及植物体内发达的酶系统对污染的环境介质进行治理。

植物修复技术已被广泛应用到有机污染物的环境治理中。

目前已报道有88种植物能有效吸收和富集70余种有机污染物。

Liste等用燕麦、羽扁豆、芸苔、漪萝、胡椒、红萝卜、短叶松、红松和白松9种植物研究对PAHs中花降解的影响，结果发现9种植物都明显加强了花的降解;8周内，有植物的土壤中花的去除达74%以上，而无植物的去除率少于40%，芸苔的降解能力最强，胡椒和红萝卜在28d里可明显减少花的浓度。

虽然植物修复污染物取得了良好的降解效果，但其仍然存在一定的不足:1)植物生长受到各种环境因素的影响，使得修复效果不稳定，很难达到工程化的要求;2}植物根系的长度有限，修复很大程度上只能限制在根区土壤范围;3}存在污染物通过“植物一动物”的食物链进入自然界的可能;4)同时受生长周期的限制，植物修复的周期长;5)最后是修复后植物处置困难的问题，而且引进的超富集植物等可能带来巨大的生态风险和环境问题。

3.3.3植物一微生物联合修复植物一微生物系统的吸收和代谢能力是修复石油污染土壤的关键部分。

目前研究较多的是用植物来辅助石油污染土壤微生物修复技术，如Miya等【19]对植物和微生物联合作用的机理进行了研究，发现植物根系分泌物有利促进细菌的生长，且根际区域的生物多样性比其它区域小。

李春荣等[}ao}通过田间试验研究了玉米和向日葵两种植物对石油污染土壤的修复作用，考察了外源菌(DX-9对植物修复的强化和协同效应，对“外源菌-植物”修复效果进行了初步评价，结果表明，150d玉米、向日葵试验区土壤中石油降解率较对照区提高了100.5%和118.9%;外源节细菌的施加可使生物修复速度显著加快;玉米、向日葵与节细菌对石油污染土壤的联合生物修复效果显著，经过两年修复，污染土壤恢复健康状态。

尽管植物一微生物联合修复在石油污染物降解中的重要性已经被充分认识，但是由于植物根际环境的微域性、动态性和复杂性等特点，目前对石油污染物植物一微生物联合修复的研究还存在一定的困难，有关降解微生物的群落组成和变化动态了解甚少。

4 微生物固定化技术4.1微生物固定化技术的概念微生物固定化技术是20世纪80年代兴起的一种新型生物技术，是指通过化学或物理方法将游离细胞(微生物)或酶定位于限定的空间区域内，并使其保持活性且能反复使用的技术。

高效降解菌对污染物的降解作用是微生物修复技术的核心，目前用于修复污染土壤的降解菌主要分为土著菌、外来菌和基因工程菌，这些都是游离菌。

由于降解过程中污染物的成分更复杂，一些次生代谢物和中间降解产物的毒性更大，游离微生物表现出单位体积内有效降解菌浓度低、与土著菌竞争处于弱势、抗毒性侵害能力差等特点。

而固定化技术能够对完整的微生物细胞进行固定，避免人为破坏生物酶的活性和生化反应的稳定性;提高单位体积介质中微生物细胞密度;固定化后的微生物能够长期保持活性;固定化细胞颗粒的微环境有利于屏蔽土著菌、噬菌体和毒性物质对微生物体的恶性竞争、吞噬和毒害，使其在复杂环境中也可稳定地发挥高效能o4.2固定化微生物的制备方法目前常用的固定化方法主要有吸附法、交联法、包埋法、共价结合法以及复合固定化法，即上述几种方法的联合使用。