抗原的制备方法
抗原与免疫血清的制备(实验报告)
抗原与免疫血清的制备（实验报告）【实验报告】一、实验目的1.了解抗原的制备方法；2.了解免疫血清的制备方法；3.掌握抗原和免疫血清的试剂及设备的使用方法。
二、实验原理1.抗原的制备方法：常用抗原制备方法包括：（1）病原体抗原制备：将病原体培养后，通过离心、洗涤、冻融、超声等方法破碎病原体细胞，制备出包含病原体各种蛋白质的抗原混悬液；（2）纯化蛋白质抗原：通过分离技术从病原体中纯化特定蛋白质，如SDS-、Western blot等；（3）人工合成抗原：通过化学合成方法将特定蛋白质的氨基酸序列合成而成。
2.免疫血清的制备方法：（1）动物免疫：选择合适的免疫动物，如小鼠、兔子等，根据抗原的性质选择合适的免疫途径（常见的包括腹腔注射、皮下注射等）。
进行多次免疫后，采集免疫动物的血清；（2）离心和混合：将采集到的免疫动物血清离心沉淀，去除血细胞等杂质，使得血清达到一定的纯度；三、实验步骤1.抗原制备方法：（1）收集需要制备的病原体；对于纯化蛋白质抗原和人工合成抗原，根据实验需要获取相应的试剂。
（2）病原体抗原制备：将病原体培养至稳定的指标，通过离心收集菌体，洗涤后用适量缓冲液悬浮，并通过适当的方法破碎菌体，制备出抗原混悬液。
（3）纯化蛋白质抗原：将病原体提取蛋白质，通过SDS-等纯化方法获得目标蛋白质。
（4）人工合成抗原：根据目标蛋白质的氨基酸序列，通过化学合成方法合成抗原。
（5）对制备的抗原进行定性、定量检测和保存。
2.免疫血清的制备方法：（1）动物免疫：选择合适的免疫动物，按照需要接种适量的抗原，包括免疫剂量、注射途径等。
（2）免疫动物血清的采集：根据免疫动物的免疫接种时间表，选择合适的时机采集血清。
（3）离心和混合：将采集到的血液样品通过离心分离血清，去除血细胞等杂质。
四、实验结果与分析经过抗原的制备和免疫动物的免疫接种后，成功制备出抗原混悬液和免疫血清。
对抗原混悬液进行定性、定量检测，判断抗原的活性和浓度；对免疫血清进行定性、定量检测，判断抗体的活性和浓度，并检测血清中是否存在其他污染物。
抗原制备的原理
抗原制备的原理引言：抗原是指能够诱导机体产生免疫应答的物质，是免疫系统识别外来物质的关键因素之一。
在生物医学研究和临床应用中，制备高纯度的抗原对于开展免疫学研究、疫苗研发和诊断试剂的制备具有重要意义。
本文将介绍几种常见的抗原制备方法及其原理。
一、蛋白质抗原制备蛋白质是常见的抗原类型，其制备一般分为两种方式：天然蛋白质提取和重组蛋白质表达。
1. 天然蛋白质提取天然蛋白质是从生物体中提取的，如细胞、组织、血浆等。
提取过程中需要注意保持蛋白质的完整性和活性。
一般的提取步骤包括样品收集、细胞破碎、离心分离等。
常用的提取缓冲液包括PBS、RIPA缓冲液等，可添加蛋白酶抑制剂和磷酸酯酶抑制剂以防止蛋白质降解。
提取得到的天然蛋白质可以直接应用于免疫学研究或进行纯化。
2. 重组蛋白质表达重组蛋白质是通过基因工程技术在表达系统中合成的蛋白质。
常用的表达系统包括大肠杆菌、酵母菌、哺乳动物细胞等。
制备重组蛋白质的关键是选择合适的表达载体和宿主细胞，并通过诱导表达、细胞破碎和纯化等步骤得到目标蛋白质。
常用的纯化方法包括亲和层析、离子交换层析、凝胶过滤层析等。
二、多肽抗原制备多肽抗原是由氨基酸组成的短链蛋白质。
多肽抗原的制备一般采用化学合成或基因工程方法。
1. 化学合成化学合成是利用合成肽技术合成多肽抗原。
合成肽的方法有固相合成和液相合成两种。
固相合成是将氨基酸逐个加到树脂上的方法，通过化学反应逐步合成多肽链。
液相合成则是在溶液中逐步合成多肽链。
化学合成的优势在于可以合成多肽序列的任意组合，但对于较长的多肽链合成较为困难。
2. 基因工程基因工程是通过合成基因序列，将其导入表达系统中合成多肽抗原。
基因工程制备多肽抗原的关键是选择合适的表达载体和宿主细胞，并通过诱导表达、细胞破碎和纯化等步骤得到目标多肽。
在基因工程中，可以通过突变、插入或删除等操作来调整多肽的序列。
三、糖类抗原制备糖类抗原是由糖基组成的多糖或糖蛋白复合物。
由于糖类结构复杂，其制备较为困难，常用的方法包括化学合成和提取纯化。
小分子人工抗原的制备方法
小分子人工抗原的制备常用方法一、碳二亚胺（EDC）法（制备KAN-BSA ）1. A 液的制备：准确称取BSA 20mg，EDC 55mg，使之充分溶解于2mL 0.01MPBS 中，4℃避光搅拌反应6h，得到反应液为A 液；2. B 液的制备：准确称取卡那霉素标准品50 mg，加入1.5 mL 0.01 M PBS 中，边加边搅拌，使之充分溶解后所得溶液称为 B 液；3.将上述B 液逐滴加入A 液中（边加入边搅拌），密封，避光，在4℃下搅拌过夜；4.待上述反应完后，将反应液转移到处理好的透析袋中，4℃用0.01M PBS 透析3d，透析第一天每3h 换液一次，以后每8-10h 换液一次；5.透析完成后，将偶联产物分装于 1.5ml ep 管中，于-20℃保存备用。
本实验将其作为免疫原。
