第四章 酶
第四章 酶1
• 酶活力的测定（实际就是酶的定量测定）：测定酶促反应 的速度 • 酶反应速度：单位时间内、单位体积中底物的减少量或产 物的增加量来表示，单位：浓度/反应时间 •一般测定产物的增加为好why？ •酶反应速度往往随时间延长而变化？ →常以酶促反应的初速度表示？ 据产物物理化学性质选择适当测定方法（以判断产物增加量） UV-Vis、荧光、同位素测定、电化学方法
2）转移酶Transferase
• 转移酶催化基团转移反应，即：将一个底物分子的基团 转移到另一个底物的分子上 • 例如：谷丙转氨酶催化的氨基转移反应
CH3CHCOOH HOOCCH2CH2CCOOH NH2 CH3CCOOH O O HOOCCH2CH2CHCOOH NH2
• 还有转移碳基、醛或酮基、酰基、糖苷基、磷酸基和含 硫基的酶
• 生物体内辅因子种类有限，而酶的种类繁多 • 每一种需要辅因子的脱辅酶往往只能与特定的辅因子结合， 即：脱辅酶对辅因子的要求有一定选择性 • 同一种辅因子往往可以与多种不同的脱辅酶结合而表现出 多种不同的催化作用 • 如：3-磷酸甘油醛脱氢酶、乳酸脱氢酶中，均需辅酶I • 催化不同的底物脱氢
3、单体酶、寡聚酶、多酶复合体
生
物
化
学
第四章 酶
酶——生物催化剂
• 每一种生物过程所必须，生命现象是催化剂催化的多步反应
• 营养素分子的分解、从小分子前体合成生物大分子 • 化学能的贮存和转换
• 细胞为什麽需要酶
• 在生理条件下无催化剂许多反应进行的太慢
• 在细胞环境中没有催化剂时许多生化反应不能进行
• 为什麽要研究酶？
• 酶研究是理解缺陷=遗传紊乱的基础（酶活性为什麽丧失？） • 是理解和治疗一些癌症的基础（为什麽生长控制中酶活性永远 处于“开”状态？） • 可以指示药物的作用靶点（病原体酶进行选择性抑制） • 应用于生物产业（复杂的合成与转化）
4.12第四章酶的分离纯化
超速离心机的最大转速达 (2.5～12)×104 r/min，相对离心力可以高达 5×105 g甚至更高。超速离心主要用于DNA、RNA、蛋白质等生物大分 子以及细胞器、病毒等的分离纯化；样品纯度的检测；沉降系数和相对 分子质量的测定等。
溶液的介电常数降低，就使溶质分子间的静电引力增 大，互相吸引而易于凝集，同时，对于具有水膜的分 子来说，有机溶剂与水互相作用，使溶质分子表面的 水膜破坏，也使其溶解度降低而沉淀析出。
常用于酶的沉淀分离的有机溶剂有乙醇、丙酮、异丙 醇、甲醇等 。
2、离心分离
离心分离是借助于离心机旋转所产生的离心力，使不同大小、 不同密度的物质分离的技术过程。
4.4 酶的分离方法
1、沉淀分离 2、离心分离 3、过滤与膜分离 4、层析分离 5、电泳分离 6、萃取分离
1、沉淀分离
沉淀分离是通过改变某些条件或添加某种物质，使酶的溶解 度降低，而从溶液中沉淀析出，与其它溶质分离的技术过程。
沉淀分离方法 盐析沉淀法
等电点沉淀法
有机溶剂沉淀法
复合沉淀法 选择性变性沉淀 法
胆固醇浆液分析 牛奶灭菌后H2O2的 清除
1、细胞破碎
许多酶存在于细胞内。 为了提取这些胞内酶， 首先需要对细胞进行破 碎处理。
1）机械破碎 2）物理破碎 3）化学破碎 4）酶解破碎
参见动画
高 压 细 胞 破 碎 机
超 声 波 细 胞 粉 碎 机
生物化学 第四章 酶
生物化学 第四章 酶1、什么是酶?(酶的定义是什么)?酶的化学本质是什么?(1)酶是由活细胞产生的对特异底物具有高效催化作用的蛋白质和核酸(2) 化学本质：蛋白质2、什么是单体酶?寡聚酶?多酶复合体?多功能酶?单体酶：由一条多肽链构成的酶，溶菌酶；寡聚酶：由多个相同或不同亚基以非共价键连接的酶，磷酸化酶a ；多聚复合体：由几种酶靠非共价键彼此嵌合而成。
可一次催化连锁反应的复合体，丙酮酸脱氢酶系；多功能酶：一条多肽链上同时具有多种不同催化活性的酶，生物进化中基因融合的产物，DNA 聚合酶3、简述酶的分类?单纯酶、结合酶的定义是什么?酶蛋白、辅助因子的作用? 酶的分类：单体酶、寡聚酶、多酶复合体及多功能酶单纯酶：仅由多肽链组成，如淀粉、脲酶、核糖核酸酶等结合酶：由蛋白质部分和非蛋白质部分组成，其催化作用依赖于两部分的共同参与，如氨基转移酶、碳酸酐酶、乳酸脱氢酶等。
酶蛋白的作用：决定反应专一性辅助因子的作用：决定反应的种类与性质4、辅助因子的分类及分类依据是什么?各自(辅酶、辅基)的作用分别由哪些? 辅助因子的分类：辅酶和辅基。
分类依据：按照其与酶蛋白结合的紧密程度及作用特点不同辅酶的作用：与酶蛋白共价键结合紧密，不可用透析、超滤方法除去 辅基的作用：与酶蛋白非共价键结合不牢固，可用透析、超滤方法除去5、什么是酶的活性中心?酶的活性中心包括哪些基团?这些基团的功能是什么? 酶的活性中心：酶分子中必需基团相对集中，形成一个与底物特异性结合并催化其反应生成产物的具有特定三维结构的区域。
活性中心的基团 (1)结合基团：可与底物结合(2)催化基团：催化底物发生化学反应6、什么是酶原?什么是酶原激活?酶原激活的机制是什么?简述酶原激活的生理意义?酶原：是细胞内合成或初分泌时处于无活性状态的酶的前体 酶原激活：在一定条件下，酶原向有活性酶转化的过程。
酶原激活的生理意义：(1)酶原是酶的安全转运形式，避免细胞产生的酶对细胞进行自身消化，并使酶在特定的部位和环境中发挥作用，保证体内代谢正常进行。
高级生化题库——第四章酶
⾼级⽣化题库——第四章酶第四章酶⼀、名词解释1、固定化酶⼆、是⾮题1、酶的最适pH与酶的等电点是两个不同的概念，但两者之间有相关性，两个数值通常⽐较接近或相同。
（－）2、对于⼀个酶⽽⾔，其过渡态的底物类似物与底物的物相⽐较，是更有效的竞争性抑制剂。
（＋）3、在结构上与底物⽆关的各种代谢物有可能改变酶的Km值o4、如果加⼊⾜够的底物，即使存在⾮竞争性抑制剂，酶催化反应也能达到正常的Vmax。
