现代生物学技术
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③能在转化体中得到充分表达；
④检测容易，并且能定量分析。
细菌筛选标记基因：产物给予细胞产生一种选择压力，致使未转化细胞不能生长、发育与分化。而转化细胞对该标记产生抗性，不影响其生长等，从而将转化细胞选择出来。
植物筛选标记基因：百度文库调给转化细胞带上一种标记，起报告和识别作用，故称报告基因。
(三〕受体材料的选择
②诞生期：20世纪70年代
1956—1959年斯沃尔三倍体：三棘刺鱼
1959年张明觉试管兔
1962年仓鼠肾细胞悬浮培养
1965年哈里斯·沃特金斯灭活病毒诱导动物细胞融合
20世纪70年代高国楠聚乙二醇促使植物原生质体融合
1960年兰花无性繁殖
1972年【美】卡尔森NaNO3诱导烟草原生质体融合
4：快速发展时期：20世纪70年代——至今
利用这种方法人类首次人工合成了胰岛素基因。
虽然在早期采用这种方式已经成功地克隆了许多基因。
局限性：兼并密码子、效率低、未知基因及产物
2.从基因组DNA或mRNA序列克隆基因
(1)同源序列法(Homology Based Candidate Gene Method)
根据基因家族成员所编码的蛋白质结构中具有保守氨基酸序列的特点克隆基因家族未知成员。
2、现状和意义
3、胚胎移植的原则
4胚胎移植的基本程序
细胞工程与胚胎移植
一、种苗脱毒快繁
二、
·“白菜—甘蓝”是用细胞工程的方法培育出来的蔬菜新品种，它具有生长期短，耐热性强和易于贮存等优点
三、植物次生代谢
四、植物基因工程
·高等哺乳动物受体细胞的遗传标记
·猴多瘤病毒DNA（SV40）基因表达好外源基因能高效表达
人乳多癌病毒NDA（BKV）
人牛痘病毒DNA
⑤高等哺乳动物的基因转移
物理转化法：硫酸钙共沉淀法
电击转化法
脂质体介导法
显微注射法
血影细胞介导法
病毒传染法
⑥哺乳动物工程生产的重组蛋白（300多种）
利用哺乳动物工程细胞生产人组织纤溶酶素
利用哺乳动物工程细胞生产人凝血因子
三、性别控制
1定义和意义：受精前后人为干预
域远远大于dhfr基因本身，即与dhfr基因相邻的DNA区域同时被扩增。
一、基因工程概述
二、转基因技术的发展现状
自从1983年第一株转基因烟草获得以来，至今已有120种植物转基因获得成功。1996年全球大面积种植，并不断扩大。
转基因作物种类：主要为大豆、玉米、棉花和油菜等，以转基因大豆面积最大。
我国转基因作物研究与利用概况：我国是世界上第一个商品化种植转基因作物的国家。自行培育的双价转基因烟草的抗病虫性达到60％，产量比对照增加15％，产值增加20％。
1.愈伤组织再生系统
2.原生质体再生系统
3.胚状体再生系统
4.生殖细胞受体系统
（四）转基因方法
概括起来说主要有两类：第一类是以载体为媒介的遗传转化，也称为间接转移系统法。
第二类是外源目的DNA的直接转化。
1.载体介导转移系统
将外源基因重组进入适合的载体系统，通过载体将携带的外源基因导入植物细胞，整合在核染色体组中并随核染色体复制和表达。
第一代植酸酶产品以微生物发酵为基础用作饲料添加剂。该项研究工作进一步利用种子生物反应器生产第二代植酸酶产品直接用于饲料加工。将具有自主知识产权的植酸酶基因转化玉米，经过六代选育，得到了表达植酸酶活性达到1000~40，000单位/公斤种子。