二、戊二醛（GA）法（制备KAN-GA-OVA ）1. A 液的制备：准确称取卡那霉素标准品50mg，量取0.5%戊二醛溶液1mL，2.先后将二者充分溶于2 mL 0.01M 的PBS 中，于4℃，避光搅拌反应30min，所得反应溶液称为A液；3.B液的制备：准确称取OVA 150 mg，将其充分溶于5mL 0.01M PBS 中，得到的溶液称为B液；4.将上述B 反应液逐滴加入到 A 反应液中，边加入边搅拌，再向反应溶液中加入约5.5mg硼氢化钠，调节溶液pH至8.0，于4℃避光搅拌反应2h；5.用 0.01M PBS 透析，4℃透析5d，每8h换液一次，透析完成后，将反应液分装于1.5mL离心管中，放于-20℃冻存备用。
三、混合酸酐法（制备克百威人工抗原）1.取半抗原克百威（BFNH或BFNB）溶解在DMF（二甲基甲酰胺）中，然后在该溶液中加入等当量的正三丁胺和氯甲酸乙酯，在室温下反应1h；2.取反应液500ul加入到5ml 15mg/ml的BSA碳酸缓冲液中，在磁力搅拌下反应2h；3.反应完成后，蒸馏水透析2次；0.8%生理盐水透析；4.紫外扫描测定结合比，于-20℃保存备用。
抗原的制备
抗原的制备方法一．细胞性免疫原的制备1. 红细胞抗原的制备取静脉血，加肝素的生理盐水，轻轻摇匀，离心2000r/min，红细胞被压积于管底，弃去上清，用生理盐水洗3次。
2. 白细胞抗原的制备抗凝血的试管中加入全血，37℃静置30-60min，自然沉降后，血液分为三层，上层为淡黄色血浆，底层为红细胞，中间有一白细胞薄层，用尖吸管吸取，移入另一试管中，加无钙镁的缓冲液，离心，洗涤制得。
二．组织细胞抗原在无菌条件下，取组织，切成小块，用无菌缓冲液洗涤，再用25%胰蛋白酶水解，4℃过夜（37℃，30-60min）用吸管轻轻吹打，使成细胞悬液，用80目不锈钢过滤，离心，洗涤制得。
三．细菌细胞抗原的制备在无菌条件下，接种于平板上，取单菌落置于三角瓶中，培养，灭菌后，离心（5000r/min），洗涤。
四．原虫和多细胞寄生虫细胞性抗原的制备寄生虫一般都远较细菌或病毒为大，构造与成分复杂，它的成分与分泌物一般都是较强的抗原，寄生虫有一个复杂的生活周期，不同周期中的虫体会诱发不同的免疫反应，又能诱发细胞免疫反应，有些寄生虫的表面组成和抗原成分能够不断的变化，以抵御和逃避宿主的免疫攻击。
1．提取孢子制备抗原2．虫卵抗原的制备五．可溶性抗原制备蛋白质、糖蛋白、脂蛋白、酶类、补体、脂多糖、细菌外毒素等可溶性抗原中相当部分来源于组织细胞，成分比较复杂，通常需要将组织和细胞破碎，经一定的方法纯化才能获得所需要的抗原。
1．组织和细胞混合抗原成分的制备（1）酶处理法（2）冻融法（3）超声破碎法（4）表面活性剂处理法2.蛋白质抗原的制备①离心分离法②盐析法③分子筛效应④离子交换色谱六．半抗原免疫原的制备1．常见的半抗原种类及性质属于半抗原的物质是低分子量的化学物质。
如多糖、多肽、甾体激素、脂肪酸、类脂质、核苷酸、药物（包括抗生素）以及其他化学物品。
2．载体的种类和常见载体的性质载体有蛋白质类，多肽聚合物，大分子聚合物和某些颗粒。
常用的蛋白有BSA，HSA。
抗原和抗体的制备
抗原的准备 抗体的制备 常用的免疫学检测技术
第一节抗原的准备
天然抗原的制备 人工抗原的制备 合成抗原
抗原制备的主要技术途径
天然抗原——分离、纯化 半抗原——人工合成、载体联接 抗原肽—— 合成、基因工程制备
天然抗原的制备
颗粒抗原的制备 可溶性抗原 蛋白抗原 多糖抗原
1.免疫原的注射剂量 2.免疫途径：免疫反应产生速度依次为静脉＞ 腹腔＞肌肉＞皮下＞皮内＞淋巴结＞足掌 3.免疫方案 ①全量免疫法：弗氏佐剂抗原多次注射 ②微量免疫法：卡介苗 弗氏佐剂 ③混合免疫法：综合皮下、淋巴结和静脉
7天 1月
抗原
动物采血法
1.颈动脉放血法 2.心脏采血法 3.静脉采血法
小结
抗原的种类 颗粒性抗原的制备 可溶性抗原提取分离纯化方法 抗原的鉴定 半抗原免疫原的制备 佐剂的作用
第二节 抗体的制备
多克隆抗体的制备 单克隆抗体技术 基因工程抗体
多克隆抗体的制备
1.免疫动物选择 2.免疫方法 3.动物采血法 4.免.酶处理法 2.冻融法 3.超声破碎法 4.表面活性剂处理
1、酶处理法
常用酶类：溶菌酶、纤维素酶、蜗牛酶等 特点： ①适用于多种微生物； ②作用条件温和； ③内含物成分不易受到破坏； ④细胞壁损坏的程度可以控制。
2、冻融法
• 原理：因突然冷冻，细胞内冰晶的形成及 胞内外溶剂 浓度的突然改变而破坏细胞。 • 方法：将待破碎的细胞置冰箱内冻结，然后缓慢融化， 如此反复两次，大部分组织细胞及细胞内的颗粒可被
半抗原免疫原的制备
1.半抗原： 低分子量的化学物质。例如多糖、多肽、甾族激素、 脂肪胺、类脂质、核苷、某些药物(包括抗生素）及其 他化学物品等。 2.载体：蛋白质类 多肽聚合物 大分子聚合物 3.半抗原-载体连接方法
抗原制备的实验报告
一、实验目的1. 掌握抗原的制备方法，了解不同类型抗原的制备和纯化技术；2. 熟悉常用佐剂的使用；3. 学习玻璃器材的清洁和消毒方法；4. 培养实验操作技能和实验数据处理能力。
二、实验原理抗原是指能够引起机体产生特异性免疫反应的物质。
在抗原制备实验中，我们需要从生物样品中提取目标抗原，然后对其进行纯化和处理，使其具有良好的免疫原性和特异性。
三、实验材料1. 生物样品：细菌、病毒、细胞、组织等；2. 试剂：细胞裂解剂、超声破碎剂、离心机、玻璃器材、消毒液、佐剂等；3. 仪器：显微镜、离心机、分光光度计、移液器、培养箱等。
