细胞凋亡

凋亡细胞的普通光镜检测
• ＨＥ染色 • 特殊染色（甲基绿－派诺宁染色和Ｇｉｅ
ｍｓａ染色）
凋亡细胞的荧光显微镜检测
• 利用荧光素可以与凋亡细胞的某些成分中
的分子和功能基团发生特异性结合，并在 荧光显微镜下通过吸收激发光的光能发出 荧光这一特性来检测凋亡细胞。 • 常用荧光素有吖啶橙，碘化丙啶，溴化乙 啶，hoechst33342等。 啶，hoechst33342等。
凋亡与坏死的区别
凋亡
染色质 凋亡小体 细胞体积 线粒体 细胞内容物 对ATP要求 ATP要求 组织分布 炎症反应 大分子合成 DNA破坏机制 DNA破坏机制 凝集，电子密度加大 有 固缩 浓缩，跨膜电位受损， 不释放 必需 单个细胞 无 可有 内切酶作用裂解为180内切酶作用裂解为180-200bp 或其倍数
2002年10月7日英国人悉尼·布雷诺尔、美国人罗伯特· 霍维茨和英国人约翰·苏尔斯顿，因在器官发育和程序 性细胞死亡的基因调控方面的研究获诺贝尔生理学与医 学奖。
Sydney Brenner
H. Robert Horvitz
John E. Sulston
细胞凋亡的诱发因素
• 细胞因子 • 激素及药物 • 物理因素如紫外线、γ射线等 物理因素如紫外线、γ • 生物因素 • …………
坏死
疏松变性，固缩 无 肿胀 膨胀，破坏，Ca2+摄入 膨胀，破坏，Ca 释放 无需 细胞群体 有 无 随机降解，氧自由基损伤
Autophagy与apoptosis的关系 Autophagy与apoptosis的关系
• 有人把apoptosis也称为Ⅰ型程序性细胞死亡 ， 有人把apoptosis也称为Ⅰ
• 凋亡与肿瘤的发生
与肿瘤的发展 与肿瘤的转移 与肿瘤的治疗
凋亡的检测方法
• 凋亡检测要解决的问题：
1、被研究体系中是否有凋亡发生，即定性 2、凋亡的发生率，这显示群体细胞的量度 3、了解凋亡的严重度，以反应凋亡的阶段
形态学
检查方法 光学显微镜（LM） 光学显微镜（LM） 可鉴定凋亡细胞的特征 细胞体积缩小、核固缩、 细胞周围透明圈 相差显微镜（PCLM） 相差显微镜（PCLM） 细胞鼓泡，凋亡小体 透射电镜（TEM） 透射电镜（TEM） 微绒毛消失、核染色质沿 核膜分布，凋亡小体 激光共聚焦（ＣＬＳＭ） 凋亡细胞固缩染色质及核 碎片定位 扫描电镜（SEM） 扫描电镜（SEM） 细胞表面泡状突起 缩时摄影术（ＴＬＰ） 凋亡细胞的形成过程
细胞凋亡与细胞程序性死亡的关系
• 细胞程序性死亡（programmed cell death，PCD） • • •
是一种基因指导的细胞自我消亡方式。PCD存在于 胚胎发育过程中。 一般认为PCD与凋亡二者是同义词，可相互替代。 PCD是一种发育中对功能联系的操作性限定，属于 PCD 功能性概念，凋亡则是最初强调形态学改变、后来 强调生物化学改变的一种死亡模式，是形态学概念。 PCD的最终结果可以是细胞凋亡，但细胞凋亡并非 都是程序化的。
细胞凋亡研究模式生物
Caenorhabditis elegans
• ……………………
亡程序而导致细胞主动死亡的过程，是由 基因控制的个别细胞发生的自主有序的死 亡，具有特征性的形态和生化学改变。
自噬性程序性细胞死亡（Autophagy） 自噬性程序性细胞死亡（Autophagy）
• 这种形式的细胞死亡表现为细胞浆中出现
大量包裹着细胞浆和细胞器的空泡结构和 溶酶体对空泡内成分的降解。
BD FACS Calibur型 FCM Calibur型 （单L，3F） 3F）
流式细胞仪检测
形态学检测 细胞膜通透性检测
• FITC-Annexin V/PI双染法 FITCV/PI双染法
检测DNA含量的单参数分析PI染色法 检测DNA含量的单参数分析PI染色法
酶联免疫吸附法（ELISA） 酶联免疫吸附法（ELISA）
细胞凋亡及其检测
• 死亡是生命的普遍现象，但细胞死亡并非
与机体死亡同步。
• 正常的组织中也发生细胞死亡，它是维持
组织机能和形态所必需的。
细胞的死亡方式
• 坏死Necrosis 坏死Necrosis • 凋亡性程序性细胞死亡Apoptosis（凋亡） 凋亡性程序性细胞死亡Apoptosis（凋亡） • 自噬性程序性细胞死亡Autophagy 自噬性程序性细胞死亡Autophagy