我们所要了解的---转基因植物的潜在风险:
1.转基因植物释放引发“超级杂草”
缺点：命中率低，整合率低，受孕率低
核移植（克隆）技术路线——去核+体外培养
②亮光基因标签
③高等哺乳动物受体细胞的条件
细胞系特性——丧失接触抑制性、错地依赖性安全性能好
遗传稳定性
合适的标记
生长快且齐
④高等哺乳动物的载体系统
人腺病毒的DNA（不致癌，基因排斥，安全性好，宿主广，效果好）
猴空泡病毒DNA（SV40）
（5）子房注射法或花粉管通道法：
具有较大子房或胚囊的植株可在田间进行活体操作。操作简便、成本低。
五、转基因食品安全
现在我们的抗虫转基因水稻，已经研究到第三代。第一代转基因水稻，抗虫的蛋白在胚乳里有表达，胚乳就是我们人吃的大米。现在第三代转基因水稻，胚乳里面已经没有这个蛋白了。转基因技术可以控制抗虫蛋白表达的位置，让它在它该表达的地方表达，因为虫子是吃叶，吃茎，它并不吃胚乳，我们就让它在胚乳里面不表达。并不是说第一代不好，只是对于很多不明真相的人来说，第三代更容易克服心理障碍。
氨基酸序列比较设计简并引物PCR扩增文库筛选/RACE
(2)表达序列标签EST是指能够特异性标记某个基因的部分序列，通常包含了该基因足够的结构信息区，可以与其它基因相区分。主要是通过cDNA的途径获得。
获得EST的途径：大规模cDNA文库测序、各种mRNA水平的分析手段
(3)根据连锁图谱克隆目的基因
最常用的启动子是35S启动子，该启动子能够在植物组织中高水平表达。因此已经被引入许多转基因植物中。
潜在风险问题: 35S启动子内有一重组热点。
（1）如果35S启动子插入到隐性病毒基因组旁，可能会重新活化病毒。
（2）启动子插入到某一编码毒素蛋白的基因上游，可能会增强该毒素的合成。
（3）当转基因植物被动物或人类食用后，35S启动子可能会插入到某一致癌基因上游，活化并且导致癌变。
图位克隆技术(Map-based cloning)
(4)转座子标签法
转座子是染色体上一段可复制、移动的DNA片段。当转座子插入到某个功能基因内部时，就会引起该基因的失活，并诱导产生突变型；当转座子再次转座或切离这一位点时，失活基因的功能又可得到恢复。
(5)差异显示法
在生物个体发育不同阶段，或不同的组织与细胞中或不同环境下，基因表达差异。即不同基因有序的时空表达方式，叫做基因的差异表达。差异显示PCR(differential display-PCR,DD-PCR)是指通过对来源特定组织类型的总mRNA进行PCR扩增、电泳，并找出待测组织和对照之间的特异扩增条带。
现代生物学技术
1：2010年诺贝尔生理学或医学奖：试管婴儿
2：人造生命“人造儿”菌落图
细胞工程与胚胎移植
一：细胞工程概述
1：细胞工程：以细胞为对象，应用生命理论科学理论，借助工程学原理和技术。
研究对象：动植物细胞（原生质体）。细胞器、染色体、细胞核、胚胎
2：生物工程：以生命科学为基础，用生物体系和工程学原理。生产生物制品和制造新物种的一种综合技术。
(6) cDNA微阵列, cDNA芯片
cDNA序列（纯样）机器点样在支持物,与荧光标记的不同mRNA样品分别进行杂交,通过激光共聚焦扫描分析不同cDNA序列的杂交信号强度,判断该cDNA在不同mRNA样品中的表达丰度.
