(完整版)细胞集落形成实验
细胞融合实验原理及步骤
实验十三细胞融合一、实验目的：两个以上的细胞合并成为一个双核或多核细胞称为融合细胞。
人工细胞融合开始于五十年代。
六十年代到七十年代作为一门新兴的技术发展很快，应用范围极广，不仅名类细胞可以全并，种间远缘细胞也能合并，细胞与组织不同，不排斥异类、异种细胞。
动物细胞如此。
因此融合细胞的研究成为生物学不论在基础理论上或生产实践上开辟了一条新的道路，如目前在核质关系，体细胞的遗传与发育，新品种的培养，免疫作用，疾病的治疗和性状的改良。
潜伏病毒的研究等方面上，有的已取得了显著的成绩，有的正在探索之中。
通过实验对体细胞融合有一个清楚概念。
并初步掌握动物细胞合并技术。
二、材料和方法（1）取艾氏腹水瘤细胞。
用注射器剌入接种瘤细胞7—10天的小白鼠腹腔内吸取1或2ml腹水，注放离心管内；加改良的Hank’s液（pH7.4）（缺葡萄糖的Hank’s液，Okaba，1962）以800rpm（转速）离心5分钟，取出上清液，再入改良Hank’s液，搅拌，再同样清洗两次，一次5分钟，一次十分钟，最后再加上适量Hank’s液。
计算每亳升的细胞数量，如与其它细胞合并用，适宜数目一般为107个/ml，即毫升约1000万个细胞。
（2）取鸡血球，在一只公鸡的翼静脉抽取，抽取数量随需要而定，如取5毫升，可用20毫升针筒，先将针与筒用Alsver液润湿，吸入50毫升Alsver 液剌入翼下静脉，吸取5毫升液，注入15毫升Alsver液瓶内，使血液与Alsver 液的比例为1：4。
存入4℃冰箱内务作一星期使用。
作实验时取这种贮备的鸡血球1毫升加入4毫升0。
85%生理盐水以1200—1500rpm离心三次（5分钟、5分钟、10分钟），每次离心后去上清液，加0。
85%生理盐水并搅匀，最末一次离心后，根据沉淀血球量的多少，加入适量0。
85%生理盐水使成1%悬液（0。
1毫升血球加10毫升液体），取1%悬液1毫升加上2毫升或3毫升0。
85%生理盐水或改良Hank’s液，使每一毫升含有血球1500万左右。
细胞集落形成实验
细胞集落形成实验方法介绍非整倍体无限细胞系和癌细胞株中，仍然存在不同细胞亚群，它们的功能和生长特点有些差异，其中有些亚群细胞对培养环境有较大的适应性和具有较强的独立生存能力，细胞集落率高。
纯化细胞群来自一个共同的祖细胞，细胞遗传性状、生物学特性相似，利于实验研究。
原代培养细胞和二倍体有限细胞系，细胞集落率很低。
细胞集落化培养之前，应先测定细胞集落形成率，以了解细胞在极低密度条件下的生长能力。
集落抑制率=（1-（实验组集落形成率/对照组集落形成率））×100%（一）原理细胞集落形成率单个细胞在体外增殖6代以上，其后代所组成的细胞群体，称为集落或克隆。
每个克隆含有50个以上的细胞，大小在0.3-1.0mm 之间。
集落形成率表示细胞独立生存能力。
常用方法有平板集落形成试验、软琼脂集落形成试验。
（二）实验用品1.材料：Hela细胞。
2.器材：（直径60mm ）培养皿、细胞记数板、烧杯、吸管、离心机、离心管、废液瓶、倒置显微镜、二氧化碳培养箱、超净工作台、水浴锅。
3.试剂：Giemsa染液、0.25%胰蛋白酶消化液、血清细胞培养液、安尔碘、琼脂。
（三）方法1.平板克隆形成试验本法适用于贴壁生长的细胞，包括培养的正常细胞和肿瘤细胞。
(1)对指数生长期细胞，采用常规消化传代方法，制成细胞悬液。
(2)细胞悬液反复吹打，使细胞充分分散，单个细胞百分率应在95%以上。
细胞记数，并用培养基调节细胞浓度，待用。
(3)根据细胞增殖能力，将细胞悬液倍比稀释。
一般按照每皿含50、100、200个细胞的浓度分别接种5ml细胞悬液到培养皿（直径60mm ）中，以十字方向轻轻晃动培养皿，使细胞分散均匀。
(4)培养皿置37℃、5%CO2中培养2~3周，中间根据培养液pH变化适时更换新鲜培养液。
(5)当培养皿中出现肉眼可见克隆时，终止培养，弃去培养液，PBS液小心浸洗2次，空气干燥。
甲醇固定15分钟，弃甲醇后空气干燥。
用Giemsa染液染色10分钟，流水缓慢洗去染液，空气干燥。
细胞克隆形成实验服务
机密提醒：这份文件及其传真件、复印件所包含的机密或法律保护信息是只提供给这份文件上所指定的个人或机构。
如果您不是预定接受者，我们提醒您严禁以披露、拷贝、散发或任何形式利用这份文件及其传真件、复印件的内容。
如果您错误的接收到这份文件及其传真件、复印件，请立即通知我们以便我们可以安排文件及其传真件、复印件返还并不会让您负担任何费用。
第 1 页 共 1 页 细胞克隆形成实验服务一、实验介绍当单个细胞在体外增殖6代以上，其后代所组成的细胞群体，成为集落或克隆。
每个克隆含有50以上的细胞，大小在0.3-1.0mm 之间。
集落形成率表示细胞的独立生存能力。
各种理化因素可能导致细胞的克隆形成能力发生改变。
通过一定的实验方法可以对细胞的克隆形成能力进行检测。
【晶莱生物】二、实验方法平板集落形成实验、软琼脂集落形成实验(a) 平板集落形成实验：本法适用于贴壁生长的细胞和正常培养的细胞(b) 软琼脂集落形成实验：本法适用于非锚着依赖性生长的细胞，如骨髓造血干细胞、肿瘤细胞株、转化细胞系。
三、注意事项(a) 琼脂对热和酸不稳定，若反复加热，容易降解而产生毒性，且硬度下降。
因此高压灭菌后应进行分装；(b) 细胞在进行克隆形成实验时要求有95%以上的分散度，否则结果的准确度会受到很大影响； (c) 软琼脂与细胞混合时温度不能超过40℃，否则将会烫伤/死细胞；(d) 接种时细胞密度适度，不可过高。