TUNEL法检测阳性表现为在肿瘤组织中散在分布胞核呈棕黄色颗粒着色 的细胞 。在400倍光镜下,随机选择10个视野并计数1 000个肿瘤细胞,记录 凋亡细胞数。计算细胞凋亡指数(A I) ,A I = (凋亡细胞数/1 000) ×100%
流式细胞术
• 用途：对单个细胞进行快速定量分析与分选的一 •
将Autophagy称为Ⅱ型程序性细胞死亡 。 Autophagy称为Ⅱ
• 近年来越来越多的研究提示二者在某些情况下可
以相互拮抗或促进，可先后发生或同时共存于同 一细胞，相同诱导因素在不同细胞中可分别诱发 Autophagy或 Autophagy或apoptosis ；参与Autophagy 和 ；参与Autophagy apoptosis的分子也可能存在交叉，这些分子在 apoptosis的分子也可能存在交叉，这些分子在 Autophagy与凋亡两种程序性细胞死亡中可发挥 Autophagy与凋亡两种程序性细胞死亡中可发挥 正向或负向作用。
电子显微镜检测
凋亡细胞的电镜检测
正常 凋亡
核酸电泳检测细胞凋亡
核酸电泳检测细胞凋亡
末端脱氧核糖核酸转移酶介导的ｄＵＴ Ｐ缺口末端标记技术（TUNEL） Ｐ缺口末端标记技术（TUNEL）
• 由于细胞凋亡时DNA断裂产生大量游离的3’ 由于细胞凋亡时DNA断裂产生大量游离的3
羟基末端，利用TdT介导，无需DNA模板可 羟基末端，利用TdT介导，无需DNA模板可 将生物素或地高辛标记的外源性dUTP直接 将生物素或地高辛标记的外源性dUTP直接 连接到凋亡细胞核的DNA 连接到凋亡细胞核的DNA断链的3’羟基末端， DNA断链的3 通过过氧化物酶标记的链卵白素或地高辛 抗体与之结合，经显色即可显示凋亡细胞。
• ELISA法是定量检测细胞凋亡的免疫化学法， ELISA法是定量检测细胞凋亡的免疫化学法，
其基本原理是检测细胞凋亡后形成的由组 蛋白及DNA片段组成的核小体。 蛋白及DNA片段组成的核小体。 • 适合单一成分细胞的检测 • 不能提供相关细胞的组织学定位
其它
线粒体膜电位的检测
其它
相关凋亡细胞的某些通路蛋白的检测，如caspase等 相关凋亡细胞的某些通路蛋白的检测，如caspase等
门技术。 原理：包在鞘液中的细胞通过高频振荡控制的喷 嘴，形成包含单个细胞的液滴，在激光束的照射 下，这些细胞发出散射光和荧光，经探测器检测， 转换为电信号，送入计算机处理，输出统计结果， 并可根据这些性质分选出高纯度的细胞亚群，分 离纯度可达99%。包被细胞的液流称为鞘液，所 用仪器称为流式细胞计（flowcytometer）。
细胞凋亡的可能信号通路
细胞凋亡相关基因Biblioteka • Bcl-2家族 Bcl• p53 • c-myc • Fas/FasL • Caspase家族 Caspase家族 • IAP家族 IAP家族 • …………
凋亡与肿瘤
• 目前对肿瘤的认识为：
①肿瘤发生发展是复杂、多基因、多阶段 的过程 ②原癌基因的激活和（或）抑癌基因失活 ③肿瘤不仅是细胞增殖和分化异常性疾病 同时也是凋亡异常性疾病。细胞增殖率升 高，细胞凋亡低下。
细胞坏死（Necrosis） 细胞坏死（Necrosis）
• 是细胞受到急性强力伤害（严重的缺血缺
氧、高热、补体、生物毒素）时立即出现 的反应。
• 早期表现为细胞膜破坏，线粒体肿胀。 • 继而溶酶体破裂，细胞内容物流出，引起
炎症。
细胞凋亡（Apoptosis） 细胞凋亡（Apoptosis）
• 是由体内外某些因素触发细胞内预有的死
• 形态学上，即将发生autophagy 的细胞胞浆中出 形态学上，即将发生autophagy
现大量游离的膜性结构，称为前自噬泡。前自噬 泡逐渐发展，成为由双层膜结构形成的空泡，其 中包裹着变性坏死的细胞器和部分细胞浆，这种 双层膜被称为自噬泡 。
• 自噬泡的外膜与溶酶体膜融合，内膜及其包裹的
物质进入溶酶体腔，被溶酶体中的酶水解。此过 程使进入溶酶体中的物质分解为其组成成分，并 被细胞再利用 。除可溶性胞浆蛋白之外，像线粒 体、过氧化物酶体等细胞器或细胞器的一部分， 如高尔基体和内质网的某些部分都可被溶酶体所 降解 。