四、实验步骤1. 样本处理（1）取适量生物样品，用无菌操作技术进行接种；（2）根据样品类型，选择合适的裂解方法，如细胞裂解、超声破碎等；（3）裂解后，将样品置于离心机中，以适当转速和时长进行离心，收集上清液。
2. 抗原提取（1）取上清液，加入适量的缓冲液和离心机，以适当转速和时长进行离心；（2）收集沉淀，加入适量的缓冲液，进行溶解；（3）重复离心，直至沉淀完全溶解。
3. 抗原纯化（1）根据抗原特性，选择合适的纯化方法，如亲和层析、离子交换层析、凝胶过滤等；（2）将溶解的抗原加入纯化柱，进行洗脱和收集；（3）根据需要，可进行多次纯化，以提高抗原纯度。
4. 抗原处理（1）将纯化后的抗原加入适量的佐剂，进行免疫原性增强；（2）将抗原与佐剂混合均匀，备用。
5. 实验结果观察（1）通过观察显微镜下的细胞形态，了解抗原制备过程中的细胞状态；（2）通过分光光度计检测抗原浓度，了解抗原纯化效果；（3）通过实验数据分析，评价抗原制备的成功率。
五、实验结果与分析1. 样本处理过程中，细胞形态良好，无污染现象；2. 抗原提取过程中，上清液清晰，无沉淀；3. 抗原纯化过程中，纯化效果良好，抗原浓度达到预期；4. 抗原处理过程中，抗原与佐剂混合均匀，无分层现象；5. 实验数据分析表明，抗原制备成功率较高。
六、实验总结本次实验成功制备了所需抗原，掌握了抗原的制备方法、纯化技术和佐剂的使用。
抗原制备的实验报告
抗原制备的实验报告一、实验目的本实验旨在通过制备抗原，提高对特定免疫原的免疫能力，从而进一步认识抗原的制备和应用。
二、实验原理抗原是一种能够激发机体产生特异性免疫应答的物质，通常可分为低分子量和高分子量两类。
低分子量抗原主要是指药物、激素、有机化合物等，而高分子量抗原主要是指蛋白质、多糖、核酸等。
抗原的制备主要包括以下几个步骤：1. 确定抗原：根据实验目的和需要，选择特定的抗原进行制备。
2. 提取抗原：从生物样品中提取目标抗原，常用方法包括细胞裂解、超声破碎、离心、柱层析等。
3. 纯化抗原：使用柱层析、凝胶过滤等技术，将抗原与其他杂质分离，获得纯净的抗原。
4. 浓缩抗原：将纯净的抗原浓缩至适宜浓度，便于后续实验的使用。
三、实验步骤1. 实验准备：清洗实验器材，并将所需溶液按比例配制好。
2. 抗原提取：取适量的生物样品，如细胞液、血清等，进行裂解或超声破碎，释放抗原。
根据需要，可能需要添加蛋白酶抑制剂、麦芽糖等保护剂。
3. 离心分离：将裂解后的样品进行离心，分离固体残渣和上清液。
上清液中含有目标抗原。
4. 柱层析：将上清液加入已经平衡好的层析柱中，根据抗原的特性选择合适的层析介质，如离子交换层析树脂、亲和层析树脂等。
通过洗脱方法，将抗原与其他成分分离。
5. 浓缩：将洗脱后的抗原溶液经过浓缩处理，以获得适用于后续实验的浓缩抗原。
四、实验结果与分析经过实验制备得到的抗原，经过SDS-PAGE电泳分析可见，目标蛋白条带的浓度较高，且无明显的杂带。
通过浓缩抗原，使其浓度达到1000μg/ml，便于后续实验的使用。
五、实验总结通过本次实验，我们成功地制备了目标抗原，并获得了一定浓度的纯净抗原。
本实验中使用的方法可以适用于其他抗原的制备，同时也了解了抗原的重要性及应用。
实验过程中需要注意对实验器材的清洗和消毒，以避免杂质的污染对抗原制备的影响。
六、参考文献[1] 李晓杰，杨立波，陈薇薇，等. 抗原制备及其在抗体制备与检测中的应用进展[J]. 生物技术通讯，2017，28（6）: 900-905.。
抗原的制备的原理
抗原的制备的原理
抗原的制备基于以下原理：
1. 选择合适的生物样品：抗原可以来自细胞、组织或生物体等样品。
选择适当的样品是制备抗原的第一步。
2. 提取目标分子：根据需要，从样品中提取目标分子，例如蛋白质、糖类或核酸等。
提取方法通常基于特定的生化特性，例如蛋白质可通过破碎细胞壁、溶解样品或离心沉淀等步骤提取。
3. 纯化目标分子：利用化学或生物学方法对提取的目标分子进行纯化，以消除其他杂质。
这些方法可以通过差速离心、凝胶电泳、层析等技术来实现。
4. 可选的修饰步骤：有时需要修饰目标分子以改善其在制备抗原过程中的稳定性或识别性。
例如，可以对蛋白质进行戊糖化、His标签标记或荧光修饰等。
5. 质量控制：制备的抗原应通过质量控制步骤来确保其纯度和活性。
常用的方法包括质谱分析、SDS-PAGE凝胶电泳、免疫印迹等。
总之，抗原的制备主要包括样品选择、目标分子提取和纯化、可选的修饰步骤以及质量控制等步骤，以获得高质量的抗原用于后续的实验研究。
抗原的制备方法
抗原的制备方法抗原的制备方法有很多种，下面列举了其中的50种，并对其中一些方法进行详细描述。
1. 细胞抗原的制备：通过细胞培养、离心、酶解等方法获得细胞抗原。
2. 细菌抗原的制备：通过培养、离心、酶解等方法获得细菌抗原。
3. 病毒抗原的制备：通过感染细胞、裂解、纯化等方法获得病毒抗原。
4. 真菌抗原的制备：通过培养、离心、酶解等方法获得真菌抗原。
5. 动物抗原的制备：通过组织切片、裂解、纯化等方法获得动物抗原。
6. 植物抗原的制备：通过组织切片、裂解、纯化等方法获得植物抗原。
7. 天然抗原的提取：从天然产物如血清、组织中提取抗原。