5.、酶反应最适pH不仅取决于酶分⼦的解离情况,同时也取决于底物分⼦的解离情况( )6、反竞争性抑制剂(I)⾸先与酶结合形成EI，EI再与底物(S)结合形成EIS，EIS不能分解成产物，I因此⽽起抑制作⽤。
7、Km的物理意义是指当酶反应速率达到最⼤反应速率⼀半时的底物浓度。
为使某⼀反应的反应速度从10%Vmax提⾼到90%Vmax，其底物浓度应提⾼9倍。
8、推导Michaelis-Menten⽅程时，假设之⼀是随底物转变为产物，酶-底物复合物的浓度不断下降。
9、⼀种酶有⼏种底物时，就有⼏种Km值。
10、别构酶对温度的反应很特殊，有的在0℃时不稳定，在室温时反⽽稳定。
三、填空题1、酶容易失活，如何保存酶制品是⼀个很重要的问题。
通常酶制品的保存⽅法有＿＿＿和＿＿＿等。
2、有⼀类不可逆抑制剂具有被酶激活的性质,被称为_________型不可逆抑制剂,⼜可被称作酶的_____________3、抗体酶既具有专⼀结合抗原的性质，⼜具有酶的催化功能。
4、胰蛋⽩酶原__________端切去6肽后变成有活性的胰蛋⽩酶。
5、于1953年⾸先完成了胰岛素的全部化学结构的测定⼯作。
⽽⽜胰核糖核酸酶是测出⼀级结构的第⼀个酶分⼦，由⼀条含124个残基的多肽链组成，分⼦内含有__________个⼆硫键。
6、胰凝乳蛋⽩酶原受到胰蛋⽩酶作⽤后，在______________与_______________之间的肽键断开，成为有活性的π-胰凝乳蛋⽩酶，再失去两个⼆肽_________________和________________⽽形成酶的稳定形式α-胰凝乳蛋⽩酶。
酶学第四章酶的结构和功能
第四章酶的结构和功能4.1 酶的活性中心4.1.1 酶的活性中心和必需基团的概念在酶蛋白中，只有少数特异的氨基酸残基与催化活性直接相关。
这些特异的氨基酸残基可以在肽链的一级结构上相距较远，但通过肽链的折叠、盘旋，使它们在空间上接近，形成活性中心（或称活性部位）。
组成活性中心的氨基酸残基有些执行结合底物的任务，有些执行催化反应的任务。
我们把组成活性中心的氨基酸残基的侧链基团及一些维持整个酶分子构象所必需的侧链基团称为必需基团。
1960年，Koshland将酶分子中的氨基酸残基或其侧链基团分成4类：接触残基（直接与底物接触，参与结合或催化的残基；右图中的R1、R2、R6、R8、R9、R163、R164、R165），辅助残基（对接触残基的功能起辅助作用的残基，也位于活性中心；右图中的R4），结构残基（维持构象的残基，此为活性中心以外的必需基团；右图中的R10、R162、R169），非贡献残基（或称非必需残基，非必需只是对酶发挥活性而言，它们可能有其他作用，如识别自身物质、运输、防止降解等；右图中的R3、R5、R7）。
4.1.2 酶活性中心的拓扑学酶的活性中心可以设想为一个口袋或是一条沟槽，形状与底物相近。
不同的酶的口袋适合不同的底物。
口袋中有相应的结合残基与底物上的某些基团结合，发生反应的底物上的键与催化基团靠近。
亲水基团与亲水残基亲合，疏水基团与疏水残基亲合，带电荷的基团与带相反电荷的残基亲合。
例如羧肽酶A催化多肽链上羧基端氨基酸的水解。
当末端氨基酸是含有较大疏水基团的氨基酸时（苯丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸），反应速度很快。
但是当有这些较大疏水基团的氨基酸残基进入亚位点3～6时，就会减低酶对这些底物的亲和力。
说明羧肽酶A对底物的识别和结合有多个位点。
同时，苯丙氨酸是羧肽酶A的竞争性抑制剂。
4.2 酶活性中心化学基团的鉴定常用的方法有化学修饰法、反应动力学法和x-光晶体衍射法。
4.2.1化学修饰法酶分子中有许多氨基酸残基的侧链基团可以被化学修饰，如羟基、巯基、咪唑基、氨基、羧基等。
第四章 酶
第四章酶0007104010102 01 10 70 30 01 01 01辅酶与辅基的主要区别在于A.分子大小不同B.理化性质不同C.化学本质不同D.分子结构不同E.与酶蛋白结合紧密程度不同00071E0007204030300 01 10 60 35 01 01 03心肌梗死时，乳酸脱氢酶的同工酶谱中增加最显著的A.LDH lB.LDH2C.LDH3D.LDH4E.LDH500072A0007304040300 01 10 80 10 01 01 03保存酶制品最适宜的温度是A.4℃B.25℃C.37℃D.60℃E.80℃00073A0007404030100 01 10 40 50 01 01 01有关酶活性中心的论述正确的是A.酶的活性中心由非必需基团组成B.酶的活性中心不是底物结合的部位C.催化相同反应的酶具活性中心不同D.酶的活性中心有结合基团和催化基团E.酶的活性中心是由一级结构相互邻近的基团组成00074D0007504030200 01 10 70 30 01 01 01酶原的激活是由于A.激活剂能促使抑制物从酶原分子上除去B.激活剂能促使酶原分子上的催化基因活化C.激活剂能促使酶原分子的空间构象发生变化D.激活剂能促使酶原分子上的结合基团与底物结合E.激活剂能促使酶原分子上的活性中心暴露或形成00075E00007604040200 01 10 70 30 01 01 01酶促反应速度与酶浓度成正比时的条件是A.正常体温B.碱性条件C.酸性条件D.酶浓度足够大时E.底物浓度足够大时00076E0007704010102 01 10 70 30 01 01 01结合酶的酶蛋白的作用是A.选择催化的底物B.提高反应的活化能C.决定催化反应的类型D.使反应的平衡常数增加E.使反应的平衡常数减少00077A0007804010102 01 10 70 30 01 01 01全酶是指A.酶的无活性前体B.酶蛋白与底物复合物C.酶蛋白与抑制剂复合物D.