(7)电子克隆in silico cloning
借助于电子计算机，利用公布的核酸序列资料，进行序列的拼接和组装最终获得完整基因序列的技术，类似于cDNA文库的筛选但更加方便和快速。
1.动物细胞和组织培养
正常哺乳动物细胞四大生物学特征：锚地依赖性
血清依赖性生长因子
接触依赖性
形态依赖性细胞扁平状
2.细胞融合
物理：离心
化学：PEP
生物技术
单克隆抗体
3.核移植技术
编程与重编程
4.哺乳动物的基因工程
目的：获得转基因个体——优良性状改良
动物工程细胞——蛋白多肽物质
①转基因动物的技术路线
经典技术路线——显微注射+移植
细胞融合剂：聚乙二醇（PEG）、聚乙烯醇（PVC）
(2)基因枪轰击法
将外源DNA包裹在微小的钨粉或金粉颗粒的表面，借助高压动力射入受体细胞或组织，最后整合到植物基因组并得以表达。
(3)电击法
(4)微注射法
细胞操作：利用琼脂糖包埋、聚赖氨酸粘连和微吸管吸附等方式将受体细胞（原生质体或生殖细胞）固定，然后将供体DNA或RNA直接注射进入受体细胞。
第一代生物工程：4000多年前—20世纪30年代
第二代生物工程：30年代—二战期间
微生物工程→生物化学工程→酶工程→基因工程→细胞工程→蛋白质工程（第二代基因工程）→组织工程→代谢工程
3：细胞工程发展历史
①探索期：19世纪末—20世纪中期
动物：1885年卢克斯“组织培养”1907【美】哈林森
植物：1937年【荷兰】温特植物组织培养
2性别控制的意义：①限制生产性状
②增强良性选种
3性别控制技术的发展概况
4哺乳动物的性别控制技术：离心分离法、电泳分离法、免疫分离法、流式细胞仪分离法
5早期胚胎的性别鉴定：①细胞生物学方法
②分子生物学方法
③免疫学方法、H-Y抗原
6性别控制技术的发展前景：提高精子分离度
四、胚胎移植
1、胚胎移植（受精卵移植）
3.抗生素抗性标记基因的生物安全性
抗生素抗性标记基因是否导致的在环境中的传播。
目前，转基因作物都使用细菌编码的抗生素抗性基因作为选择性标记。
在过去的几年里，越来越多的报道指出:细菌可以获得对多种抗生素的抗性。这导致人们开始怀疑：转基因植物中的抗性基因是否会转移到细菌中。
1973年古各树里。植物活性物质生产新途径
1975年科勒·米尔斯坦单克隆抗体
1977年首例试管婴儿
1981年埃文斯·科夫曼分离小鼠胚胎干细胞
A：动植物人工繁殖技术：植物组织培养，人工育种，试管动物，克隆动物
B：细胞充足与新品种培育技术{细胞水平、细胞器水平}
C：生物制品生产技术
D：细胞组织工程技术
二、动物细胞工程
转化体（筛选）
（遗传稳定性评价）
结合常规育种
转基因品种
安全性评价
市场开发
（一）目的基因的获得
根据获得基因的途径主要可以分为两大类：
根据基因表达的产物—蛋白进行基因克隆;从基因组DNA或mRNA序列克隆基因。
1.根据基因表达的产物—蛋白进行基因克隆
主要步骤如下：分离蛋白质明确氨基酸序列推导核苷酸序列人工合成
农杆菌Ti质粒（tumor-inducing plasmid）或Ri质粒(root-indcing plasmid)介导法是迄今为止植物基因工程中应用最多、机理最清楚、最理想的载体转移方法。
(1)叶盘法双子叶植物较为常用、简单有效的方法。
(2)真空渗入法
(3)愈伤组织共培养
2.外源基因直接导入法
（1）化学刺激法
·营养缺陷型的哺乳动物受体细胞
·哺乳动物细胞高效表达外源蛋白的基本原理：基因扩增是外源基因在哺乳动物细胞内高效稳定表达的一种特殊方式。氨甲喋呤（MTX）是动物细胞中的关键代谢酶二氢叶酸还原酶（DHFR）的特异性抑制剂，细胞培养物经氨甲喋呤处理后，绝大多数细胞死亡，但在极少数幸存下来的抗性细胞中，dhfr基因均得以扩增。这些抗性细胞正是通过增加相关基因的拷贝数、提高关键代谢酶的表达水平，从而抵消氨甲喋呤的抑制效应。更重要的是，扩增的区