细胞在低密度、非贴壁状态条件下培养，生存率明显下降，永生细胞系/株克隆形成率可达到10%以上，但初代培养细胞和有限传代细胞系克隆形成率仅为0.5%-5%，甚至无法形成单个克隆。
因此，为了提高克隆形成率，有时需要在培养基中添加胰岛素、地塞米松等促克隆形成物质。
细胞接种存活率只表示接种细胞后贴壁的细胞数，但贴壁后的细胞不一定每个都能增殖和形成克隆。
而形成克隆的细胞必为贴壁和有增殖活力的细胞。
克隆形成率反映细胞群体依赖性和增殖能力两个重要性状。
细胞克隆形成实验
细胞克隆形成实验当单个细胞在体外增殖6 代以上，其后代所组成的细胞群体，成为集落或克隆。
每个克隆含有50 以上的细胞，大小在0.3-1.0mm 之间。
集落形成率表示细胞的独立生存能力。
各种理化因素可能导致细胞的克隆形成能力发生改变。
通过一定的实验方法可以对细胞的克隆形成能力进行检测。
细胞接种存活率只表示接种细胞后贴壁的细胞数，但贴壁后的细胞不一定每个都能增殖和形成克隆。
而形成克隆的细胞必为贴壁和有增殖活力的细胞。
克隆形成率反映细胞群体依赖性和增殖能力两个重要性状。
由于细胞生物学性状不同，细胞克隆形成率差别也很大：一般初代培养细胞克隆形成率弱，传代细胞系强；二倍体细胞克隆形成率弱，转化细胞系强；正常细胞克隆形成率弱，肿瘤细胞强。
实验方法：平板集落形成实验、软琼脂集落形成实验(a) 平板集落形成实验：本法适用于贴壁生长的细胞和正常培养的细胞(b) 软琼脂集落形成实验：本法适用于非锚着依赖性生长的细胞，如骨髓造血干细胞、肿瘤细胞株、转化细胞系。
平板克隆形成实验基本步骤：1、取对数生长期的各组细胞，分别用0.25%胰蛋白酶消化并吹打成单个细胞，并把细胞悬浮在10%胎牛血清的DME培养液中备用。
2、将细胞悬液作梯度倍数稀释，每组细胞分别以每皿50、100、200个细胞的梯度密度分别接种含10mL37°C预温培养液的皿中，并轻轻转动，使细胞分散均匀。
置37C 5% CO2及饱和湿度的细胞培养箱中培养2〜3周。
3、经常观察，当培养皿中出现肉眼可见的克隆时，终止培养。
弃去上清液，用PBS小心浸洗2次。
加4%多聚甲醛固定细胞5mL固定15分钟。
然后去固定液，加适量GIMSA应用染色液染10〜30分钟，然后用流水缓慢洗去染色液，空气干燥。
4、将平皿倒置并叠加一张带网格的透明胶片，用肉眼直接计数克隆，或在显微镜(低倍镜)计数大于10个细胞的克隆数。
最后计算克隆形成率。
克隆形成率=(克隆数/接种细胞数)X100%平板克隆形成试验方法简单，适用于贴壁生长的细胞。
（完整版）细胞克隆形成实验
（完整版）细胞克隆形成实验细胞克隆形成实验当单个细胞在体外增殖6代以上，其后代所组成的细胞群体，成为集落或克隆。
每个克隆含有50以上的细胞，大小在0.3-1.0mm之间。
集落形成率表示细胞的独立生存能力。
各种理化因素可能导致细胞的克隆形成能力发生改变。
通过一定的实验方法可以对细胞的克隆形成能力进行检测。
细胞接种存活率只表示接种细胞后贴壁的细胞数，但贴壁后的细胞不一定每个都能增殖和形成克隆。
而形成克隆的细胞必为贴壁和有增殖活力的细胞。
克隆形成率反映细胞群体依赖性和增殖能力两个重要性状。
由于细胞生物学性状不同，细胞克隆形成率差别也很大：一般初代培养细胞克隆形成率弱，传代细胞系强；二倍体细胞克隆形成率弱，转化细胞系强；正常细胞克隆形成率弱，肿瘤细胞强。
实验方法：平板集落形成实验、软琼脂集落形成实验(a)平板集落形成实验：本法适用于贴壁生长的细胞和正常培养的细胞(b)软琼脂集落形成实验：本法适用于非锚着依赖性生长的细胞，如骨髓造血干细胞、肿瘤细胞株、转化细胞系。
平板克隆形成实验基本步骤：1、取对数生长期的各组细胞，分别用0.25%胰蛋白酶消化并吹打成单个细胞，并把细胞悬浮在10%胎牛血清的DMEM培养液中备用。
2、将细胞悬液作梯度倍数稀释，每组细胞分别以每皿50、100、200个细胞的梯度密度分别接种含10mL 37℃预温培养液的皿中，并轻轻转动，使细胞分散均匀。
置37℃ 5% CO2及饱和湿度的细胞培养箱中培养2～3周。
3、经常观察，当培养皿中出现肉眼可见的克隆时，终止培养。
弃去上清液，用PBS小心浸洗2次。
加4%多聚甲醛固定细胞5mL固定15分钟。
然后去固定液，加适量GIMSA应用染色液染10～30分钟，然后用流水缓慢洗去染色液，空气干燥。
4、将平皿倒置并叠加一张带网格的透明胶片，用肉眼直接计数克隆，或在显微镜（低倍镜）计数大于10个细胞的克隆数。
最后计算克隆形成率。
克隆形成率=（克隆数/接种细胞数）×100%平板克隆形成试验方法简单，适用于贴壁生长的细胞。
细胞克隆形成实验
精心整理细胞克隆形成实验当单个细胞在体外增殖6代以上，其后代所组成的细胞群体，成为集落或克隆。
每个克隆含有50以上的细胞，大小在0.3-1.0mm之间。
集落形成率表示细胞的独立生存能力。
各种理化因素可能导致细胞的克隆形成能力发生改变。
通过一定的实验方法可以对细胞的克隆形成能力进行检测。
细胞接种存活率只表示接种细胞后贴壁的细胞数，但贴壁后的细胞不一定每个都能增殖和形成克隆。
而形成克隆的细胞必为贴壁和有增殖活力的细胞。
克隆形成率反映细胞群体依赖性和增殖能力正常?(a)??(b)?1、10%210mL373、2次。
加4%10～30分钟，然后用流水缓慢洗去染色液，空气干燥。
4、将平皿倒置并叠加一张带网格的透明胶片，用肉眼直接计数克隆，或在显微镜（低倍镜）计数大于10个细胞的克隆数。
最后计算克隆形成率。
克隆形成率=（克隆数/接种细胞数）×100%平板克隆形成试验方法简单，适用于贴壁生长的细胞。
适宜底物为玻璃的、塑料瓶皿。
试验成功的关键是细胞悬液的制备和接种密度。