酶蛋白与辅助因子复合物E.酶蛋白与变构剂的复合物00078D0007904010000 01 10 70 30 01 01 01关于酶的叙述哪项是正确的A.只能在体内起催化作用B.所有的酶都含有辅基或辅酶C.大多数酶的化学本质是蛋白质D.都具有立体异构专一性（特异性）E.能改变化学反应的平衡点加速反应的进行00079C0008004030200 01 10 68 32 01 01 01酶原所以没有活性是因为A.缺乏辅酶或辅基B.是已经变性的蛋白质C.酶原是普通的蛋白质D.酶蛋白肽链合成不完全E.活性中心未形成或未暴露00080E0008104040602 01 10 60 40 01 01 03磺胺类药物的类似物是A.叶酸B.嘧啶C.二氢叶酸D.四氢叶酸E.对氨基苯甲酸00081E0008204010102 01 10 65 35 01 02 01辅酶NADP+分子中含有哪种B族维生素A.叶酸B.核黄素C.硫胺素D.尼克酰胺E.磷酸吡哆醛00082D0008304010102 01 10 50 50 01 01 01下列关于酶蛋白和辅助因子的叙述，哪一点是正确的A.酶蛋白决定反应类型B.辅助因子不直接参加反应C.酶蛋白或辅助因子单独存在时均有催化作用D.一种酶蛋白只与一种辅助因子结合成一种全酶E.一种辅助因子只能与一种酶蛋白结合成一种全酶00083D0008404040101 01 10 30 80 01 01 01如果有一酶促反应其〔S〕=1/2Km，则v值应等于多少VmaxA.0.25B.0.33C.0.50D.0.67E.0.7500084B0008504040601 01 10 60 40 01 01 03有机磷杀虫剂对胆碱酯酶的抑制作用属于A.可逆性抑制作用B.竞争性抑制作用C.非竞争性抑制作用D.反竞争性抑制作用E.不可逆性抑制作用00085E0008604040602 01 10 75 25 01 01 03丙二酸对于琥珀酸脱氢酶的影响属于A.反馈抑制B.底物抑制C.变构调节D.竞争性抑制E.非竞争性抑制00086D0008704030501 01 10 70 30 01 03 01酶高度的催化效率是因为它能A.升高反应温度B.增加反应的活化能C.降低反应的活化能D.改变化学反应的平衡点E.催化热力学上允许催化的反应00087C0008804010102 01 10 60 40 01 01 01决定酶特异性的是A.辅酶B.辅基C.酶蛋白D.金属离子E.辅助因子00088C0008904010102 01 10 70 30 01 01 01全酶是指A.结构完整的酶B.酶与激动剂的复合物C.酶与抑制剂的复合物D.酶与变构剂的复合物E.酶蛋白与辅助因子的结合物00089E0009004030100 01 10 30 70 01 01 01有关酶活性中心的叙述正确的是A.酶都有活性中心B.位于酶分子核心C.酶活性中心都含辅基或辅酶D.抑制剂都作用于酶活性中心E.酶活性中心都有调节部位和催化部位00090A0009104030200 01 10 70 30 01 01 01以酶原形式分泌的酶是A.脂肪酶B.淀粉酶C.转氨酶D.消化管内的蛋白酶E.组织细胞内的脱氢酶00091D0009204030200 01 10 67 33 01 01 01 酶原没有催化活性是因为A.辅助因子的脱落B.由于周围有抑制剂C.作用的温度不合适D.活性中心没有形成或暴露E.反应环境的酸碱度不合适00092D0009304030300 01 10 90 10 01 01 01 同工酶具有下列何种性质A.催化功能相同B.理化性质相同C.免疫学性质相同D.酶蛋白分子量相同E.酶蛋白分子结构相同00093A0009404030200 01 10 60 35 01 01 01 激活胰蛋白酶原的物质是A.胃酸B.胆汁酸C.肠激酶D.端粒酶E.胃蛋白酶00094C0009504030200 01 10 70 30 01 01 02胰液中的蛋白水解酶最初以酶原形式存在的意义是A.保持其稳定性B.保护自身组织C.促进蛋白的分泌D.抑制蛋白酶的分泌E.保证蛋白质在一定时间内发挥消化作用00095B0009604040602 01 10 70 30 01 01 01下列关于竞争性抑制剂的论述哪项是正确的A.抑制剂与酶活性中心结合B.抑制剂与酶以共价键结合C.抑制剂结构与底物不相似D.抑制剂与酶的结合是不可逆的E.抑制程度只与抑制剂浓度有关00096A0009704040602 01 10 60 40 01 01 03磺胺类药物是下列哪个酶的抑制剂A.二氢叶酸合成酶B.二氢叶酸还原酶C.四氢叶酸合成酶D.四氢叶酸还原酶E.一碳单位转移酶00097A0009804040101 01 10 60 40 01 01 01反应速度为最大反应速度的80%时，Km值等于A.1/2[s]B.1/4[s]C.1/5[s]D.1/6[s]E.1/8[s]00098B0009904040300 01 10 65 35 01 01 03乳酸脱氢酶加热后活性大大降低的原因是A.亚基解聚B.酶蛋白变性C.酶活性受抑制D.辅酶失去活性E.酶蛋白与辅酶分离00099B0010004040601 01 10 60 40 01 01 02重金属盐对巯基酶的抑制作用是A.可逆性抑制B.竞争性抑制C.非竞争性抑制D.不可逆抑制E.竞争性抑制00100D0010104040601 01 10 65 35 01 01 02化学毒气路易士气中毒时，下列哪种酶受抑制A.碳酸苷酶B.胆碱脂酶C.含巯基酶D.丙酮酸脱氢酶E.琥珀酸脱氢酶00101C0010204020200 01 10 90 10 01 01 03唾液淀粉酶对淀粉起催化作用，对蔗糖不起作用这一现象说明了酶有A.不稳定性B.可调节性C.高度的特异性D.高度的敏感性E.