（二）目的基因重组质粒的构建
分离基因克隆到某中间载体
转化大肠杆菌
提取质粒
限制酶切/连接
克隆到植物表达载体
转化农杆菌基因枪转化
1.双元载体系统:binary Ti vector system
2.载体构建中常用的选择标记
必须具备以下四个条件：
①编码一种不存在于正常植物细胞中的酶；
②基因较小，可构成嵌合基因；
基因重排高病毒基因组和重组分子常发生重排和缺失现象
宿主范围窄只能转染猴细胞
装载量较小
·人乳多瘤病毒DNA（BKV）：人乳多瘤病毒（BKV）属于乳多瘤病毒科乳头瘤病毒属，其基因组为双链DNA，感染宿主细胞后基因不发生整合，独立于染色体而自主复制，每个宿主细胞最高可达500个拷贝。
·人牛痘病毒DNA：目前广泛使用的牛痘病毒表达系统是一种预先构建好的重组病毒其基因组上插入了一个可表达的大肠杆菌T7RNA聚合酶编码基因。在外源基因导入受体细胞之前，先以上述的重组病毒感染细胞，使其大量表达T7RNA聚合酶，然后再将含有外源基因和T7启动子的细菌型重组质粒导入哺乳动物受体细胞，此时外源基因整合在受体细胞染色体DNA上，并在T7RNA聚合酶的作用下表达出重组蛋白。
目前转入植物的基因以抗除草剂的为多，其次以抗虫和抗病毒，然后是抗逆。
如果这些基因逐渐在野生种群中定居后，就具有选择优势的潜在可能，成为难以控制的“超级杂草”。大的潜在危险，可能会对人类健康和人类生存环境造成威胁。
2.转基因植物中35S启动子的生物安全性
启动子是基因表达所必需的，决定了外源基因表达空间、表达时间和表达强度等，是人们定向改造生物的重要限制因素。
经全国基因工程安全委员会批准商品化生产的作物已有：我国自行研制开发的抗虫转基因棉花、美国Monsanto公司开发的Bt抗虫棉、延迟成熟期的转基因番茄、抗黄瓜花叶病毒(CMV)转基因番茄、抗CMV转基因甜椒、转查尔酮合酶（CHS）反义RNA基因矮牵牛。
五、基因工程操作流程
一、转基因育种的程序
基因分离
载体的构建体外重组转化
④检测容易，并且能定量分析。
细菌筛选标记基因：产物给予细胞产生一种选择压力，致使未转化细胞不能生长、发育与分化。而转化细胞对该标记产生抗性，不影响其生长等，从而将转化细胞选择出来。
植物筛选标记基因：百度文库调给转化细胞带上一种标记，起报告和识别作用，故称报告基因。
(三〕受体材料的选择
②诞生期：20世纪70年代
1956—1959年斯沃尔三倍体：三棘刺鱼
1959年张明觉试管兔
1962年仓鼠肾细胞悬浮培养
1965年哈里斯·沃特金斯灭活病毒诱导动物细胞融合
20世纪70年代高国楠聚乙二醇促使植物原生质体融合
1960年兰花无性繁殖
1972年【美】卡尔森NaNO3诱导烟草原生质体融合
4：快速发展时期：20世纪70年代——至今
利用这种方法人类首次人工合成了胰岛素基因。
虽然在早期采用这种方式已经成功地克隆了许多基因。
局限性：兼并密码子、效率低、未知基因及产物
2.从基因组DNA或mRNA序列克隆基因
(1)同源序列法(Homology Based Candidate Gene Method)
根据基因家族成员所编码的蛋白质结构中具有保守氨基酸序列的特点克隆基因家族未知成员。
2、现状和意义
3、胚胎移植的原则
4胚胎移植的基本程序
细胞工程与胚胎移植
一、种苗脱毒快繁
二、
·“白菜—甘蓝”是用细胞工程的方法培育出来的蔬菜新品种，它具有生长期短，耐热性强和易于贮存等优点