细胞一定要分散得好，不能有细胞团，接种密度不能过大。
平板克隆形成试验方法简单，适用于贴壁生长的细胞。
适宜底物为玻璃的、塑料瓶皿。
试验成功的关键是细胞悬液的制备和接种密度。
细胞一定要分散得好，不能有细胞团，接种密度不能过大。
软琼脂培养克隆形成试验基本步骤：?(1)取对数生长期细胞，用0.25%胰蛋白酶消化并轻轻吹打，使之成为单细胞，作活细胞计数，用含20%胎牛血清的DMEM培养液调整细胞密度至1×106细胞/L。
然后根据实验要求作梯度倍数稀释。
?(2)用蒸馏水分别制备出1.2%和0.7%两个浓度的低溶点琼脂糖液，高压灭菌后，维持在40℃中不会凝固。
?(3)按3mL温箱中备用。
?(4)按0.2mL 置入37(5)不超过将1.21.4ml10000个/ml加1ml CO2的1.接种时细胞密度适度，不可过高。
2.软琼脂与细胞混合时温度不能超过40℃，否则将会烫伤/死细胞；3.琼脂对热和酸不稳定，若反复加热，容易降解而产生毒性，且硬度下降。
细胞克隆形成实验
细胞克隆形成实验当单个细胞在体外增殖6代以上,其后代所组成的细胞群体,成为集落或克隆;每个克隆含有50以上的细胞,大小在0.3-1.0mm之间;集落形成率表示细胞的独立生存能力;各种理化因素可能导致细胞的克隆形成能力发生改变;通过一定的实验方法可以对细胞的克隆形成能力进行检测;细胞接种存活率只表示接种细胞后贴壁的细胞数,但贴壁后的细胞不一定每个都能增殖和形成克隆;而形成克隆的细胞必为贴壁和有增殖活力的细胞;克隆形成率反映细胞群体依赖性和增殖能力两个重要性状;由于细胞生物学性状不同,细胞克隆形成率差别也很大：一般初代培养细胞克隆形成率弱,传代细胞系强；二倍体细胞克隆形成率弱,转化细胞系强；正常细胞克隆形成率弱,肿瘤细胞强;实验方法：平板集落形成实验、软琼脂集落形成实验a平板集落形成实验：本法适用于贴壁生长的细胞和正常培养的细胞b软琼脂集落形成实验：本法适用于非锚着依赖性生长的细胞,如骨髓造血干细胞、肿瘤细胞株、转化细胞系;平板克隆形成实验基本步骤：1、取对数生长期的各组细胞,分别用0.25%胰蛋白酶消化并吹打成单个细胞,并把细胞悬浮在10%胎牛血清的DMEM培养液中备用;2、将细胞悬液作梯度倍数稀释,每组细胞分别以每皿50、100、200个细胞的梯度密度分别接种含10mL 37℃预温培养液的皿中,并轻轻转动,使细胞分散均匀;置37℃ 5% CO2及饱和湿度的细胞培养箱中培养2～3周;3、经常观察,当培养皿中出现肉眼可见的克隆时,终止培养;弃去上清液,用PBS小心浸洗2次;加4%多聚甲醛固定细胞5mL固定15分钟;然后去固定液,加适量GIMSA应用染色液染10～30分钟,然后用流水缓慢洗去染色液,空气干燥;4、将平皿倒置并叠加一张带网格的透明胶片,用肉眼直接计数克隆,或在显微镜低倍镜计数大于10个细胞的克隆数;最后计算克隆形成率;克隆形成率 =克隆数/接种细胞数×100%平板克隆形成试验方法简单,适用于贴壁生长的细胞;适宜底物为玻璃的、塑料瓶皿;试验成功的关键是细胞悬液的制备和接种密度;细胞一定要分散得好,不能有细胞团,接种密度不能过大;平板克隆形成试验方法简单,适用于贴壁生长的细胞;适宜底物为玻璃的、塑料瓶皿;试验成功的关键是细胞悬液的制备和接种密度;细胞一定要分散得好,不能有细胞团,接种密度不能过大;软琼脂培养克隆形成试验基本步骤：1取对数生长期细胞,用0.25%胰蛋白酶消化并轻轻吹打,使之成为单细胞,作活细胞计数,用含20%胎牛血清的DMEM培养液调整细胞密度至1×106细胞/L;然后根据实验要求作梯度倍数稀释;2用蒸馏水分别制备出1.2%和0.7%两个浓度的低溶点琼脂糖液,高压灭菌后,维持在40℃中不会凝固;3按1:1比例使1.2%的琼脂糖和2×DMEM培养基含有2×抗生素和20%的小牛血清混合后,取3mL混合液注入直径6cm平皿中10cm平皿加7～10mL,冷却凝固,可作底层琼脂置CO2温箱中备用;4按1:1比例让0.7%的琼脂糖和2×DMEM培养基在无菌试管中相混以后,再向管中加入0.2mL的细胞悬液,充分混匀,注入铺有1.2%琼脂糖底层平皿中,逐形成双琼脂层;待上层琼脂凝固后,置入37℃ 5%CO2温箱中培养10～14天;5把平皿放置在倒置显微镜下,观察细胞克隆数;计算形成率; 软琼脂培养法常用检测肿瘤细胞和转化细胞系;试验中琼脂与细胞相混时,琼脂温度不宜超过40℃;接种细胞的密度每平方厘米不超过35个,一般6cm的平皿接种1000个细胞;正常细胞在悬浮状态下不能增殖,不适用于软琼脂克隆形成试验;软琼脂集落形成率实验软琼脂克隆将1.2％低熔点琼脂糖与2×细胞培养基以1:1 的体积比混合制备0.6％的底层琼脂,6 孔板中每个孔1.4ml 温室凝固,取对数期细胞,胰酶消化后吹散成单个细胞悬液,计数,并调细胞浓度为10000 个/ml,将0.6％低熔点琼脂糖与2×细胞培养基以1:1 的体积比混合,制备0.3％的上层琼脂,每孔加1ml 上层琼脂和100ul 单细胞悬液约1000cell/well,混匀,室温凝固;置于37℃,5％CO2 的细胞培养箱中培养2－3 周,计数含50 个细胞以上得克隆,计算细胞集落形成率,SpotII 采集图像;注意事项1.接种时细胞密度适度,不可过高;2.软琼脂与细胞混合时温度不能超过40℃,否则将会烫伤/死细胞；3.琼脂对热和酸不稳定,若反复加热,容易降解而产生毒性,且硬度下降;因此高压灭菌后应进行分装；4.细胞在进行克隆形成实验时要求有95%以上的分散度,否则结果的准确度会受到很大影响；5.细胞在低密度、非贴壁状态条件下培养,生存率明显下降,永生细胞系/株克隆形成率可达到10%以上,但初代培养细胞和有限传代细胞系克隆形成率仅为0.5%-5%,甚至无法形成单个克隆;因此,为了提高克隆形成率,有时需要在培养基中添加胰岛素、地塞米松等促克隆形成物质;6.细胞接种存活率只表示接种细胞后贴壁的细胞数,但贴壁后的细胞不一定每个都能增殖和形成克隆;做克隆形成率测定时,接种细胞一定要分散成单细胞悬液,直接接种在碟皿中,持续一周,随时检查,到细胞形成克隆时终止培养;。