高度的催化效率00102C0010304010000 01 10 70 30 01 01 01关于酶概念的叙述下列哪项是正确的A.其底物都是有机化合物B.所有蛋白质都有酶的活性C.其催化活性都需特异的辅助因子D.体内所有具有催化活性的物质都是酶E.酶是由活细胞合成的具有催化作用的生物大分子00103E0010404020000 01 10 60 40 01 02 01关于酶性质的叙述下列哪项是正确的A.酶能改变反应的平衡点B.酶能提高反应所需的活化能C.酶加快化学反应达到平衡的速度D.酶的催化效率高是因为分子中含有辅酶或辅基E.酶使化学反应的平衡常数向加速反应的方向进行00104C0010504030100 01 10 60 40 01 01 01关于酶活性中心的叙述下列哪项是正确的A.所有的酶都有活性中心B.所有酶的活性中心都含有辅酶C.所有酶的活性中心都有金属离子D.所有的必需基团都位于酶的活性中心E.所有的抑制剂都作用于酶的活性中心00105A0010604020000 01 10 60 40 01 02 01酶加速化学反应的根本原因是A.升高反应温度B.增加底物浓度C.降低产物的自由能D.增加反应物碰撞频率E.降低催化反应的活化能00106E0010704010102 01 10 60 40 01 01 01关于辅酶的叙述正确的是A.与酶蛋白紧密结合B.金属离子是体内最重要的辅酶C.在催化反应中不与酶活性中心结合D.体内辅酶种类很多，其数量与酶相当E.在催化反应中传递电子、原子或化学基团00107E0010804010102 01 10 80 20 01 01 01单纯酶是指A.结构简单的酶B.酶的无活性前体C.酶与抑制剂复合物D.酶与辅助因子复合物E.仅由氨基酸残基构成的单纯蛋白质00108E0010904010102 01 10 70 30 01 01 01关于结合酶的论述正确的是A.酶蛋白具有催化活性B.酶蛋白与辅酶共价结合C.酶蛋白决定酶的专一性D.辅酶与酶蛋白结合紧密E.辅酶不能稳定酶分子构象00109C0011004040102 01 10 80 20 01 01 01Km值是指A.反应速度等于最大速度时的温度B.反应速度等于最大速度时酶的浓度C.反应速度等于最大速度时的底物浓度D.反应速度等于最大速度50％的底物浓度E.反应速度等于最大速度50％的酶的浓度00110D0011104040102 01 10 70 30 01 01 01关于Km的意义正确的是A.Km为酶的比活性B.Km值与酶的浓度有关C.Km的单位是mmol/minD.Km值是酶的特征性常数之一E.Km越大，酶与底物亲和力越大00111D0011204040102 01 10 60 40 01 01 03关于Km的叙述，下列哪项是正确的A.与环境的pH无关B.是酶和底物的反应平衡常数C.是反映酶催化能力的一个指标D.是引起最大反应速度的底物浓度E.通过Km的测定可鉴定酶的最适底物00112E0011304040100 01 10 70 30 01 01 01当[E]不变，[S]很低时，酶促反应速度与[S]A.无关B.成正比C.成反比D.成反应E.不成正比00113B0011404040101 01 10 60 40 01 01 01当酶促反应速度等于Vmax的80％时，Km与[S]关系是A.Km=0.1[S]B.Km=0.22[S]C.Km=0.25[S]D.Km=0.40[S]E.Km=0.50[S]00114C0011504040300 01 10 90 10 01 01 01关于酶的最适温度下列哪项是正确的A.与反应时间无关B.是酶的特征性常数C.是酶促反应速度最快时的温度D.是一个固定值与其它因素无关E.是指反应速度等于50％Vmax时的温度00115C0011604040100 01 10 70 30 01 01 01当底物浓度达到饱和后，如再增加底物浓度A.形成酶一底物复合物增多B.反应速度随底物的增加而加快C.增加抑制剂反应速度反而加快D.随着底物浓度的增加酶失去活性E.酶的活性中心全部被占据，反应速度不再增加00116E0011704030300 01 10 60 40 01 01 01关于乳酸脱氢酶同工酶的叙述正确的是A.5种同工酶的理化性质相同B.5种同工酶的电泳迁移率相同C.由H亚基和M亚基以不同比例组成D.H亚基和M亚基单独存在时均有活性E.H亚基和M亚基的一级结构相同，但空间结构不同00117C0011804040602 01 10 50 50 01 01 02关于非竞争性抑制的叙述，正确的是A.不影响VmaxB.抑制剂与酶的活性中心结合C.抑制剂与酶结合后不能与底物结合D.抑制剂与酶结合后不影响与底物结合E.抑制作用可通过增加底物浓度减弱或消除00118D0011904030300 01 10 90 10 01 01 01同工酶是指A.催化的化学反应相同B.酶的结构相同而存在部位不同C.催化不同的反应而理化性质相同D.催化相同的化学反应理化性质也相同E.由同一基因编码翻译后的加工修饰不同00119A0012004030300 01 10 90 10 01 01 01含LDH1丰富的组织是A.心肌B.骨骼肌C.脑组织D.肾组织E.肝组织00120A0012104010000 08 30 90 10 01 01 02酶00121酶是由活细胞合成的;对特异的底物起高效催化作用的;生物大分子;0012204030100 08 30 50 50 01 01 02酶的活性中心00122能与底物特异结合并将底物转化为产物的这一区域称为酶的活性中心;0012304030200 08 30 70 30 01 01 02酶原00123这种无活性的酶的前体称酶原;0012404030300 08 30 70 30 01 01 01同工酶00124同工酶是指催化相同的化学反应;但酶蛋白的分子结构、理化性质乃至免疫学特性不同的一组酶;0012504020200 08 30 70 30 01 01 01酶的特异性00125酶对其催化的底物有严格的选择性;0012604030300 09 80 50 50 01 01 01什么是同工酶？其检测有何临床意义？00126(1)同工酶是指催化相同的化学反应，但酶蛋白的分子结构、理化性质及免疫学性质不同的组酶;(2)当某一特定器官发生病变时，其细胞内的酶释放人血，测定血中其同工酶谱及活性增多的情况，可反映组织器官病变的严重程度。