三、植物次生代谢
四、植物基因工程
·高等哺乳动物受体细胞的遗传标记
·猴多瘤病毒DNA（SV40）基因表达好外源基因能高效表达
人乳多癌病毒NDA（BKV）
人牛痘病毒DNA
⑤高等哺乳动物的基因转移
物理转化法：硫酸钙共沉淀法
电击转化法
脂质体介导法
显微注射法
血影细胞介导法
病毒传染法
⑥哺乳动物工程生产的重组蛋白（300多种）
利用哺乳动物工程细胞生产人组织纤溶酶素
利用哺乳动物工程细胞生产人凝血因子
三、性别控制
1定义和意义：受精前后人为干预
域远远大于dhfr基因本身，即与dhfr基因相邻的DNA区域同时被扩增。
一、基因工程概述
二、转基因技术的发展现状
自从1983年第一株转基因烟草获得以来，至今已有120种植物转基因获得成功。1996年全球大面积种植，并不断扩大。
转基因作物种类：主要为大豆、玉米、棉花和油菜等，以转基因大豆面积最大。
我国转基因作物研究与利用概况：我国是世界上第一个商品化种植转基因作物的国家。自行培育的双价转基因烟草的抗病虫性达到60％，产量比对照增加15％，产值增加20％。
1.愈伤组织再生系统
2.原生质体再生系统
3.胚状体再生系统
4.生殖细胞受体系统
（四）转基因方法
概括起来说主要有两类：第一类是以载体为媒介的遗传转化，也称为间接转移系统法。
第二类是外源目的DNA的直接转化。
1.载体介导转移系统
将外源基因重组进入适合的载体系统，通过载体将携带的外源基因导入植物细胞，整合在核染色体组中并随核染色体复制和表达。
第一代植酸酶产品以微生物发酵为基础用作饲料添加剂。该项研究工作进一步利用种子生物反应器生产第二代植酸酶产品直接用于饲料加工。将具有自主知识产权的植酸酶基因转化玉米，经过六代选育，得到了表达植酸酶活性达到1000~40，000单位/公斤种子。
我们所要了解的---转基因植物的潜在风险:
1.转基因植物释放引发“超级杂草”
缺点：命中率低，整合率低，受孕率低
核移植（克隆）技术路线——去核+体外培养
②亮光基因标签
③高等哺乳动物受体细胞的条件
细胞系特性——丧失接触抑制性、错地依赖性安全性能好
遗传稳定性
合适的标记
生长快且齐
④高等哺乳动物的载体系统
人腺病毒的DNA（不致癌，基因排斥，安全性好，宿主广，效果好）
猴空泡病毒DNA（SV40）
（5）子房注射法或花粉管通道法：
具有较大子房或胚囊的植株可在田间进行活体操作。操作简便、成本低。
五、转基因食品安全
现在我们的抗虫转基因水稻，已经研究到第三代。第一代转基因水稻，抗虫的蛋白在胚乳里有表达，胚乳就是我们人吃的大米。现在第三代转基因水稻，胚乳里面已经没有这个蛋白了。转基因技术可以控制抗虫蛋白表达的位置，让它在它该表达的地方表达，因为虫子是吃叶，吃茎，它并不吃胚乳，我们就让它在胚乳里面不表达。并不是说第一代不好，只是对于很多不明真相的人来说，第三代更容易克服心理障碍。
氨基酸序列比较设计简并引物PCR扩增文库筛选/RACE
(2)表达序列标签EST是指能够特异性标记某个基因的部分序列，通常包含了该基因足够的结构信息区，可以与其它基因相区分。主要是通过cDNA的途径获得。
获得EST的途径：大规模cDNA文库测序、各种mRNA水平的分析手段
(3)根据连锁图谱克隆目的基因
最常用的启动子是35S启动子，该启动子能够在植物组织中高水平表达。因此已经被引入许多转基因植物中。
潜在风险问题: 35S启动子内有一重组热点。
（1）如果35S启动子插入到隐性病毒基因组旁，可能会重新活化病毒。
（2）启动子插入到某一编码毒素蛋白的基因上游，可能会增强该毒素的合成。
（3）当转基因植物被动物或人类食用后，35S启动子可能会插入到某一致癌基因上游，活化并且导致癌变。