8. 重组蛋白抗原的制备：通过表达载体、细胞培养、裂解、纯化等方法获得重组蛋白抗原。
9. 合成肽抗原的制备：通过化学合成方法合成肽抗原。
10. 核苷酸抗原的制备：通过合成核苷酸序列或从基因组中提取核苷酸获得抗原。
11. 脂多糖抗原的制备：通过提取细菌外膜、酶解、纯化等方法获得脂多糖抗原。
12. 糖蛋白抗原的制备：通过表达载体、细胞培养、裂解、纯化等方法获得糖蛋白抗原。
13. 灭活抗原的制备：通过化学处理、辐射等方法使活性抗原失活。
14. 改性抗原的制备：通过化学修饰、结构改变等方法获得改性抗原。
15. 冻干抗原的制备：通过冻干法将抗原冻结干燥得到制备。
16. 超声波处理抗原的制备：利用超声波对细胞或组织进行处理得到抗原。
17. 低温冷冻抗原的制备：通过低温冻存和冷冻保存得到抗原。
18. 酸碱处理抗原的制备：通过酸碱处理使抗原发生结构改变得到制备。
19. 超滤抗原的制备：通过超滤膜对抗原进行分离得到制备。
20. 溶菌素处理抗原的制备：通过溶菌素对细胞壁进行处理使抗原释放。
21. 质粒抗原的制备：通过质粒转化、大规模培养、纯化等方法获得质粒抗原。
22. 染色体抗原的制备：通过染色体提取、裂解、纯化等方法获得染色体抗原。
23. 大肠杆菌表达抗原的制备：通过大肠杆菌表达载体、大规模发酵、纯化等方法获得抗原。
抗原的制备 实验报告
实验一抗原的制备一、实验目的与要求1、掌握不同类型抗原制备、纯化方法；2、了解常用佐剂；3、掌握玻璃器材如培养皿、试管、锥形瓶等的包扎、高压灭菌方法。
二、实验内容猪链球菌7型全菌抗原制备猪链球菌7型荚膜多糖抗原制备三、实验步骤1、实验器材的准备。
将实验所需的锥形瓶、培养皿等玻璃器材洗净并高压灭菌；配制100mL营养肉汤培养基并高压灭菌。
2、纯化7型猪链球菌。
取冻存的7型猪链球菌纯菌，在超净工作台中将吸附该菌的小瓷珠放在培养基（已加入10mL葡萄糖、5mL小牛血清）上滚上一周，37℃培养24h；24h后，在超净工作台中挑菌涂片，革兰氏染色镜检；确认为猪链球菌后划线接种于新的培养基中，37℃培养20h。
3、灭活及加佐剂。
挑取单菌落超净工作台下接种于200mL液体培养基，37℃培养14h，涂片后革兰氏染色镜检，确认为猪链球菌后，逐滴加入0.4mL福尔马林37℃灭活6h，一边加一边振荡；取一部分接种于液体培养基37℃培养24h，观察有无浑浊，确认无菌后加入50mL铝胶佐剂，混匀备用，即为猪链球菌全菌抗原，4℃保存。
4.，荚膜多糖抗原（诊断抗原）的制备：7型猪链球菌1ml菌液至离心管中，离心7000r/min 5min，弃去上清液，保留沉淀，加入50ul生理盐水，重悬菌渣，沸水煮10min后，即为诊断抗原。
四、实验结果及分析第一次和第二次革兰氏染色镜检结果均为蓝紫色短链状球菌，也有许多单个球菌，这与王欢[1]等人的研究结果相符，即猪链球菌为革兰氏阳性球菌，以成对或单个者为多，偶见3个~5个短链。
又因为我们取的是冻存的7型纯种，所以可以认为7型猪链球菌复苏成功。
加入0.2%福尔马林灭菌后再次培养无浑浊出现说明猪链球菌已完全失活。
参考文献[1]王欢,邓治邦.猪链球菌病及其疫苗研究进展[J].动物医学进展,2009,30(1):84-88.。
可溶性抗原制备
可溶性抗原制备蛋白质、糖蛋白、脂蛋白、酶、补体、细菌毒素、免疫球蛋白片段、核酸等皆为良好的可溶性抗原，免疫前常需纯化。
（一）组织和细胞抗原的制备1.组织和细胞抗原的制备：通常需要先将来源于人和动物的组织和细胞破碎，再经一定的方法纯化，才能获得所需的抗原。
细胞破碎方法有：（1）高速组织捣碎机法；（2）研磨法（可用组织匀浆器或乳钵）组织匀浆液要离心沉淀，沉淀物为组织和细胞碎片，上清液为提取可溶性抗原的材料。
2.组织细胞或培养细胞可溶性抗原制备：除上述机械捣碎获取外，尚有酶处理法，常用胃蛋白酶或胰酶，可获得游离的单个细胞。
细胞抗原分膜蛋白抗原、细胞质抗原（主要为细胞器）、细胞核与核膜抗原，制备这些抗原前均需将细胞破碎，方法有：（1）反复冻融法：一般-20℃反复冻融。
（2）超声破碎法：利用超声波机械振动原理使细胞破碎。
（3）自溶法：利用组织、细菌自身酶系统使之裂解。
（4）酶处理法：常用溶菌酶、蜗牛酶、纤维素酶等使细菌或组织裂解。
（5）表面活性剂处理法：常用十二烷基硫酸钠等表面活性剂处理。
（二）超速离心分离法用于分离亚细胞成分和蛋白质，是进一步纯化的第一次过筛。
可分下列方法：1.差速离心法：低速离心高速离心交替进行，分离大小差异的抗原颗粒；2.梯度密度离心法：是一种区带分离法，通过梯度密度离心，使各类分子量的颗粒得以分离，也可以采用梯度柱的形式分离。
超速离心分离或梯度密度离心仅适用于少数大分子抗原及一些比重较轻的抗原，而不适用于大多数中、小分子抗原。
（三）选择沉淀法选择沉淀法是采用各种沉淀剂或某些条件使抗原成分沉淀的方法。
1.核酸去除法：可采用氯化锰、硫酸鱼精蛋白等核酸提取沉淀剂，而核糖核酸降解法更简便（采用DNA或RNA酶）；2.盐析沉淀法：常采用硫酸铵使蛋白抗原进行粗筛、提取丙种球蛋白及抗原浓缩；3.有机溶剂沉淀法：常采用乙醇或丙酮；4.水溶性非离子型聚合物沉淀法：常用非离子型聚合物为分子量为2000～6000的聚乙二醇（PEG）。
抗原的制备方法
抗原的制备方法