第四章 酶3 酶的作用机制及活性调节
• b. 修饰剂浓度与酶失活或降低的程度若成正比，则修饰位 于活性中心内
将修饰后的酶水解，肽键打开（但修饰剂与酶结合的共价 键不被打开）→得到带有标签的肽段→用氨基酸测序进行 鉴定
2、研究酶活性部位的方法
2、研究酶活性部位的方法
定点诱变法
• 改变编码蛋白质基因重的DNA顺序→改变氨基酸残基→确 定活性部位 • 如果被代换的氨基酸不影响酶的活性，则该位臵的氨基酸 残基不是必须基团 • 如果被代换的氨基酸使酶活性丧失或降低，则该位臵的原 有氨基酸残基是必须基团
• 1）vmax不变，Km值升高，该位臵氨基酸为结合基团
生
物
化
学
第四章 酶
§4.3 酶的作用机制和酶的调节
• 一、酶的活性部位 • 二、酶催化反应的独特性质 • 三、影响酶催化效率的有关因素
• 四、酶催化反应机制的实例
• 五、酶活性的调节控制
• 六、同工酶
一、酶的活性部位
• 只有少数的氨基酸残基参与底物结合及催化作用
• 酶的活性部位（active site/ active center ）——与酶活力直 接相关的区域：分为结合部位（负责与底物的结合→决定酶 的专一性）和催化部位（负责催化底物键的断裂形成新键→ 决定酶的催化能力）
二、酶催化反应的独特性质
• 1、酶反应有两类：其一仅涉及到电子的转移（转换数约 108s-1）；其二涉及到电子和质子两者或其他基团的转移 （约103s-1，大部分反应） • 2、酶催化作用是由氨基酸侧链上的功能基团（His、Lys、 Glu、Asp、Ser、Cys）和辅酶为媒介的→比只利用氨基酸 侧链来说，为催化反应提供了更多种类的功能基团 • 3、酶催化反应的最适pH范围通常是狭小的 • 4、与底物分子相比，酶分子很大而活性部位通常只比底物 稍大一些 • 5、存在一个或以上的催化基团及活性部位
大学生物化学 酶
异促效应
别构酶的特点
1、别构酶多为寡聚酶，由多亚基组成，包括活性部位 （结合和催化底物）与调节部位（结合效应物）。 2、具有别构效应。指酶和一个配体（底物，效应物）结 合后可以影响酶和另一个配体（底物）的结合能力。 3、别构酶大都不遵循米氏动力学。
别构酶与非调节酶动力学曲线的比较
练习题
当 一 酶 促 反 应 进 行 的 速 率 为 Vmax 的 80%时，在Km 和[S]之间有何关系？
米氏常数的意义
Vmax·[ S] V=
Km + [ S]
（1）概念 （2）Km值是酶的特征性常数。 （3）Km值与酶和底物亲和力的关系。
Km求法
Vmax·[ S] V=
Km + [ S]
双倒数曲线
加入反竞争性抑制剂后：Km 和Vmax均变小。
练习题
举例说明竞争性抑制的特点和实际意义。
三种可逆性抑制作用的比较
影响
竞争性 非竞争性 反竞争性
抑制剂的结合组分 E
抑制程度取决于 [I]/[S]
对Vmax的影响 不变
对Km的影响
增大
E、ES [I] 减小 不变
ES [I]
减小 减小
七、酶活性的调节
举例
乳酸脱氢酶
同工酶举例
乳酸脱氢酶同工酶
HH HH
LDH1 (H4)
HH HM
LDH2 (H3M)
HH MM
LDH3 (H2M2)
HM MM
LDH4 (HM3)
MM MM
LDH5 (M4)
不同组织中LDH同工酶的电泳图 谱
LDH1(H4)
+
LDH2(H3M)
生物化学第四章酶
生物化学
授课教师：叶素梅 副教授
第四章 酶
问题1：
你每天吃的东西在体内是怎么消化的？
酶类药物
酶的发现
第一节 酶的概念及作用特点
一、酶（E）及相关概念 • 定义：由活体细胞分泌的, 在体内外具有催化功能的蛋白质 • 酶促反应：酶所催化的化学反应
• 底物：酶所催化的物质
S
• 产物：酶促反应的生成物
心肌炎：LDH1 ↑ 肺梗塞：LDH3 ↑ 肝炎：LDH5 ↑
生理及临床意义
在代谢调节上起着重要的作用； 用于解释发育过程中各阶段特有的代谢特征； 同工酶谱的改变有助于对疾病的诊断； 同工酶可以作为遗传标志，用于遗传分析研究。
第四节 酶促反应动力学
➢ 概念
研究各种因素对酶促反应速度的影响，并加以定量 的阐述。
磷酸基的受体)
第三节 酶的结构与催化活性 一、酶的分子组成
1.单纯酶
仅由氨基酸构成
2.结合酶
还含有非蛋白质部分
酶蛋白 + 辅助因子
(无催化活性) (无催化活性)
全酶
(有催化活性)
各部分在催化反应中的作用
酶蛋白决定反应的特异性
辅助因子决定反应的种类与性质
组成
无机金属离子
常见： K+、Na+、Mg2+、
相对专一性
作用于一类化合物或一种化学键
脂肪酶 催化脂肪水解 酯类水解
立体异构专一性
一种酶仅作用于立体异构体中的一种
L-乳酸
D-乳酸
乳酸脱氢酶(LDH)
（3）高度不稳定性 • 易受变性因素影响而失活
（4）酶活性的可调性 • 自身不断进行新陈代谢，通过改变酶合成和降解的速度调
生物化学-酶
酶一级结构的差别也决定了催化性质的不同， 如胰蛋白酶、 胰糜蛋白酶和弹性蛋白酶三种蛋白 酶的活性中心Ser残基附近都有一个在立体结构上 的“口袋”状结构。由于三种蛋白酶的口袋”状结 构不同，决定其与不同底物结合即有不同特异性。
酶的特异的三维空间结构是酶催化功能的基础。 酶的二、三级结构是维持酶的活性中心空间构象的 必需结构。