造血细胞分离、集落培养及表型分析
五、实验结果
脐血的体积
样品
分离出的单个 核细胞液的细
胞密度 9.8625×107 个
/mL
表 1 血球计数板计数结果
脐血中单个核 脐血中单个核 脐血中单个核
细胞液体积 细胞液细胞密 细胞液白细胞
度
密度
30mL
3.15×109 个/mL 3.9625×108 个
分离出的单个 核细胞液的白
收率(总细胞)
/mL 收率(白细胞)
细胞密度
5.1×106 个/mL
0.16%
0.064%
分离出的单个 核细胞液的体
积 1.5mL
纯度
12.26%
1、脐血共稀释 10,000 倍，利用血球计数板计数结果如下
38 28
27 34
40 30
16 39
(38+28+27+34+40+30+16+39)÷8=31.5 31.5×10000×104=3.15×109 个/mL
以总细胞计：9.8625×107×1.5÷(3.15×109×30)=0.16%
以白细胞计：5.1×106×1.5÷(3.9625×108×30)=0.064%
6、纯度
3.15×109×60=12.26%
5.2 流式细胞分析结果
5.2.1 流式细胞分析结果图
图 1 C流式细胞分析结果
33 30
25 32
32 24
(47+40+33+30+25+32+32+24)÷8=32.875 32.875×300×104=9.8625×107 个/mL
4、分离裂解后共稀释 30 倍，利用血球计数板计数结果如下
细胞克隆形成实验之欧阳地创编
细胞克隆形成实验当单个细胞在体外增殖6代以上，其后代所组成的细胞群体，成为集落或克隆。
每个克隆含有50以上的细胞，大小在0.3-1.0mm之间。
集落形成率表示细胞的独立生存能力。
各种理化因素可能导致细胞的克隆形成能力发生改变。
通过一定的实验方法可以对细胞的克隆形成能力进行检测。
细胞接种存活率只表示接种细胞后贴壁的细胞数，但贴壁后的细胞不一定每个都能增殖和形成克隆。
而形成克隆的细胞必为贴壁和有增殖活力的细胞。
克隆形成率反映细胞群体依赖性和增殖能力两个重要性状。
由于细胞生物学性状不同，细胞克隆形成率差别也很大：一般初代培养细胞克隆形成率弱，传代细胞系强；二倍体细胞克隆形成率弱，转化细胞系强；正常细胞克隆形成率弱，肿瘤细胞强。
实验方法：平板集落形成实验、软琼脂集落形成实验(a) 平板集落形成实验：本法适用于贴壁生长的细胞和正常培养的细胞(b) 软琼脂集落形成实验：本法适用于非锚着依赖性生长的细胞，如骨髓造血干细胞、肿瘤细胞株、转化细胞系。
平板克隆形成实验基本步骤：1、取对数生长期的各组细胞，分别用0.25%胰蛋白酶消化并吹打成单个细胞，并把细胞悬浮在10%胎牛血清的DMEM培养液中备用。
2、将细胞悬液作梯度倍数稀释，每组细胞分别以每皿50、100、200个细胞的梯度密度分别接种含10mL 37℃预温培养液的皿中，并轻轻转动，使细胞分散均匀。
置37℃ 5% CO2及饱和湿度的细胞培养箱中培养2～3周。
3、经常观察，当培养皿中出现肉眼可见的克隆时，终止培养。
弃去上清液，用PBS小心浸洗2次。
加4%多聚甲醛固定细胞5mL固定15分钟。
然后去固定液，加适量GIMSA应用染色液染10～30分钟，然后用流水缓慢洗去染色液，空气干燥。
4、将平皿倒置并叠加一张带网格的透明胶片，用肉眼直接计数克隆，或在显微镜（低倍镜）计数大于10个细胞的克隆数。
最后计算克隆形成率。
克隆形成率 =（克隆数/接种细胞数）×100%平板克隆形成试验方法简单，适用于贴壁生长的细胞。
软琼脂集落形成实验
1.双层软琼脂集落形成率实验于24 孔板中, 下层低熔点琼脂浓度为0. 5 % , 上层为0. 33 %,每孔上层低熔点琼脂含细胞数为2 000 个,每种细胞共铺5 孔。
把培养板移入CO2 孵箱,在37 ℃、5 %CO2 及饱和湿度环境下培养2～3 周后倒置显微镜下计数直径大于100μm或含50 个细胞以上的克隆,并计算克隆形成率(克隆形成数/ 接种细胞数×100 % = 克隆形成率) 。
2.软琼脂克隆形成实验将p27Kip1转染组、空载体转染组和未转染组细胞以每组600个细胞接种于60 mm 含底层5 g/L琼脂糖和顶层3 g/L琼脂糖的软琼脂中;37℃培养箱中培养14 d;倒置显微镜下观察克隆形成情况.计算克隆形成率.软琼脂克隆形成率=克隆数/接种细胞数×100%对照组克隆数-实验组克隆数抑制率= ×100%对照组克隆数3.软琼脂克隆形成实验用去离子水配制7 g．L-1和12 g．L -1琼脂溶液，高温高压灭菌后，于45℃水浴保温备用. 配制2×DMEM培养液，高温高压灭菌后45℃水浴保温. 将2×DMEM与12 g．L-1琼脂溶液等体积混匀后，按1 mL/孔加入24孔培养板，4℃放置30 min使之凝固. 再将2×DMEM与7 g．L-1琼脂溶液等体积混匀，之后加入单细胞悬液并调整细胞终浓度为1×106个．L-1，此混悬液按每孔0.5 mL加入上述24孔板，铺平后室温放置使琼脂凝固，之后置于37℃，50 mL．L-1 CO2孵箱中培养2 wk，观察细胞克隆形成情况并计算克隆形成率. 同时设HO-8910为空白对照和8910-pcDNA3为空载体对照.4.软琼脂克隆形成试验细胞在35 mm的平皿中长至70％～80％铺满，然后与20 μμmol·I-1的AS －ODN。