图位克隆技术(Map-based cloning)
(4)转座子标签法
转座子是染色体上一段可复制、移动的DNA片段。当转座子插入到某个功能基因内部时，就会引起该基因的失活，并诱导产生突变型；当转座子再次转座或切离这一位点时，失活基因的功能又可得到恢复。
(5)差异显示法
在生物个体发育不同阶段，或不同的组织与细胞中或不同环境下，基因表达差异。即不同基因有序的时空表达方式，叫做基因的差异表达。差异显示PCR(differential display-PCR,DD-PCR)是指通过对来源特定组织类型的总mRNA进行PCR扩增、电泳，并找出待测组织和对照之间的特异扩增条带。
现代生物学技术
1：2010年诺贝尔生理学或医学奖：试管婴儿
2：人造生命“人造儿”菌落图
细胞工程与胚胎移植
一：细胞工程概述
1：细胞工程：以细胞为对象，应用生命理论科学理论，借助工程学原理和技术。
研究对象：动植物细胞（原生质体）。细胞器、染色体、细胞核、胚胎
2：生物工程：以生命科学为基础，用生物体系和工程学原理。生产生物制品和制造新物种的一种综合技术。
(6) cDNA微阵列, cDNA芯片
cDNA序列（纯样）机器点样在支持物,与荧光标记的不同mRNA样品分别进行杂交,通过激光共聚焦扫描分析不同cDNA序列的杂交信号强度,判断该cDNA在不同mRNA样品中的表达丰度.
(7)电子克隆in silico cloning
借助于电子计算机，利用公布的核酸序列资料，进行序列的拼接和组装最终获得完整基因序列的技术，类似于cDNA文库的筛选但更加方便和快速。
1.动物细胞和组织培养
正常哺乳动物细胞四大生物学特征：锚地依赖性
血清依赖性生长因子
接触依赖性
形态依赖性细胞扁平状
2.细胞融合
物理：离心
化学：PEP
生物技术
单克隆抗体
3.核移植技术
编程与重编程
4.哺乳动物的基因工程
目的：获得转基因个体——优良性状改良
动物工程细胞——蛋白多肽物质
①转基因动物的技术路线
经典技术路线——显微注射+移植
细胞融合剂：聚乙二醇（PEG）、聚乙烯醇（PVC）
(2)基因枪轰击法
将外源DNA包裹在微小的钨粉或金粉颗粒的表面，借助高压动力射入受体细胞或组织，最后整合到植物基因组并得以表达。
(3)电击法
(4)微注射法
细胞操作：利用琼脂糖包埋、聚赖氨酸粘连和微吸管吸附等方式将受体细胞（原生质体或生殖细胞）固定，然后将供体DNA或RNA直接注射进入受体细胞。
第一代生物工程：4000多年前—20世纪30年代
第二代生物工程：30年代—二战期间
微生物工程→生物化学工程→酶工程→基因工程→细胞工程→蛋白质工程（第二代基因工程）→组织工程→代谢工程
3：细胞工程发展历史
①探索期：19世纪末—20世纪中期
动物：1885年卢克斯“组织培养”1907【美】哈林森
植物：1937年【荷兰】温特植物组织培养
2性别控制的意义：①限制生产性状
②增强良性选种
3性别控制技术的发展概况
4哺乳动物的性别控制技术：离心分离法、电泳分离法、免疫分离法、流式细胞仪分离法
5早期胚胎的性别鉴定：①细胞生物学方法
②分子生物学方法
③免疫学方法、H-Y抗原
6性别控制技术的发展前景：提高精子分离度
四、胚胎移植
1、胚胎移植（受精卵移植）
3.抗生素抗性标记基因的生物安全性
抗生素抗性标记基因是否导致的在环境中的传播。
目前，转基因作物都使用细菌编码的抗生素抗性基因作为选择性标记。
在过去的几年里，越来越多的报道指出:细菌可以获得对多种抗生素的抗性。这导致人们开始怀疑：转基因植物中的抗性基因是否会转移到细菌中。
1973年古各树里。植物活性物质生产新途径