酶的命名包括习惯命名和系统命名，酶可分为六类。 酶与疾病发生、诊断、治疗等密切相关。
➢一、酶的概念 酶是由生物活细胞产生的具有高效催化功能
和高度专一性的一类特殊蛋白质，又叫生物催化 剂•．绝大多数的酶都是蛋白质。
酶的化学本 质是什麽？
酶的概念
• 一、相关概念 • 酶催化的生物化学反应，称为酶促反应。 • 被酶的催化的物质称为底物(S) • 反应的生成物为产物（P） • 酶所具有的催化能力称酶的活性． • 酶失去催化能力称酶的失活．
第四章 酶 (Enzymes)
内容简介
酶是具有高度催化效率及高度特异性的蛋白质。 酶通过多种机制降低反应活化能使反应速率增加。 酶分子一级结构及空间结构是催化功能的基础。 酶促反应速率受到[S]、[E]、pH、T、抑制剂及激活
剂的影响
酶活性可受到别构调节、共价修饰、酶原激活、关键 酶、多酶体系、同工酶等调节
H N C O
COOH CH
R6
氨基酸
氨基酸
消化道中各种蛋白酶的专一性
3．立体异构特异性：一些酶仅能催化一种立体异
构体进行反应，或其催化的结果只产生一种立体异
构体，酶对立体异构物的选择性称为立体异构特异
性（stereospecificity）。
L-乳酸
D-乳酸
H
H
C
OH
生化第4章_酶
体内的物质代谢。
维生素分为脂溶性和水溶性两大类。脂溶性维生素在体内 可直接参与代谢的调节作用，而水溶性维生素是通过转变 成辅基对代谢起调节作用。
大多数辅酶的前体是水溶性 B 族维生素。辅酶I、辅酶II
９
3. 酶结构与功能特点
蛋白质的结构特点： 一级、二级、三级、四级结构
根据结构不同酶可分为：
３７
3.酶与底物结合形成中间络合物的方式（理论）
(1) 锁钥假说 (lock and key hypothesis)：
•
认为整个酶分子的天然构象具
有刚性结构，酶表面具有特定 的形状。酶与底物的结合如同
一把钥匙对一把锁一样。
(2) 诱导契合假说（induced–fit hypothesis):
•
认为酶表面并没有一种与底物
H2N C OH
CH2 NH2 OH
亲核性基团
酸碱性基团
16
酶催化反应举例
溶菌酶（lysozyme）降解细菌细胞壁多糖
溶菌酶是一种葡萄糖苷酶，水解NAG形成的β(1, 4)糖苷键
溶菌酶内部几乎都是非极性的，在分子表面有一较深的裂缝
其大小恰好容纳底物的 6 个单糖，是酶的活性部位．
酶的水解作用
31
(7) 核酸酶（催化核酸） (Ribozymes)
核酸酶是唯一的非蛋白酶, 是一类特殊 RNA，能催化 RNA 分子中的磷酸酯键的水解及其逆反应。
B
3'
B
3'
B
3'
B
3'
B
3'
P
5'
P
5'
P
生物化学：第四章 酶(6周1-2节)
第四章酶Enzymes本章主要内容（9学时）一．酶的概念（重点）二．维生素与辅酶（重点）三．酶促反应动力学（重点）四．酶的结构和催化作用机制（重点）五．酶的调控（重点）六．人工酶与酶工程(自学为主)一、酶的概念⏹生物机体的一切生理活动，都是由无数复杂的化学变化（反应）来实现的。
⏹生物体内进行的所有这些化学变化都在酶的催化下进行的。
⏹Much of the history of biochemistry is the history of enzyme research.一、酶的概念⏹In the late 1700s, biological catalysis was first recognized.⏹1897年，E. Büchner,首次从酵母细胞中提取出酶，实现无细胞生醇发酵。
一、酶的概念⏹1926年，James Sumner,结晶出第一个蛋白酶---脲酶。
⏹pepsin, trypsin, andother digestive enzymesAll enzymes are proteins.一、酶的概念⏹J. B. S. Haldane⏹A paper entitled “Enzymes”.weak bonding interactions between an enzyme and its substrate might be used to catalyze a reaction.一、酶的概念⏹1989年，推翻“酶都是蛋白质”这一传统概念。
⏹In 1982，Thomas Cech,RNA spliced itselfaccurately without anyprotein enzymes fromTetrahymena（四膜虫）.Most Enzymes Are Proteins.一、酶的概念酶是生物催化剂⏹生物催化剂（Biocatalysts）：活细胞产生的一类具有催化功能的生物分子。
生物化学第四章酶
⽣物化学第四章酶第四章酶酶是⼀类具有⾼效率、⾼度专⼀性、活性可调节的⾼分⼦⽣物催化剂。
1957巴斯德提出酒精发酵是酵母细胞活动的结果。
1 分⼦Glc→2分⼦⼄醇+2分⼦CO2 从Glc开始，经过12种酶催化，12步反应，⽣成⼄醇。
1897 Buchner兄弟证明发酵与细胞的活动⽆关，不含细胞的酵母汁也能进⾏⼄醇发酵。
1913 Michaelis和Menten提出⽶⽒学说—酶促动⼒学原理。
1926 Sumner⾸次从⼑⾖中提出脲酶结晶，并证明具有蛋⽩质性质。
1969 化学合成核糖核酸酶。
1967-1970 从E.coli中发现第I、第II类限制性核酸内切酶。
1986 Cech发现四膜⾍细胞⼤核期间26S rRNA前体具有⾃我剪接功能。
ribozyme ，deoxyribozymeE.coRI5’——GAA TTC——3’3’——CTTAAG——5’限制作⽤修饰作⽤5’——GAATTC——3’5’——GAATTC——3’3’——CTTAAG——5’ 3’——CTTAAG——5’第⼀节酶学概论⼀、酶的⽣物学意义⼤肠杆菌⽣命周期20分钟，⽣物体内化学反应变得容易和迅速进⾏的根本原因是体内普通存在⽣物催化剂—酶。
