HIV-1中和抗体检测方法的建立

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HIV抗体检测实验操作规程

HIV抗体检测实验操作规程

HIV抗体检测实验操作规程
1.检测试剂:初筛用的HIV抗体检测试剂,必须是HIV-1/2混合型,经卫生部批
准或注册,经过批检合格,并在有效期内。

常用的检测方法有固相酶联免疫吸附实验,颗粒凝集和其他快速诊断等方法。

2.检测要点
严格按照试剂说明书操作,不得擅自更改。

注意防止交叉感染。

严格遵守实验室操作规程。

1.初筛检测程序
(1)血液标本验收合格后,用初筛检测试剂进行检测,如呈阴性反应,则做
HIV抗体阴性报告。

(2)初筛检测结果呈阳性反应的标本,需进行重复检测。

复检时用原有试剂
和不同原理的另外一种试剂或不同厂家的初筛检测试剂复检。

(3)如两种试剂复检均呈阴性反应,则作HIV抗体阴性报告;如均呈阳性反
应,或有一份阳性,该标本需送上级实验室加以进一步证实。

送检时应准确填报复检单,重新抽血连同原血专人送省疾控做HIV-Ab确证实验。

编写:审核:批准:。

爱滋检测方法和步骤

爱滋检测方法和步骤
试剂组成:
微孔板1包8* 12T
酶标抗原1瓶14ml
阳性对照1瓶1 ml
阴性对照1瓶1 ml
洗涤液2瓶25 ml
显色剂A 1瓶7 ml
显色剂B 1瓶7 ml
终止液1瓶7 ml
说明书1份
自封袋1个
封板膜3张
样品的采集和保存:
1.采集静脉的血清血浆样本应在无菌条件下保存,并避免样品溶血及反复冻溶。
2.血清和血浆样品收集后如果无法在当天检测,样品须在(2-8℃)保存;如果大于7天则需冷冻保存。
辽宁省丹东市
传染病医院检验科
作业指导书
第十七节人类免疫缺陷病毒标准操作规程
文件编号:SH-SOP-017
版本:2006-07
生效日期:2006-07-01
珠海丽珠试剂(双抗原夹心酶联免疫法)检测HIV抗体
实验原理
本品用钝化基因工程人类免疫缺陷病毒Ⅰ型和Ⅱ型抗原宝贝的微孔板和酶标记的HIV-1/HIV-2抗原及其它试剂组成,应用双抗原夹心法原理检测人血清或血浆中HIV-1/HIV-2抗体,适用于献血员筛查及临床HIV抗体检测。
版本:2006-07
生效日期:2006-07-01
9.显色:每孔加入显色剂A B液各50vl,轻轻震荡混匀。37±1℃避光显色15±1分钟。
10.测定:每孔加终止液50vl,轻轻震荡混匀。设定酶标仪波长于450nm处。测定各孔A值。
结果判定:1.阴性对照的正常范围:正常情况下,阴性对照孔A值≤0.10。
4.加样时必须用加样器加,并经常校对加样器的准确性。
5.洗涤时各空均需加满洗液,防止空口内有游离酶不能洗净。使用洗扳机洗涤应设定30-60秒浸泡时间。
6. HIV抗体检测结果的判定必须以酶标仪读数为准。用双波长检测时,参考波长可用600-650nm。

HIV初筛实验室标准操作规程

HIV初筛实验室标准操作规程

HIV初筛实验室标准操作规程人类免疫缺陷病毒(HIV)1+2型抗体酶联免疫原理和方法(上海科华生物)原理:用HIV-1+2型抗原包被酶联板。

待检血清或血浆中的抗-HIV抗体与包被抗原反应,再与酶标HIV-1+2型抗原结合,形成抗原-抗体-酶标抗原复合物。

加底物(TMB)显色,在酶标仪上测定后根据OD值判定有无HIV抗体的存在。

操作步骤:1、取出HIV抗原包被板。

每次试验设空白对照1孔,阴性对照各1孔,阳性对照各3孔(其中阳性对照1两孔,阳性对照2一孔),质控一孔。

分别加入HIV阴、阳性对照质控血清各100微升,其余孔加入待检样本各100微升。

贴上封口胶,置37℃温育60分钟。

2、将浓缩洗液用纯化水25倍稀释后洗涤用。

3、弃去各孔中样品、拍干。

每孔加满洗液,静置数秒后弃去,如此重复洗5次,拍干。

4、每孔加入酶标抗原工作液100微升,贴上封口胶。

37℃温育30分钟。

5、弃去各孔中酶液,用洗液反复洗涤5次(操作同步骤3)。

6、每孔加入底物液A50微升,再加入底物液B50微升,轻拍混匀,置37℃避光显色30分钟。

7、显色完毕后,每孔加入终止液50微升,轻拍混匀,置酶标仪450nm波长处测定OD值(参考波长为630nm)。

结果判定:阴、阳性对照和被检样本的OD值减去空白对照OD值即为计算值。

2、若阴性对照OD均值小于0.02按0.02计算。

3、临界值(cut off 值)的设定:cutoff值= PC x×10%(若PC x>=2.5按2.5算)4、被检样本的OD值≥临界值应判为HIV抗体阳性反应,<临界值为阴性反应。