共孵育4h，之后将细胞重悬于新鲜培养液配制6mL·L-1的底层琼脂，lml／孔加入24孔板中，调整细胞浓度并与 4 mL·L-1的琼脂混合，以每孔0.5 mL中含500个细胞加到底层琼脂上，置37℃培养2Wk后计数克隆形成数克隆大于100个细胞着计数。
细胞生物学实验 ——步骤集
染色体标本染色与观察
用 Giemsa染色20 ～ 30分钟，细水冲洗玻片背面，去多余染液，气干。 镜检：低倍镜下寻找分散良好、染色适中的分裂相，高倍镜或油镜下观察 染色体形态并计数。
人外周血染色体标本制备
(一)细胞培养 1．培养基的配制： 在超净工作台中，100ml培养基含以下成分和比例： RPMI-1640 84ml 小牛血清 15ml PHA 3支 肝素钠 1ml 卡那霉素 终浓度为100单位/ml 以5% NaHCO3(无菌)或1N HCl调pH至7.2-7.4。 用刻度吸管将培养液分装入培养瓶(10ml/瓶)，4℃备用。 2．采血：酒精消毒皮肤，肘静脉采血0.3-0.5ml，立刻将注射针直接穿过培养瓶的橡胶塞，向 10ml培养基中注入30-40滴全血，轻摇匀后置37℃恒温箱培养。 3．培养：时间为68小时。培养期间，定期轻摇匀，使细胞充分接触培养基。 4．秋水仙素处理：终止培养前2-4小时，在培养液中加入秋水仙碱(用1ml注射器5号针尖滴加2 滴，使终浓度为0.07μ g/ml)。 以上步骤均需无菌操作。 (二)染色体制备 1．收集细胞：将培养物全部转入洁净离心管中，以1000rpm离心8-10分钟，弃上清液。 2．低渗处理：向刻度离心管中加入预温37℃的低渗液8ml，用滴管混匀，置37℃恒温水浴中低 渗15-25分钟。 3．预固定：低渗后加入0.5mlCarnoy’s固定液，轻轻混匀后1000rpm离心8-10分钟。 4．一固定：弃上清液，加入5ml固定液，轻轻混匀，静置20分钟。1000rpm离心，弃上清液。 5．二固定、三固定：同一固定。 6．制悬液：弃上清液后，视细胞数量多少加入适量固定液制成细胞悬液。 7．滴片：吸取细胞悬液自10-20cm高滴在一张干燥洁净的载玻片上，轻吹散，气干。 8．染色：1:10 Giemsa染色5-10分钟，细水洗去多余染液，气干。 9．镜检：低倍镜下寻找分散良好、染色适中的分裂相，油镜下观察染色体形态并计数。
造血细胞分离、集落培养及表型分析
造血细胞分离、集落培养及表型分析动性好，同时也避免了细胞因受力而损伤的情况。
流式细胞仪通过激光束照射细胞，检测细胞表面标记物的荧光强度，进而分析细胞表型，包括细胞表面标志、大小、形态等。
2、集落培养集落培养法是一种常用的检测造血干细胞的方法。
将待测细胞在半固体培养基中培养，待细胞分裂形成集落后，根据集落的形态和数量来判断细胞的分化能力。
常用的集落包括粒-巨嗜细胞集落形成单位（CFU-GM）、红系爆式集落形成单位（BFU-E）、巨核细胞集落形成单位（CFU-MK）等。
集落培养法可以检测细胞的增殖能力和分化潜能，是评估细胞功能的重要方法。
二、实验步骤1、细胞样品制备将待测细胞制成单细胞悬液，使得细胞可以均匀地分布在流式细胞仪的流动室中，方便后续的细胞表型分析。
2、流式细胞仪分析将制备好的细胞悬液加入样品管中，加入特异性荧光染料后，通过流式细胞仪进行细胞表型分析。
根据细胞表面标志物的荧光强度，可以判断细胞的类型和状态。
3、集落培养将待测细胞在半固体培养基中培养，待细胞分裂形成集落后，根据集落的形态和数量来判断细胞的分化能力。
常用的集落包括粒-巨嗜细胞集落形成单位（CFU-GM）、红系爆式集落形成单位（BFU-E）、巨核细胞集落形成单位（CFU-MK）等。
三、实验结果分析通过流式细胞仪和集落培养的结果，可以分析细胞的表型和功能。
例如，CD34+、CD38-、HLA-DR-、Thy-1+、c-kit+、LFA-1-、CD45RA-、CD71-、lin-等标志物被广泛认为是造血干细胞的标志。
同时，集落培养的结果也可以评估细胞的增殖能力和分化潜能。
这些结果对于研究造血干细胞的生物学特性和临床应用具有重要意义。
本实验采用流式细胞仪技术对脐血中的造血干细胞进行分离和检测。
流式细胞仪的测量区利用样品流和鞘流的气压差的层流原理，使细胞依次排列成单行，每个细胞以均等的时间依次通过测量区。
被荧光染料染色的细胞受到强烈的激光照射后发出荧光，同时产生散射光。
细胞克隆形成实验
细胞克隆形成实验当单个细胞在体外增殖6代以上，其后代所组成的细胞群体，成为集落或克隆。
每个克隆含有50以上的细胞，大小在0.3-1.0mm之间。
集落形成率表示细胞的独立生存能力。
各种理化因素可能导致细胞的克隆形成能力发生改变。
通过一定的实验方法可以对细胞的克隆形成能力进行检测。
细胞接种存活率只表示接种细胞后贴壁的细胞数，但贴壁后的细胞不一定每个都能增殖和形成克隆。
而形成克隆的细胞必为贴壁和有增殖活力的细胞。
克隆形成率反映细胞群体依赖性和增殖能力正常?(a)??(b)?1、10% 2箱中培养32次。
加4%～30分4、将平皿倒置并叠加一张带网格的透明胶片，用肉眼直接计数克隆，或在显微镜（低倍镜）计数大于10个细胞的克隆数。
最后计算克隆形成率。
克隆形成率=（克隆数/接种细胞数）×100%平板克隆形成试验方法简单，适用于贴壁生长的细胞。
适宜底物为玻璃的、塑料瓶皿。
试验成功的关键是细胞悬液的制备和接种密度。
细胞一定要分散得好，不能有细胞团，接种密度不能过大。
平板克隆形成试验方法简单，适用于贴壁生长的细胞。
适宜底物为玻璃的、塑料瓶皿。
试验成功的关键是细胞悬液的制备和接种密度。