没有酶，⽣长、发育、运动等等⽣命活动就⽆法继续。
限制性核酸内切酶（限制-修饰）⼆、酶的概念及其作⽤特点1、酶是⼀种⽣物催化剂酶是⼀类具有⾼效率、⾼度专⼀性、活性可调节的⾼分⼦⽣物催化剂。
⽣物催化剂：酶(enzyme)，核（糖）酶(ribozyme)，脱氧核（糖）酶(deoxyribozyme)2、酶催化反应的特点（1）、催化效率⾼酶催化反应速度是相应的⽆催化反应的108-1020倍，并且⾄少⾼出⾮酶催化反应速度⼏个数量级。
（2）、专⼀性⾼酶对反应的底物和产物都有极⾼的专⼀性，⼏乎没有副反应发⽣。
（3）、反应条件温和（4）、活性可调节根据据⽣物体的需要，许多酶的活性可受多种调节机制的灵活调节，包括：别构调节、酶的共价修饰、酶的合成、活化与降解等。
第四章酶的归纳总结
“第四章酶”归纳总结第一节酶的分子结构和催化功能酶是一类由活细胞产生的，对其特异底物（反应物）具有高效催化作用的蛋白质，是生物催化剂中的一种类型。
生物催化剂酶＼核酶：具有催化作用的核糖核酸，主要以核酸为底物。
根据酶的组成特点辅酶、辅基——B族维生素的活性形式二、酶的活性中心必需基团：酶分子中氨基酸残基侧链具有不同的化学基团，其中一些与酶活性密切相关的化学基团。
酶的活性中心：一些必需基团在酶蛋白的一级结构上可能相距很远，但在空间结构上彼此靠近，组成具有特定空间结构的区域，能与底物特异的结合并将底物转为产物。
必需基团活性中心外的必需基团活性中心内的必需基团 结合基团：能与底物或辅酶结合形成酶复合物催化基因：参与催化化学反应完成的化学基因三、酶催化作用机制酶促反应的机制酶促反应的化学机制第二节 酶促反应的特性诱导契合学说：酶与底物相互接近时，其结构相互诱导、相互变形和相互适应， 进而相互结合而有利于反应的进行。
中间复合物学说：目前一般认为，酶催化某一反应时，首先在酶的活性中心 与底物结合生成酶－底物复合物，此复合物再进行分解而释放出酶，同时生成一种或数种产物。
邻近\定向效应 多元催化 表面效应：酶促反应在酶的疏水活性中心进行，防止水化膜的形成酶促反应的特性1、具有化学催化剂的特点4、特异性5、调节性2、酶促反应的条件温和：一般最佳反应条件；常温、37°C、pH近中性3、高效性——显著降低活化能C、对于可逆反应，只加快进程而不改变化学平衡常数B、只催化热力学允许的化学反应A、参与反应而无质量变化a、绝对特异性：酶只能作用于特定结构的底物分子，进行一种专一的反应，生成一种特定结构的产物c、立体异构特异性：当底物具有立体异构体时，仅用于底物的一种立体异构体b、相对特异性：酶作用于一类化合物或一种化学键d、酶含量的调节e、同工酶：c、共价修饰调节b、酶的别构调节：对酶催化活性a、酶原与酶原激活：生理意义机体的自我保护酶原被视为酶的贮存方式一种调节方式，即当一种同工酶受抑制或破坏时，其他同工酶仍起作用。
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练习题
称取25mg蛋白酶配成25mL溶液，取2mL溶液测得含 蛋白氮0.2mg，另取0.1mL溶液测定酶活力，结果每小
时可以水解酪蛋白产生1500μ g酪氨酸，假定1个酶活
力单位定义为每分钟产生1μ g酪氨酸，请计算： （1）酶溶液的蛋白浓度及比活力； （2）每克纯酶制剂的总蛋白量以及总活力。
答：
度与酶浓度成正比。
*关系式为：V = K3 [E] 0 [E]
三、温度对反应速度的影响
酶
2.0
最适温度
活 性
1.5
(optimum temperature)：
1.0
0.5
0
10 20 30 40 50 60
温度 ºC
四、 pH对反应速度的影响
最适pH (optimum pH)：
酶
活 性
胃蛋白酶
淀粉酶
（1）酶溶液的蛋白浓度： 0.2mg×6.25÷2mL=0.625mg/mL
酶溶液的比活力： 1500/60 U ÷（0.1mL×0.625mg/mL）=400 U/mg； （2）每克纯酶制剂的总蛋白量： 0.625mg/mL×1000mL=625mg；
（3）当[S]很高时，所有的酶均被底物所饱和，[S]>>Km 此时：V=Vmax
（三）、 Km的推导
V Vmax Vmax/2 Km
Vmax[S] Vmax ＝ 2 Km + [S]
[S]
Km＝ [S]
Km值等于酶促反应速度为最大反应速度一半时的底
物浓度，单位是mol/L。
（四）、 Km的意义 Km值的意义： 1、Km是酶的特征性常数之一，与酶的浓度无关； 2、Km可近似表示酶对底物的亲和力； 3、同一个酶对于不同底物有不同的Km值。
有机磷化合物对羟基酶的抑制
（二）、可逆性抑制作用
*概念：
以非共价键与酶或酶 - 底物复合物可逆性结合， 使酶的活性降低或丧失；抑制剂可用透析、超滤等方
法除去。
*类型：
竞争性抑制 非竞争性抑制 反竞争性抑制
1、竞争性抑制作用
特点：
*I与S结构类似，竞争酶的活性中心； *抑制程度取决于抑制剂与酶的相对亲和力及［S］； *动力学特点：Vmax不变，表观Km↑。
酶蛋白 (apoenzyme) 全酶 (holoenzyme) 决定反应的特异性 辅助因子(cofactor) 决定反应的种类与性质
金属离子
辅助因子(cofactor) 小分子有机化合物
辅助因子按其与酶蛋白结合的紧密程度分为
辅酶 (coenzyme): 结合疏松，可用透析或超滤的方法除去。
辅基 (prosthetic group): 与酶蛋结合紧密，不能用透析或超滤的方法除去。 酶蛋白和辅助因子单独存在均无催化活性，只有 结合为全酶才有催化活性。
1、当底物浓度较低时，反应速度与底物浓度成正比；反应为一级反应。
V
Vmax
[S] 2、随着底物浓度的增高，反应速度不再成正比例加速；反应为混合级反应。 V Vmax [S] 3、当底物浓度高达一定程度，反应速度不再增加，达最大速度；反应为 零级反应