检测样本的OD值≥临界值判为HIV抗体阳性,应重新取样双孔复试,复试阳性者应按照“全国HIV检测管理规范”送“HIV确认实验室”进行确认实验。

注意事项:1、本试剂的使用单位必须是当地卫生行政部门批准的HIV初筛实验室。

2、整个HIV检测必须符合《全国艾滋病检测工作规范》严格防止交叉感染。

中和抗体的检测方法和原理

中和抗体的检测方法和原理

中和抗体的检测方法和原理
中和抗体是指可以结合病原体并防止其进入宿主细胞或抑制其复
制的抗体。

中和抗体检测主要通过体外细胞培养或动物实验的方式进行。

1. 细胞培养法检测中和抗体
细胞培养法检测中和抗体主要包括细胞防御性中和试验、对中和
抗体的小胶片半微量滴度试验和复合病原体细胞培养中和试验。

其中,细胞防御性中和试验是最常用的方法。

该方法使用细胞系于体外培养,将病原体与中和抗体一起加入培养基内,观察病原体在细胞内是否被
清除,从而判断中和抗体的效力。

2. 动物实验法检测中和抗体
动物实验法检测中和抗体是通过注射病原体,将中和抗体加入动
物体内,观察病原体在动物体内的复制能力,从而判断中和抗体的效力。

常用的动物实验包括小鼠腹腔注射法、兔子狂犬病中和抗体测定
法等。

以上方法主要依靠病原体的复制和细胞的防御能力进行判断,从
而确定中和抗体的效力。

该方法有很高的可靠性和准确性,可广泛应
用于病毒、细菌和其他病原体等的检测中。

HIV抗体检测的标准操作程序(ELISA法和快速法)

HIV抗体检测的标准操作程序(ELISA法和快速法)

HIV测定(ELISA法)标准操作规程1、检验目的应用双抗原夹心酶联免疫法原理(ELISA)定性检测人血清、血浆标本中的HIV(1+2)型抗体的测定,用于HIV感染的辅助诊断,抗HIV药物治疗的效果的监测。

2、原理采用夹心ELISA方法检测血清或血浆标本中人类免疫缺陷病毒HIV(1+2)型抗体,预包被高纯度基因重组HIV(1+2)型抗原,可与标本中的抗-HIV抗体反应,加入HRP标记HIV (1+2)型抗体抗原结合,形成抗原-抗体-酶标抗原复合物,然后加入TMB底物产生显色反应。

通过酶标仪检测吸光度(OD值),根据OD值判断HIV抗体的存在与否。

3、性能参数灵敏度高(0.5ng/ml)4、标本要求(1)标本类型:血清,血浆。

(2)标本采集:见标本采集手册(3)标本储存和运输:室温放置不超过8小时,2-8℃不超过72小时,-20℃可长期保存,应避免反复冻融(4)标本拒收状态:细菌污染,严重溶血或脂血标本不能作测定。

本文来自检验地带网5、容器和添加剂类型6、试剂(1)试剂名称:人类免疫缺陷病毒HIV(1+2)型抗体诊断试剂盒。

(2)试剂生产厂家:上海科华生物工程股份有限公司(3)包装规格:96T/Kit(4)试剂盒组成:①、HIV酶标板;②、HIV酶标试剂;③、HIV(1+2)型阳性及阴性对照血清;④、显色剂A液和B液;⑤、此外还有浓缩洗涤液、终止液、自封袋、封板膜、说明书等。