细胞一定要分散得好，不能有细胞团，接种密度不能过大。
软琼脂培养克隆形成试验基本步骤：?(1)取对数生长期细胞，用0.25%胰蛋白酶消化并轻轻吹打，使之成为单细胞，作活细胞计数，用含20%胎牛血清的DMEM培养液调整细胞密度至1×106细胞/L。
然后根据实验要求作梯度倍数稀释。
?(2)用蒸馏水分别制备出1.2%和0.7%两个浓度的低溶点琼脂糖液，高压灭菌后，维持在40℃中不会凝固。
(3)按3mL温箱中备用。
?(4)按0.2mL的置入(5)不超过将1.2孔1.4ml10000个/ml孔加1ml5％CO2采集图像。
注意事项1.接种时细胞密度适度，不可过高。
2.软琼脂与细胞混合时温度不能超过40℃，否则将会烫伤/死细胞；3.琼脂对热和酸不稳定，若反复加热，容易降解而产生毒性，且硬度下降。
细胞克隆形成实验
细胞克隆形成实验当单个细胞在体外增殖6代以上，其后代所组成的细胞群体，成为集落或克隆。
每个克隆含有50以上的细胞，大小在0.3-1.0mm之间。
集落形成率表示细胞的独立生存能力。
各种理化因素可能导致细胞的克隆形成能力发生改变。
通过一定的实验方法可以对细胞的克隆形成能力进行检测。
细胞接种存活率只表示接种细胞后贴壁的细胞数，但贴壁后的细胞不一定每个都能增殖和形成克隆。
而形成克隆的细胞必为贴壁和有增殖活力的细胞。
克隆形成率反映细胞群体依赖性和增殖能力两个重要性状。
由于细胞生物学性状不同，细胞克隆形成率差别也很大：通常初代培育细胞克隆构成率弱，传代细胞系弱；二倍体细胞克隆构成率弱，转变细胞系弱；正常细胞克隆构成率弱，肿瘤细胞弱。
实验方法：平板荻洼构成实验、硬琼脂荻洼构成实验(a)平板集落形成实验：本法适用于贴壁生长的细胞和正常培养的细胞(b)硬琼脂荻洼构成实验：本法适用于于非锚着依赖性生长的细胞，例如骨髓输血干细胞、肿瘤细胞株、转变细胞系。
平板克隆形成实验基本步骤：1、挑对数生长期的各组细胞，分别用0.25%胰蛋白酶消化并王繇成单个细胞，并把细胞漂浮在10%胎牛血清的dmem培养液中水泵。
2、将细胞悬液作梯度倍数稀释，每组细胞分别以每皿50、100、200个细胞的梯度密度分别接种含10ml37℃预温培养液的皿中，并轻轻转动，使细胞分散均匀。
置37℃5%co2及饱和湿度的细胞培养箱中培养2～3周。
3、经常观测，当培养皿中发生肉眼可知的克隆时，中止培育。
弃回去上清液，用pbs 小心液体石蜡2次。
提4%多聚甲醛紧固细胞5ml紧固15分钟。
然后回去紧固液，提适度gimsa应用领域染色液染10～30分钟，然后用流水缓慢洗脸回去染色液，空气潮湿。
4、将平皿倒置并叠加一张带网格的透明胶片，用肉眼直接计数克隆，或在显微镜（低倍镜）计数大于10个细胞的克隆数。
最后计算克隆形成率。
克隆形成率=（克隆数/接种细胞数）×100%平板克隆构成试验方法直观，适用于于贴壁生长的细胞。
(完整版)细胞集落形成实验
细胞集落形成实验方法介绍非整倍体无限细胞系和癌细胞株中，仍然存在不同细胞亚群，它们的功能和生长特点有些差异，其中有些亚群细胞对培养环境有较大的适应性和具有较强的独立生存能力，细胞集落率高。
纯化细胞群来自一个共同的祖细胞，细胞遗传性状、生物学特性相似，利于实验研究。
原代培养细胞和二倍体有限细胞系，细胞集落率很低。
细胞集落化培养之前，应先测定细胞集落形成率，以了解细胞在极低密度条件下的生长能力。
集落抑制率=（1-（实验组集落形成率/对照组集落形成率））×100%（一）原理细胞集落形成率单个细胞在体外增殖6代以上，其后代所组成的细胞群体，称为集落或克隆。
每个克隆含有50个以上的细胞，大小在0.3-1.0mm 之间。
集落形成率表示细胞独立生存能力。
常用方法有平板集落形成试验、软琼脂集落形成试验。
（二）实验用品1.材料：Hela细胞。
2.器材：（直径60mm ）培养皿、细胞记数板、烧杯、吸管、离心机、离心管、废液瓶、倒置显微镜、二氧化碳培养箱、超净工作台、水浴锅。
3.试剂：Giemsa染液、0.25%胰蛋白酶消化液、血清细胞培养液、安尔碘、琼脂。
（三）方法1.平板克隆形成试验本法适用于贴壁生长的细胞，包括培养的正常细胞和肿瘤细胞。
(1)对指数生长期细胞，采用常规消化传代方法，制成细胞悬液。
(2)细胞悬液反复吹打，使细胞充分分散，单个细胞百分率应在95%以上。
细胞记数，并用培养基调节细胞浓度，待用。
(3)根据细胞增殖能力，将细胞悬液倍比稀释。
一般按照每皿含50、100、200个细胞的浓度分别接种5ml细胞悬液到培养皿（直径60mm ）中，以十字方向轻轻晃动培养皿，使细胞分散均匀。
(4)培养皿置37℃、5%CO2中培养2~3周，中间根据培养液pH变化适时更换新鲜培养液。
(5)当培养皿中出现肉眼可见克隆时，终止培养，弃去培养液，PBS液小心浸洗2次，空气干燥。
甲醇固定15分钟，弃甲醇后空气干燥。
用Giemsa染液染色10分钟，流水缓慢洗去染液，空气干燥。
克隆形成实验
克隆形成实验细胞生长状况有关指标的检测方法一、细胞计数这是细胞培养中常用的基本技术之一。
所用材料为血球计数板，巴氏吸管和显微镜。
细胞计数的基本步骤：(1)取清洁计数板和专用盖玻片，用丝绸布轻轻拭干.(2)取细胞悬液0.3mL ，加入 0.9mL 结晶紫 (或台盼至 )染液，混匀后滴半滴于血球计数板内，以充满不外溢为宜。
也可直接将细胞悬液在一侧滴加到盖玻片中，不要溢出，也不要过少或出现气泡.(3)在显微镜下用10×物镜观察计数四角大分格中的细胞数。
代入下式得出细胞密度。
细胞数 /ml=(4 大格细胞数之和/4) ×104×稀释倍数台盼蓝染色法可计算出活细胞数和死细胞数以测定细胞存活百分率。