（一）、米氏方程 1913年，德国化学家Michaelis和Menten根据中 间产物学说，推导出了著名公式米氏方程。
四、酶的分类
1、氧化还原酶类(oxidoreductases) 2、转移酶类 (transferases ) 3、水解酶类 (hydrolases) 4、裂解酶类 (lyases)
5、异构酶类( isomerases)
6、合成酶类 (ligases,synthetases)
五、酶的活性和活性单位
*影响因素包括有：
酶浓度、底物浓度、pH、温度、抑制剂、激活剂等。
一、底物浓度对反应速度的影响
研究前提
*单底物、单产物反应
*酶促反应速度一般在规定的反应条件下，用单位时间
内产物的生成量来表示 *反应速度取其初速度，即底物的消耗量很小（一般在 5﹪以内）时的反应速度 *底物浓度远远大于酶浓度
V
Vmax [S]
1、只能催化热力学上允许的反应，降低反应的活化能 2、不改变化学反应平衡常数 3、反应前后酶没有质和量的改变
（二）、酶作为生物催化剂的特点
1、高效性
*酶的催化效率通常比非催化反应高 108 ～ 1020 倍，比一
般催化剂高107～1013倍。
*酶加速反应的机理是降低反应的活化能。
活化能(activation energy) ： 底物分子从初态转变到活化态所需的能量。
（五）、 Km和Vmax的测定
双倒数作图法，又称为林-贝氏(Lineweaver- Burk)作图法
Vmax[S] V= Km+[S] 两边同时取倒数
1/V
1/Vmax
1/V=
Km
Vmax 1/[S] + 1/Vmax
-1/Km
1/[S]
（林－贝氏方程）
二、酶浓度对反应速度的影响
V
* 当 [S] ＞＞ [E] ， 反应 速
第四章
酶
Enzyme
酶的概念
目前将生物催化剂（biocatalyst）分为两类： *酶（ Enzyme）： *核酶（ Ribozyme ）：RNA或DNA
本章主要内容：
▪第一节、酶通论
▪第二节、酶促反应动力学 ▪第三节、酶促反应的机理 ▪第四节、酶的调节 ▪第五节、维生素与辅酶
第一节、酶通论
General Disscusion of Enzyme
一、酶的研究历史
* 公元前两千多年，我国已有酿酒记载。 * 1857年 Pasteur提出酒精发酵是酵母细胞活动 的结果。 * 1897年 Buchner兄弟证明不含细胞的酵母汁也 能进行乙醇发酵。
*1926年 Sumner首次从刀豆中提出脲酶结晶。 *1930年 Northrop等得到了胃蛋白酶、胰蛋白酶和胰 凝乳蛋白酶的结晶。
2、非竞争性抑制
特点：
*抑制剂与酶活性中心外的必需基团结合；
*抑制程度取决于［I］； *动力学特点：Vmax↓，表观Km不变。
3、反竞争性抑制
特点：
*抑制剂只与ES结合；
*抑制程度取决与［I］及［S］； *动力学特点：Vmax↓，表观Km↓。
各种可逆性抑制作用的比较
作用特征 与I结合的组分
V=
Vmax [S] Km + [S]
（二）、米氏方程式的推导 酶促反应模式——中间产物学说
k1 k3
E+S
k2
ES
E+P
得出：
V=
Vmax [S] Km + [S]
Vmax [S]
（1）当[S]很低时， Km>>[S] ，此时： V ＝
Km
（2）当[S]较高时，此时： V=
Vmax [S] Km + [S]
练习题
对于一个遵循米氏动力学的反应而言，当酶促反应 的速度为Vmax的80%时， [S]与Km之间关系如何？
答： 根据米氏方程：V= Vmax [S]/（Km+[S]）得：
V/Vmax =
[S]/（Km+[S]）
依题意得；V/Vmax=80% 故：[S]/（Km+[S]）=80% 得出：[S]=4Km
*举例：有机磷化合物 羟基酶
解毒 -- -- -- 解磷定(PAM)
重金属离子及砷化合物 巯基酶
解毒 -- -- -- 二巯基丙醇(BAL)
RO P
X + E OH
RO P
O E
+ HX 酸
O R'O 有机磷化合物 羟基酶
+
O R'O 磷酰化酶 CHNOH
N
CH3 解磷定
+
N CH3
E OH O OR' P CHNO OR
+
CH3CCOOH NADH O
H
+
3、反应条件温和
*酶促反应一般在常温、常压、中性pH 条件下进行 *强酸、强碱、高温等条件下，将引起酶的失活
4、酶的催化活性可调节控制
*对酶生成与降解量的调节 *对酶活性的调节
三、 酶的分子组成
*单纯酶 (simple enzyme)
*结合酶 (conjugated enzyme)
能
量
一般催化 剂催 化反应的活 化能
非催化反应活化能
酶促反应 活化能
底物
反应总能量改变
产物 反 应 过 程
酶促反应活化能的改变
2、专一性(specificity) 绝对专一性(absolute specificity) ：
相对专一性(relative specificity) ：
立体异构专一性(stereo specificity)：
举例
1、丙二酸对琥珀酸脱氢酶的抑制
琥珀酸脱氢酶 琥珀酸 延胡索酸
FAD
FADH2
COOH CH2 C H2 COOH 琥珀酸
COOH CH2 COOH 丙二酸
2、磺胺药对细菌FH2合成酶的抑制
Glu + H2N COOH PAB A + 二氢蝶呤
FH2合成酶
FH 2
FH2还原酶
FH 4
氨甲蝶呤 H2N 磺胺药 SO2NHR
Kat和IU的换算关系：
1 Kat=6×107 IU，
1 IU =16.67n Kat
(3)比活力（specific activity） *酶的比活力（比活性）：每单位（一般是mg）蛋白质中的 酶活力单位数（酶单位/mg蛋白）。
*对同一种酶来讲，比活力愈高则表示酶的纯度越高（含杂
质越少）。
比活力是评价酶纯度高低的一个指标。