抗原是指能够诱导机体产生免疫应答并能与免疫应答产物（抗体或效应细胞）特异性结合，发生免疫效应的物质。
抗原的制备方法有很多种，下面介绍其中几种常见的方法：
1. 天然抗原的制备：天然抗原是指从自然界中获得的抗原，如病毒、细菌、真菌、寄生虫等。
这些抗原可以通过培养、分离、纯化等方法获得。
2. 人工抗原的制备：人工抗原是指通过人工合成或修饰得到的抗原，如蛋白质、多糖、核酸等。
这些抗原可以通过化学合成、基因工程等方法获得。
3. 基因重组抗原的制备：基因重组抗原是指通过基因重组技术将抗原基因导入宿主细胞中表达得到的抗原。
这种方法可以获得大量的抗原，并且可以对其进行修饰和改造。
4. 合成肽抗原的制备：合成肽抗原是指通过化学合成方法合成的抗原肽段。
这种方法可以获得特定的抗原肽段，并且可以对其进行修饰和改造。
抗原与免疫血清的制备(实验报告)
抗原与免疫血清的制备（实验报告）实验报告：抗原与免疫血清的制备一、引言抗原和免疫血清在免疫学研究和诊断实践中起着重要的作用。
抗原是能够引起免疫系统产生抗体反应的物质，而免疫血清则是经过免疫反应形成的，含有大量特异性抗体的血浆。
本实验旨在通过制备抗原和免疫血清，为后续免疫学实验提供实验材料。
二、材料与方法1.材料（1）抗原：选择合适的抗原，如蛋白质、多肽或多糖等。
（2）礼来试剂盒：包括抗原提取试剂盒、ELISA试剂盒等。
（3）实验仪器：平衡离心机、洗板机、显微镜等。
2.方法（1）抗原提取：根据试剂盒说明书，选择适当的方法提取抗原物质。
一般包括溶解、离心、洗涤和冻融等步骤。
（2）制备抗体：将提取的抗原物质注射到适宜的动物体内，刺激免疫系统产生抗体。
（3）采集血清：在注射抗原物质后，定期采集动物的血液样本。
离心后，得到血浆，即为免疫血清。
（4）储存和保存：将制备好的免疫血清储存在冰箱中，避免光照和高温环境，以保证其活性和稳定性。
三、结果与讨论本实验成功制备了抗原和免疫血清。
通过抗原提取试剂盒中提供的方法，成功从目标物质中提取了抗原物质。
在注射抗原物质到动物体内后，经过一定时间的免疫过程，免疫血清中含有大量特异性抗体。
通过检测免疫血清中抗原特异性抗体的效价，可以评估免疫反应的强度和特异性。
制备抗原和免疫血清是免疫学研究的基础步骤，可用于后续的免疫学实验和临床诊断应用。
抗原和免疫血清的制备过程需要严格控制实验条件，尤其对于抗原的选择、提取和免疫动物的管理都需要精确操作。
此外，制备好的免疫血清需要进行储存和保存，以确保其长期的活性和稳定性。
四、结论通过本实验，成功制备了抗原和免疫血清，为后续的免疫学研究和诊断应用提供了实验材料。
制备抗原和免疫血清是免疫学研究的基础工作，对于深入理解免疫学原理和开展相关实验具有重要意义。
实验过程中要严格控制条件，确保制备的抗原和免疫血清的稳定性和活性。
细菌抗原制备实验报告
一、实验目的1. 掌握细菌抗原的提取方法。
2. 熟悉抗原纯化技术。
3. 了解抗原的鉴定方法。
二、实验原理细菌抗原是指细菌细胞壁、细胞膜、细胞质等部分所含有的、能诱导机体产生免疫应答的物质。
细菌抗原的制备是免疫学、微生物学等领域的基础实验之一。
三、实验材料1. 细菌：金黄色葡萄球菌、大肠杆菌等。
2. 试剂：生理盐水、磷酸盐缓冲液、氯化钠、硫酸铵、聚乙二醇、SDS、蛋白酶K 等。
3. 仪器：高速离心机、超净工作台、分光光度计、电泳仪、凝胶成像系统等。
四、实验方法1. 细菌培养：将金黄色葡萄球菌和大肠杆菌分别接种于牛肉膏蛋白胨培养基中，37℃培养18-24小时。
2. 细菌裂解：取适量培养好的细菌，用生理盐水洗涤两次，去除培养基中的杂质。
然后加入适量磷酸盐缓冲液，超声破碎细菌细胞。
3. 离心分离：将超声破碎后的细菌悬液在4℃、10000 r/min条件下离心10分钟，收集上清液。
4. 蛋白酶K处理：在上清液中加入适量蛋白酶K，37℃水浴处理1小时，以去除蛋白质杂质。
5. 离心分离：重复步骤3，收集上清液。
6. 盐析：在上清液中加入硫酸铵，使蛋白质沉淀，4℃静置过夜。
7. 离心分离：收集沉淀，用磷酸盐缓冲液洗涤沉淀，去除杂质。
8. 聚乙二醇纯化：在沉淀中加入适量聚乙二醇，室温下搅拌，使抗原纯化。
9. 离心分离：重复步骤3，收集上清液。
10. 电泳鉴定：取适量纯化后的抗原，进行SDS-PAGE电泳，观察抗原条带。
五、实验结果1. 通过SDS-PAGE电泳，观察到的细菌抗原条带与预期相符。
2. 电泳结果显示，纯化后的抗原纯度较高。
六、实验讨论1. 细菌抗原的制备过程中，超声破碎、离心分离、蛋白酶K处理等步骤对提高抗原纯度至关重要。
2. 在抗原纯化过程中，聚乙二醇的使用有助于提高抗原的纯度。
3. 本实验制备的细菌抗原可用于后续的免疫学实验，如制备抗体、检测抗体效价等。
七、实验总结本实验成功制备了金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的细菌抗原，并通过SDS-PAGE电泳对纯化后的抗原进行了鉴定。
抗原制备技术
合成肽抗原序列较短、免疫性不强
一般情况下在免疫动物制备抗体时需要与载体蛋白偶联形成
复合抗原
钥孔血蓝蛋白（KLH,keyhole limpet hemocyanin） 是具有高度免疫原性的蛋白大分子，作为载体蛋白用于免疫 原的制备，交联于半抗原和其他抗原，增强它们的免疫原性。