一般0.5% ～ 1% 的台盼蓝染液可使死细胞染成蓝色，活细胞不着色。
此外还可用0.02% 的藻红 B 染液将死细胞或受损细胞染成红色，或用 0.05%的苯胺黑染液将死细胞染成黑色。
细胞存活百分率= （4 大格活细胞数 /4 大格活细胞 +死细胞数）×100%细胞计数除用上述方法外，目前还有新型的自动计数仪，可供大规模细胞计数工作使用。
各种型号的计数操作不尽相同，可根据使用说明进行操作。
在进行细胞计数操作时，必须把细胞悬液准备好，细胞应分散良好，并充分混匀，若出现较多细胞团或细胞数少于 200 个 /10mm2 或多于 500 个 /10mm2 时，需重制细胞悬液，重新计数。
二、细胞生长曲线和生长倍数细胞生长曲线是细胞培养实验中最基本的指标，是测定细胞绝对增长数值和生长繁殖基本规律常用的简便方法。
常用的方法为：在同一规格的培养瓶中，接种同等量的同一代细胞，经培养后每隔24 小时取出几瓶细胞进行计数，以培养时间为横座标，不同时刻的细胞数的对数为底座标，标出各点并连成线，即为该细胞的生长曲线，可反应出细胞生长的动态。
测定生长曲线的另一种方法是用 96 孔/24 孔细胞培养板，分 7 组，每组 3 孔，培养一周 (7 天 )，期间逐日检测一组，计数，最后把 7 天中的细胞数值绘成图，即为细胞生长曲线。
软琼脂集落形成实验完整版
软琼脂集落形成实验集团标准化办公室：[VV986T-J682P28-JP266L8-68PNN]
一、目的：确定已转化肿瘤细胞的性质并对其进行定量。
二、原理：肿瘤细胞能无限繁殖形成细胞集落，而成熟分化的细胞则不能形成集落。
CHO-EGFP和CHO-ECRT39/272细胞在体外无需加刺激因子，可在软琼脂培养基中形成集落，其他细胞则丧失了软琼脂中形成集落的能力。
三、操作
1．收集对数生长期的细胞（如何鉴定），先测定细胞活力并进行活细胞计数，然后调整细胞浓度，用含20%FBS的DMEM制成1000活细胞／ml的细胞悬液。
2．用蒸馏水制备1.2%、0.7%两个浓度的低熔点琼脂糖，高压灭菌后，维持在40℃不会凝固；
3．1.2%琼脂糖和2xDMEM等体积混合，6孔板中加入1.4ml，RT凝固作为底层琼脂，置CO2温箱中备用；
4．0.7%琼脂糖和2xDMEM等体积混合，再加入细胞悬液充分混匀，RT凝固作为上层琼脂，勿有气泡，将实验组和对照组分两组加好，盖上盖并作好标记。
在室温放置20分钟使细胞琼脂悬液凝固。
以上各步骤均在无菌条件下进行。
5．然后移培养板或平皿于CO2培养箱中37℃进行培养。
6．培养7～l0天，肉眼观察并计数细胞集落。
四、结果：以肉眼可见的细胞团(含500个以上细胞)作为计数集落的标准。
集落的计数和计算：集落数=n孔中细胞集落数总和/n孔，
集落形成率=集落数/接种培养细胞总数×100％。
细胞生物学实验 ——步骤集
PEG促细胞融合法的步骤
（1） 取鸡血2ml+2ml Alsever液，再加入6ml Alsever液，混匀后 制悬液。（可在4℃保存） （2）取(1)1ml+4ml 0.85%的NaCl溶液，进行以下三次离心处理： ①.1200 r/min离心5分钟。（去上清液，再加入至5ml的 0.85%NaCl液） ②.1000~1200 r/min离心5分钟。（去上清液，再加入至5ml的 0.85%NaCl液） ③. 1000~1200 r/min离心7分钟。 （3）将上步最后一次的沉降血球（去上清液后，约0.1~0.2ml）， 加入GKN液至1~2ml，使之成10%的细胞悬液。 （4）取上述10%的血球悬液1ml，加入3ml GKN液，使每毫升含血 球15000000个，即 。 （5）取（4）1ml+0.5ml 50%的PEG液，或取（4）0.5ml+0.5ml 50%的PEG液，或取（4）0.5ml+1.0ml 50%的PEG液，混匀 滴片，在常温下2~3分钟后，镜下观察。
人类体细胞染色体的分类标准及其 主要特征
小鼠的转基因技术录像
• Procedure1. Dissection of oviducts. Recovery of fertilized eggs. Removal of cumulus cells. • Procedure2. Recovery of 8-cell embryos. Removal of the zona pellucida. Construction of aggregation chimeras. • Procedure3. Dissection of uteri. Recovery of blastocycsts. • Procedure4. DNA injection into pronuclei to produce transgenic embryos. • Procedure5. Nuclear transfer. • Procedure6. Blastocyst injection of embryonic stem cells. • Procedure7. Vasectomizing male mice. • Procedure8. Oviduct transfer of manipulated embryos. • Procedure9. Vterine transfer of manipulated embryos. • Procerdure10. Recovery of 6.5 and 7.5 day embryos. • Procerdure11. Dissection of midgestation 12.5 day embryos and fetal membtanes.