1975年科勒·米尔斯坦单克隆抗体
1977年首例试管婴儿
1981年埃文斯·科夫曼分离小鼠胚胎干细胞
A：动植物人工繁殖技术：植物组织培养，人工育种，试管动物，克隆动物
B：细胞充足与新品种培育技术{细胞水平、细胞器水平}
C：生物制品生产技术
D：细胞组织工程技术
二、动物细胞工程
转化体（筛选）
（遗传稳定性评价）
结合常规育种
转基因品种
安全性评价
市场开发
（一）目的基因的获得
根据获得基因的途径主要可以分为两大类：
根据基因表达的产物—蛋白进行基因克隆;从基因组DNA或mRNA序列克隆基因。
1.根据基因表达的产物—蛋白进行基因克隆
主要步骤如下：分离蛋白质明确氨基酸序列推导核苷酸序列人工合成
农杆菌Ti质粒（tumor-inducing plasmid）或Ri质粒(root-indcing plasmid)介导法是迄今为止植物基因工程中应用最多、机理最清楚、最理想的载体转移方法。
(1)叶盘法双子叶植物较为常用、简单有效的方法。
(2)真空渗入法
(3)愈伤组织共培养
2.外源基因直接导入法
（1）化学刺激法
·营养缺陷型的哺乳动物受体细胞
·哺乳动物细胞高效表达外源蛋白的基本原理：基因扩增是外源基因在哺乳动物细胞内高效稳定表达的一种特殊方式。氨甲喋呤（MTX）是动物细胞中的关键代谢酶二氢叶酸还原酶（DHFR）的特异性抑制剂，细胞培养物经氨甲喋呤处理后，绝大多数细胞死亡，但在极少数幸存下来的抗性细胞中，dhfr基因均得以扩增。这些抗性细胞正是通过增加相关基因的拷贝数、提高关键代谢酶的表达水平，从而抵消氨甲喋呤的抑制效应。更重要的是，扩增的区
（二）目的基因重组质粒的构建
分离基因克隆到某中间载体
转化大肠杆菌
提取质粒
限制酶切/连接
克隆到植物表达载体
转化农杆菌基因枪转化
1.双元载体系统:binary Ti vector system
2.载体构建中常用的选择标记
必须具备以下四个条件：
①编码一种不存在于正常植物细胞中的酶；
②基因较小，可构成嵌合基因；
基因重排高病毒基因组和重组分子常发生重排和缺失现象
宿主范围窄只能转染猴细胞
装载量较小
·人乳多瘤病毒DNA（BKV）：人乳多瘤病毒（BKV）属于乳多瘤病毒科乳头瘤病毒属，其基因组为双链DNA，感染宿主细胞后基因不发生整合，独立于染色体而自主复制，每个宿主细胞最高可达500个拷贝。
·人牛痘病毒DNA：目前广泛使用的牛痘病毒表达系统是一种预先构建好的重组病毒其基因组上插入了一个可表达的大肠杆菌T7RNA聚合酶编码基因。在外源基因导入受体细胞之前，先以上述的重组病毒感染细胞，使其大量表达T7RNA聚合酶，然后再将含有外源基因和T7启动子的细菌型重组质粒导入哺乳动物受体细胞，此时外源基因整合在受体细胞染色体DNA上，并在T7RNA聚合酶的作用下表达出重组蛋白。
目前转入植物的基因以抗除草剂的为多，其次以抗虫和抗病毒，然后是抗逆。
如果这些基因逐渐在野生种群中定居后，就具有选择优势的潜在可能，成为难以控制的“超级杂草”。大的潜在危险，可能会对人类健康和人类生存环境造成威胁。
2.转基因植物中35S启动子的生物安全性
启动子是基因表达所必需的，决定了外源基因表达空间、表达时间和表达强度等，是人们定向改造生物的重要限制因素。
经全国基因工程安全委员会批准商品化生产的作物已有：我国自行研制开发的抗虫转基因棉花、美国Monsanto公司开发的Bt抗虫棉、延迟成熟期的转基因番茄、抗黄瓜花叶病毒(CMV)转基因番茄、抗CMV转基因甜椒、转查尔酮合酶（CHS）反义RNA基因矮牵牛。
五、基因工程操作流程
一、转基因育种的程序
基因分离
载体的构建体外重组转化