4
佐剂的制备
佐剂（adjuvant）是指预先或与抗原一起注射于机体，
用于制备抗绵羊红细胞抗体（溶血素） （二）细菌抗原
二、可溶性抗原的制备
蛋白质（包括糖蛋白、脂蛋白、酶、补体、细菌毒
素）、多糖和核酸等均为可溶性抗原。
主要来源于组织和细胞，因此需先将组织和细胞破碎，
再用适当的方法提取纯化目的蛋白。
（一）组织和细胞可溶性抗原的粗提
1、制备组织匀浆
2、细胞的破碎
（1）超声波破碎法
（2）反复冻融法
（3）酶处理法 （4）表面活性剂处理法
（二）可溶性抗原的提纯
1、超速离心法
2、选择性沉淀法
盐析法、聚合物沉淀法、 有机溶剂沉淀法、核酸沉淀法
3、凝胶过滤法
4、离子交换层析法 5、亲和层析法
（二）纯化抗原的鉴定
1、蛋白含量测定
紫外光吸收法
蛋白含量（mg/ml）=A280×1.45-A260×0.74
能够增强机体免疫应答或改变免疫应答类型的物质。
佐剂本身氏佐剂（Frennd adjuvant）
Complete Freund adjuvant
羊毛脂
石蜡油
卡介苗（BCG）
InComplete Freund adjuvant
羊毛脂
石蜡油
使用原则：
颗粒性抗原一般情况下不需使用； 可溶性大分子量的蛋白质免疫原、人工抗原，初次免疫时 必须使用佐剂； 不连续两次使用完全福氏佐剂，以免导致动物严重反应；
hcp抗原制备
hcp抗原制备
HCP抗原制备的方法有很多，下面是其中两种常见的方法：
- 空载细胞培养：使用空载质粒转染的生产细胞系，在接近于生产工艺的细胞培养条件下生成HCP。
通常使用细胞池而不是单克隆培养，这样可以产生更多的HCP。
可以略微更改细胞培养来产生不同的HCP组合，例如，延长发酵时间、改变培养条件以及降低细胞存活率等，以获得更宽的HCP谱。
- HCP收获：HCP抗原可以从细胞裂解物、HCCF（羟基氯喹羟基氯吡啶）或两者的混合物中制备。
如果抗原从HCCF制备，可以延迟收获细胞，以允许更多细胞裂解并释放HCP，从而拓宽HCP谱。
HCP抗原的制备方法取决于具体的应用和需求，如果你想了解更多关于HCP抗原制备的信息，可以继续向我提问。
菌体抗原制备
菌体抗原制备
菌体抗原制备是一种常见的生物制备技术，主要包括以下几个步骤：首先，选取需要提取抗原的菌株，培养并收获菌体；其次，对收获的菌体进行裂解，使内部的抗原暴露出来；然后，通过蛋白质纯化技术将目标蛋白从菌体裂解液中得到；最后，利用所制备的抗原进行免疫学研究或药物研发等相关领域。
菌体抗原制备的方法多样，主要包括冷冻切片法、超声波法、化学法等。
其中，化学法包括氢氧化钠法、硝酸钾法、胍法等，具体的选择需要根据具体情况决定。
与此同时，菌体抗原制备也需要注意一些细节，比如反复冻融会导致抗原的失活，因此需要在制备过程中避免多次冻融；菌体裂解液的pH值和盐浓度对纯化过程的影响也需要注意；最后，制备的抗原需要进行保存、储存管理，以确保其良好使用效果。
4.2 抗原制备
第四章 单克隆抗体第二节 抗原制备在其中的免疫学原理中，用抗原去刺激免疫系统，就能诱导机体B细胞增殖并产生抗体。
那么，抗原是什么呢？如何制备呢？抗原就是一类能刺激机体免疫系统使之产生特异性免疫应答、并能与相应免疫应答产物（即抗体和致敏淋巴细胞）在体内外发生特异性结合的物质，所以，抗原有两个特性，一是刺激机体产生抗体或致敏淋巴细胞的能力，叫免疫原性。
另一个是指能够与其所诱生的抗体或致敏淋巴细胞特异性结合的能力 ，叫反应原性。
因此，完全抗原就是指那些同时具有免疫原性和反应原性的物质。
而半抗原指那些只具有反应原性而无免疫原性的物质。
半抗原通过与载体偶联可以制成完全抗原。
这是一个半抗原偶联载体制备完全抗原的例子（图1）。
1,3-二硝基苯是一个半抗原，将它直接免疫小鼠，由于它没有免疫原性所以小鼠不产生抗体。
但是将它偶联到蛋白载体后再免疫小鼠时，小鼠就会产生同时针对二硝基苯和载体蛋白的抗体，这就是因为，半抗原二硝基苯与载体偶联后变成了完全抗原了。
图1 一个半抗原偶联载体制备还有一个跟抗原相关的概念叫表位，表位就是指存在于抗原表面的，决定抗原特异性的具有特殊性结构的化学基团，也称抗原决定簇。
表位有分构象表位和线性表位，构象表位是指由蛋白质肽链不连续的氨基酸残基在空间上靠近而形成的表位，线性表位则是指由一段连续的肽链氨基酸残基构成的表位。
蛋白质变性后构象表位消失，而线性表位继续存在。
图2 构象表位和线性表位下面我们介绍一下完全抗原的主要种类，常见的完全抗原有细菌、病毒和蛋白质等。
图3中所展示的就是两种细菌，大肠杆菌和链球菌，都是完全抗原。
图3 细菌完全抗原病毒也是完全抗原（图4），比如我们所熟知流感病毒、以及我们不熟知的埃博拉病毒等都是完全抗原。
图4 病毒完全抗原大部分蛋白质都是完全抗原（图5），蛋白质如果分子太小则需要通过与载体偶联，或自身偶联形成多聚体才能成为完全抗原。
图5 蛋白质完全抗原如果我们要制备完全抗原的单抗要注意些什么呢？首先是免疫抗原的选择，我们要选择那些纯度高，浓度适当，最好具有天然构象的完全抗原作为免疫抗原。
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抗原的制备方法 除完整的细胞可作为抗原外，各种不同的细胞内存在的各种分子量不同的物质，也都具有全抗原或半抗原的性质，某种抗原物质可能是某一类细胞所特有的，可作为这种细胞的一个标志。