造血祖细胞的集落培养-1
造血祖细胞的集落培养-11、集落的种类：不同细胞来源的集落其形态和大小均有所不同.2、各种集落的培养步骤：各种造血细胞集落的培养条件有所不同，但其培养过程大致相似，操作步骤大致如下。
分离所要培养的细胞，制成单个核细胞悬液。
配制相应的培养体系。
按比例将细胞因子、营养素以及血清等加入到培养基中形成特有的培养体系，培养体系最好在37℃水浴中保温10mi n。
将琼脂等支持物煮沸融化，如是甲基纤维素则不需此步骤，待融化的支持物温度降到40℃时，加入培养系混匀。
将充分混匀的培养体系加入培养皿或培养板的孔中，一把种3个复孔。
将培养皿或培养板置于37℃、5%CO2饱和湿度环境下培养。
观察结果，不同的集落计数的时间有所不同，详见下述。
3、粒-单核-巨噬系细胞集落的培养：以往CFU-GM培养的刺激物多用人白细胞、胎肌以及胎盘裂解液作为条件培养基等，现多用造血生长因子替代。
这些细胞因子包括GM-CSF、G -CSF、M-CSF以及IL-3等，但常用GM-CSF。
培养基多用IMDM，RPMI等，培养基常用琼脂以及甲基纤维素，但效果前者较好。
培养体系包括20%-30%胎牛血清，50ng/mlGM-CSF，细胞悬液中细胞总数一般以（1-2）X10^5/ml为宜，其余用IMDM或RPMI补齐，但保持琼脂终浓度为0.3%，甲基纤维素终浓度为0.9%-1.0%。
细胞一般置于直径为33mm的培养皿或6孔板中，于37℃、5%CO2饱和湿度环境下培养。
（1）集落计数一般培养10-14天观察集落，大于40个细胞的细胞团为一个集落。
（2）集落形态一般CFU-GM的形态分3种。
致密型细胞紧密成团，细胞个体较小，对为粒细胞为主的集落。
混合型细胞团中央为紧密成团的粒细胞，周围弥散分布着单核细胞或巨噬细胞。
松散型细胞团比较均匀地分散，细胞个体较大，多为单核细胞和巨噬细胞组成。
4、红系集落的培养：（1）集落培养体系CFU-E的培养需要EPO，BFU-E的培养需要PHA-LCM、再生障碍性贫血患者血清或IL-3等，培养基主要为IMDM，几种培养体系见表6-5.（2）培养方法配制好的体系加入直径为33mm的培养皿或6孔板中，3 7℃、5%CO2饱和湿度环境下培养。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
细胞集落形成实验方法介绍
非整倍体无限细胞系和癌细胞株中，仍然存在不同细胞亚群，它们的功能和生长特点有些差异，其中有些亚群细胞对培养环境有较大的适应性和具有较强的独立生存能力，细胞集落率高。
纯化细胞群来自一个共同的祖细胞，细胞遗传性状、生物学特性相似，利于实验研究。
原代培养细胞和二倍体有限细胞系，细胞集落率很低。
细胞集落化培养之前，应先测定细胞集落形成率，以了解细胞在极低密度条件下的生长能力。
集落抑制率=（1-（实验组集落形成率/对照组集落形成率））×100%
（一）原理
细胞集落形成率单个细胞在体外增殖6代以上，其后代所组成的细胞群体，称为集落或克隆。
每个克隆含有50个以上的细胞，大小在0.3-1.0mm 之间。
集落形成率表示细胞独立生存能力。
常用方法有平板集落形成试验、软琼脂集落形成试验。
（二）实验用品
1.材料：Hela细胞。
2.器材：（直径60mm ）培养皿、细胞记数板、烧杯、吸管、离心机、离心管、废液瓶、倒置显微镜、二氧化碳培养箱、超净工作台、水浴锅。
3.试剂：Giemsa染液、0.25%胰蛋白酶消化液、血清细胞培养液、安尔碘、琼脂。
（三）方法
1.平板克隆形成试验
本法适用于贴壁生长的细胞，包括培养的正常细胞和肿瘤细胞。
(1)对指数生长期细胞，采用常规消化传代方法，制成细胞悬液。
(2)细胞悬液反复吹打，使细胞充分分散，单个细胞百分率应在95%以上。
细胞记数，并用培养基调节细胞浓度，待用。
(3)根据细胞增殖能力，将细胞悬液倍比稀释。
一般按照每皿含50、100、200个细胞的浓度分别接种5ml细胞悬液到培养皿（直径60mm ）中，以十字方向轻轻晃动培养皿，使细胞分散均匀。
(4)培养皿置37℃、5%CO2中培养2~3周，中间根据培养液pH变化适时更换新鲜培养液。
(5)当培养皿中出现肉眼可见克隆时，终止培养，弃去培养液，PBS液小心浸洗2次，空气干燥。
甲醇固定15分钟，弃甲醇后空气干燥。
用Giemsa染液染色10分钟，流水缓慢洗去染液，空气干燥。
2.软琼脂集落形成试验
本法适用于非锚着依赖性生长的细胞，如骨髓造血干细胞、肿瘤细胞株、转化细胞系。
利用琼脂液无粘着性又可凝固的特性，将肿瘤细胞混入琼脂液中，琼脂液凝固使肿瘤细胞置于一定位置，琼脂中肿瘤细胞可能向周围作全方位的移动，因此可以用来检测肿瘤细胞的主动移动能力。
肿瘤细胞在适宜培养基中又可以增殖，从而可以测定肿瘤细胞克隆形成率。
造血系统软琼脂集落形成试验方法相同，主要用于有关细胞分化的研究，但使用培养基不同。
（1）同上（1）~（3）步骤。
（2）调整细胞悬液密度为1×103个/ml细胞。
（3）制备底层琼脂，完全溶化的5%琼脂和37℃左右预温的新鲜完全培养液以1：9比例在40℃均匀混合，加入培养皿（直径60mm ）中，每皿含0.5%琼脂培养基2ml，室温下琼脂完全凝固。
（4）制备上层琼脂,取37℃不同密度梯度(按照每皿含50、100、200个)的细胞悬液1.5ml 移入小烧杯中，加入40℃、5%琼脂等体积混匀，即成0.25%半固体琼脂培养基。
配好的半固体琼脂培养基立即加入铺有底层琼脂的培养皿中，室温下琼脂凝固。
37℃、5%CO2静置培养2-3周。
（四）实验结果
1.定期观察细胞培养过程中集落的形成。
2.显微镜下计数大于50个细胞克隆数，然后按下式计算集落形成率：
集落形成率（%）=（集落数/接种细胞数）×100
（五）注意事项
1.琼脂对热和酸不稳定，如果反复加热，容易降解，产生毒性，同时琼脂硬度下降。
故琼脂高压灭菌( 10磅15分钟)后按一次用量进行分装。
2.细胞悬液中，细胞分散度>95%。
3.软琼脂培养时，注意琼脂与细胞混合时温度不要超过40℃，以免烫伤细胞。
4.接种细胞密度不宜过高。
5.细胞在低密度条件下培养，生存率明显下降，无限细胞系和肿瘤细胞株克隆形成率一般在10%以上。
但初代培养细胞和有限细胞系仅为0.5~5%,甚至为零。
为提高集落形成率，必要时在培养基中添加胰岛素、地塞米松等促细胞克隆形成物质。