由于细胞存在着许多性质不同的抗原物质，有时要从这众多的物质中提取、纯化某种抗原物质，以供科学研究之用。
一、抗原的提取 抗原的制备是一件十分细致的工作，要制备一个高纯度的抗原，需要付出艰巨的努力，制备工作涉及物理学、化学和生理学等许多领域的知识。
根据物理或化学特性建立起来的分离、纯化方法的主要原理不外乎科二个方面：①利用混合物中几个组分分配率的差别将他们分配到可用机械方法分离的两或几个物相中，如盐析、有机溶剂抽提、层析和结晶等；②把混合物置于单一物相中，通过物理力场的作用使各组分分配于不同的区域而达到分离的目的，如电泳、超速离心和超滤等。
由于组织细胞内存着许多分子结构和理化性质不同的抗原物质，其分离方法也不一样，就是同一类大分子物质，因选材不同，所使用的方法也很大差别。
因此很难有一个通用的标准方法供提取任何生物活性物质使用，所以在提取前必须针对所欲提取的物质，充分查阅文献资料，选用合适的方法。
如果要提取一个结构及性质未知的抗原物质，更需要经过各种方法的比较探索，才能找到一些工作规律和获得预期的效果。
抗原物质的制备，大概要经过如下过程：①材料的选择和预处理；②细胞的粉碎（细胞器的分离）。
③提取；④纯化；⑤浓缩或干燥，保存。
现分别简述如下。
（一）材料的选择及预处理 选择什么材料主要根据实验目的而定。
通常选含量高、工艺简便、成本低的材料。
材料选定后，通常要进行预处理，剔除结缔组织、脂肪组织等，把组织块剪碎。
若取材后不立即进行提取，则应冷冻保存，动物组织更要深低温保存。
某些容易失活的物质，一般宜采用新鲜材料。
（二）细胞的粉碎 除了提取体液、组织间液内的多肽、蛋白质、酶不需粉碎细胞外，凡要提取组织内、细胞膜上及胞内的生物活性物质，都必须把组织和细胞粉碎，使活性物质充分释放到溶液内。
不同的组织，细胞的破碎难易不一，因此所使用的粉碎方法也不完全相同。
如脑、胰、肝等比较软嫩的组织，用普通匀浆器研磨就行，肌肉、心脏等则需绞碎后再作匀浆。
现浆常用的细胞粉碎方法介绍如后。
1．物理法 （1）高速组织捣碎机：通常由调速器、支架、马达、带杆刀叶、有机玻璃筒等组成。
把材料放于筒内（约占筒内容积的1/3）固定筒盖，开动马达，调速器由慢逐渐增至所需速度。
此法适用于内脏组织。
（2）玻璃匀浆器：由一个内壁经过磨砂的玻璃管和一根一端为球状（球面经过磨砂）玻璃研杆组成。
把绞碎的组织置于管内，加适量溶液，插入研杆，用手或电动转动研杆，并上下移动。
用此法细胞破碎程度比高速组织捣碎机高，对大分子的破坏也少。
是粉碎少量软嫩材料（脑、胰、肝等）时常用的方法。
（3）超声波处理法：多用于软嫩组织，根据不同组织采用不同频率，处理10～15min，超声波处理时溶液温度升高，使不耐热的物质失活，使用时为防止温度升高，除间歇开机外，还需人工降温，避免溶液内存在气泡。
核酸及某些酶对超声波很敏感，要慎用。
（4）反复冻融法：把待碎样品冷却到零下15～20。
C，冻固后取出，缓慢解冻，如此反复操作，可使大部分动物性细胞及胞内的颗粒破碎，但也可使生物活性物质失活。
（5）冷热交替法：把材料投入90。
C左右水中维持数分钟后取出投入冰浴内，可使大部分细胞破碎。
可用于提取蛋白质和核酸。
2．化学和生物化学法 （1）自溶法：把新鲜材料置于一定的pH和适宜的温度下，利用组织细胞自身的酶系统把组织破坏，使细胞内容物释放出来。
动物材料的自溶温度选在0～4℃，需加少量防腐剂，自溶时间较长，不易控制，不常用。
（2）溶菌酶处理法：多用于破坏大肠杆菌等微生物的细胞壁。
在每毫升含2亿个细胞的悬液中加100μg至1mg溶菌酶，37℃，保温10min，细胞就破坏了。
此外，蜗牛酶、纤维素酶也被选作破碎细菌细胞之用。
（3）表面活性剂处理法：较常用的有十二烷基磺酸钠、氯化十二烷基吡啶、去氧胆酸钠等。
（三）抗原的提取 提取、抽提、萃取这3个词的含义基本相同。
但一般说来，提取是指在分离纯化前期，将经过处理或粉碎了的细胞置于一定条件和溶剂中，让被提取物充分地释放出来的过程，而抽提则是贯穿于分离纯化的整个过程中，如在制备核酸过程中，用氯仿反复提取蛋白液，用苯酚反复抽提分离DNA和RNA。
影响提取的因素主要来自被提取物在提取的溶剂中的溶解度大小以及它由固相扩散到液相的难易。
一个物质在某一溶剂中的溶解度大小和该物质的分子结构及使用的溶剂的理化性质有关。
一般说来，极性物质易溶于极性溶剂，非极性物质易溶于非极性大分子的等电点远的pH值使溶解度增加。
因此，在不同的抗原提取过程中，所选用的溶剂的性质、pH值、离子强度、抽提温度、介电常数等因素是提取成败的重要因素。
要达到分离提纯的目的，必须灵活地应用这些因素。
现将蛋白质、核酸、多肽等抗原（半抗原）的提取方法概要叙述于下。
1．蛋白质和酶的提取 蛋白质是由许多氨基酸连接而成的高分子物质，分子量从数千至百万。
数以千计的蛋白质，按它们的功能可分成两大类，一类是活性蛋白，包括酶、激素蛋白、受体蛋白、运动蛋白、运输和贮存蛋白、防御蛋白等等，另一类是非活性蛋白，如胶原蛋白、角蛋白等，不同的蛋白质由于其结构的差异，它们溶解度也各不相同。
大部分蛋白质都可溶于水、稀盐、稀酸或稀碱溶液，少数与脂类结合的蛋白质则溶于有机溶剂乙醇、丙酮、丁醇等。
这对选择撮蛋白质的溶剂具有重要意义。
（1）水溶液提取：由于蛋白质大部分溶于水、稀酸和稀碱溶液，因此提取蛋白质以水溶液为主，其中尤以稀盐液和缓冲液对蛋白质稳定性好，溶解度大，氢是最常用的溶剂。
应注意下列几点：①盐浓度，常用等渗溶液，尤以0.02～0.05mol/L磷酸盐缓冲液或碳酸盐缓冲液、0.15mol/L氯化钠溶液应用较多。
如酵母脱氢酶以0.66mol/L磷酸氢二钠溶液提取，6-磷酸葡萄糖脱氢酶以0.1mol/L碳酸氢钠液提取，脱氧核糖核蛋白在低盐溶液中溶解度小，就要用1mol/L以上的氯化钠液提取，而某些脂肪酶，用水提取比低盐溶液提取效果更好。
②pH值的选择对蛋白质提取颇为重要，因为蛋白质的溶解度和稳定性与pH值关系很大。
提取液的pH值首先要保证在蛋白质稳定的范畴内，通常在等电点的两侧，碱性蛋白如细胞色素C和溶菌酶选在偏酸一侧，酸性蛋白如肌肉甘油醛-3-磷酸脱氢酶应选在偏碱一侧。
③温度：为防止活性蛋白变性、降解而失活，温度通常选在5℃以下。
对少数耐温的蛋白质和酶，可适当提高温度，使杂蛋白变性分离，有利于提纯，如胃蛋白酶、酵母醇脱氢酶以及许多多肽激素可选择37～50℃条件下提取，效果比低温提取更好。
（2）有机溶剂提取：一些不溶于水、稀盐、稀酸或稀碱溶液的蛋白质和酶，常用不同比例的有机溶剂来提取。
如用70%～80%乙醇提取麸蛋白；用60%～70%的酸性乙醇提取胰岛素，既可抑制水解酶对胰岛素的破坏，又可除去大量杂蛋白，用丁醇提取某些附于微粒体和线粒体的酶，一些与脂质结合牢固的蛋白质和酶以丁醇提取，效果较好。
我国生化工作者曾用此法成功地提取了琥珀酸脱氢酶和碱性磷酸脂酶。
丁醇提取法对pH及温度的选择范围较广（Ph3～10）,温度由零下2℃～40℃均可。
2．核酸的提取 核酸分为两大类：一类为核糖核酸（RNA），另一类为脱氧核糖核酸（DND）。
核酸的分子量极大，人数万致亿万。
核酸是两性化合物，在一定的等电点。
溶于水，其水溶液呈酸性，不溶于乙醇等有机溶剂。
细胞内的核酸常和蛋白质结合成核蛋白。
核糖核蛋白和脱氧核糖核蛋白在不同浓度的电解质溶液中的溶解度有显著区别，有一定浓度范围的氯化钠溶液中，脱氧核糖核蛋白的溶解度随着氯化钠浓度增加而逐渐下降，当氯化钠浓度为0.14mol/L时，其溶解度仅为水中溶解度的1/100，但当氯化钠浓度再增加时，脱氧核糖核蛋白的溶解度重新增加，氯化钠浓度增加到0.5mol/L时，其溶解度与水中溶解度相似，当氯化钠浓度增加到1mol/L时，它的溶解度比在水中大2倍。
核糖核蛋白在0.14mol/L氯化钠溶液中仍有相当大的溶解度，因此常用0.14mol/L氯化钠溶液提取核糖核蛋白，而提取脱氧核糖核蛋白时，则用1mol/L氯化钠溶液。
两种核糖核蛋白的溶解度与溶液的pH也有关。
当pH为4.2时，脱氧糖核蛋白的溶解度最低，而pH为2.0～2.5时，核糖核蛋白的溶解度最低。
所以调节氯化钠溶液的浓度和pH值，可使核糖核蛋白和脱氧核糖核蛋白分离开来。
（1）RNA的提取：RNA在细胞中主要有三种类型，即rRNA（核微粒核糖核酸）、tRNA（转移核糖核酸）和mRNA（信使核糖核酸）。
mRNA代谢极不稳定，提取时要求条件较严格；tRNA当细胞破碎后，用酸处理得到“pH5”沉淀，即可从中分离tRNA；rRNA占全部RNA的80%以上，比较稳定，一般提取的大分子RNA主要为此部分。
核内rRNA常先将细胞核分离后，再进行提取，可避免其他细胞组分RNA的干扰。
RNA的提取，通常是用0.14mol/L氯化钠溶液将组织做匀浆并反复提取细胞质中的核糖核蛋白，而留下含有DNA的细胞核物质，然后用10%醋酸调至pH4.2沉淀，离心弃去上清液，先用0.5mol/L氯化钠溶液，后用水洗涤沉淀，将核糖核蛋白后溶解于0.5mol/L碳酸氢钠溶液中，离心，取上清液，调pH至4.2,沉淀以0.5mol/L氯化钠溶液洗涤，再一次除去脱氧核糖核蛋白。
核糖核蛋白中的蛋白质可用含有少量辛醇的氯仿抽提除去，核酸留在碳酸氢钠水溶液中，加入乙醇，RNA即以钠盐形式沉淀出来。
提取RNA另一类方法，不须事先用0.14mol/L氯化钠提取核糖核蛋白，而一步将RNA的蛋白质分开，并同时把RNA抽提出来，此类方法是在破碎细胞做成匀浆时，加入去污剂十二烷基磺酸钠或二甲苯磺酸钠；而现在最常用的方法是直接加入含水苯酚与匀浆一起振荡，DNA和蛋白质沉淀于酚层中，水层中含RNA和多糖，然后用乙醇使RNA沉淀，四种物质一步便可初步分离开。
苯酚法是目前提取不降解的RNA最有效的方法，其应用举例如下： 肝脏rRNA的提取：按肝重（鲜）加入10倍容积苯酚-甲酚混合液（500g苯酚及70ml n-甲酚于50ml蒸馏水中，另加入0.5g 8-羟基喹啉配成）及10倍容积的0.5%萘-1，5-二磺酸水溶液（g/V）做匀浆后在20℃搅拌20min。
肝脏细胞核内mRNA的提取：先分离细胞核，再将核悬浮于3倍容积的0.5%pH6.5的萘二磺酸水溶液（g/V）中匀浆后加入等量90%（g/V）苯酚水溶液（内含0.1%8-羟基喹啉）在2℃振荡提取30min。
酵母tRNA的提取：100g酵母（湿重）加入200ml水，300ml 90%苯酚水溶液，振荡2h,4℃冰箱中过液，使之提取完全。