7、仪器设备:酶标仪:ZS板式,北京普朗生物技术有限公司,每年由计量单位进行一次校准。

洗板机:DNM-9620型,北京普朗生物技术有限公司,每年由国家计量单位进行一次校准。

移液器:上海求精,每年由国家计量单位进行一次校准。

8、校准程序9、操作步骤①、配液:将50ml浓缩洗涤液用蒸馏水或去离子水25倍稀释至1000ml备用。

②、编号:将样品对应微孔按序编号,每板设阴性对照2孔、阳性对照3孔,空白对照2孔。

③、加样:分别在相应孔加入待检标本、阴性、阳性对照100μl,用封板膜封板后置37℃温育60min。

病毒中和试验以HIV为例介绍

病毒中和试验以HIV为例介绍

病毒中和试验1.介绍病毒不同亚型特异的抗体能够结合病毒表面蛋白特定的表位,从而中和病毒的感染能力。

经典的中和作用指抗体结合到病毒表面从而阻止其感染敏感细胞。

病毒中和试验的确切机制还不是很清楚。

中和作用不是简单地抗体包被病毒颗粒,或者是阻断对敏感细胞的吸附。

阻断作用可发生在吸附和侵入之后的任何阶段。

对流感病毒中和试验显示:特定的单克隆抗体阻断作用并不是发生在吸附,侵入,脱壳或者病毒基因进入细胞核的过程,这一现象充分说明了病毒中和所用的复杂性。

1.1抗体中和作用遵循的一些原则最直接检测和定量中和抗体的方法是通过测定病毒对敏感细胞感染力的减少。

感染力的抑制可以粗略的分为“quantal”试验(即全或无,可翻译为定性实验)和定量试验。

quantal实验判断结果为感染是否发生。

相对于测定有感染力的病毒颗粒数目的定量试验,quantal实验的结果是感染力的“全或无”,结果没有定量实验结果准确。

采用终点法有一系列的方法用来衡量病毒感染敏感细胞。

感染的指标可通过以下:CPE,病毒蛋白的免疫印迹和病毒导致细胞死亡的一些非特异的化学方法如[3H]胸腺嘧啶的合并或者四甲基偶氮唑盐导致的颜色改变。

在定性实验中,每个病毒颗粒在敏感细胞中增殖,形成局部灶性病变.可通过培养几天后出现CPE 来观察。

经典的定量试验是空斑形成实验,适当的细胞贴壁后,病毒吸附,软琼脂或琼脂覆盖(使病毒的增殖限制在最初感染的细胞的周围。

)为了使形成的蚀斑更明显易于肉眼观察,单层细胞通常需要染色如中性红,活细胞能够被染色,而蚀斑在红色背景下很明显。

一些疱疹病毒和痘病毒可以在液体环境中的单层细胞中形成蚀斑,因为大部分病毒是在细胞内的,蚀斑的形成是病毒通过细胞间接触感染临近细胞形成的。

这里以介绍HIV——艾滋病的致病原为例介绍中和试验的方法。

这种方法也可适用于其他的病毒。

2.材料,细胞系,和培养基CD4+T细胞,如H9,MT4或者C8166,采用含10%的胎牛血清的RPMI1640。

假病毒中和抗体检测方法及实验步骤

假病毒中和抗体检测方法及实验步骤

假病毒中和抗体检测方法及实验步骤假病毒中和抗体检测是一种用于识别和定量特定的抗原或免疫球蛋白的免疫学组化技术。

它可以帮助识别和定量特定的蛋白,用于诊断各种不同的感染、免疫性或遗传性问题。

检测中和抗体的方法:在很多早期中和抗体的研究中使用实验室分离毒株、T细胞系和来自感染者的血清。

多数情况下,使用T细胞适应病毒和T细胞系比使用原代分离病毒和PBMC更容易观察到病毒中和作用。

重要的是,要复制体内的情况,有必要使用同源的原始病毒分离株和正常PBMC来测量中和抗体。

这些检测方法中的成分使这方法最接近开展具临床意义的体内HIV中和潜能的检测。

目前尚未正式定义原始分离株,但它通常指PBMC中复制的不超过3代,且通常自最初分离出不超过2个月的病毒。

一些研究者建议使用未刺激的PBMC进行中和实验,因为体内细胞可能是未活化的。

鉴于未活化的细胞可以表达不同的病毒辅助受体,此种检测方法有待进一步研究。

近来的检测中多采用重组病毒技术和单周期病毒检测法,能检测到更高水平的中和抗体。

但这些分析的临床意义有待评估。

例如,最近研究表明HIV包膜假病毒与有同样的包膜糖蛋白的感染性HIV分子表现出相似的中和敏感性。

然而,在PBMC中培养感染性分子克隆的中和敏感性却下降,此结果可能表明,PBMC中培养的病毒表面的包膜蛋白增加。

此观察表明,这些较快速的中和抗体检测明显具有临床意义。

尽管如此,这些区别是定量的而不是定性的,包膜假病毒与HIV-1原始分离株的中和敏感性相似。

重要的是,随着疾病进展,中和抗体可以被增强抗体所取代。

最近,一些病毒和方法已被推荐用来检测中和抗体反应,尤其是由疫苗诱导的中和抗体。

假病毒中和抗体检测的步骤如下:1.将样本中的血浆或血小板进行分裂;2.将样本中得到的血小板与所需要测量的特异性IgG/IgM/IgA连合;3.添加适当量的真核表达载体(例如pCMV-HA-VLP)并将其加到另一个板上;4.在冷冻条件下将真核表达载体/特异性IgG/IgM/IgA复合物固定在另一个板上。

新型HIV-1核酸定量内标构建及验证

新型HIV-1核酸定量内标构建及验证
苷 酸 ,经 G a t e wa y 重 组 得 到 含 突变 碱 基 的p NL 4 3 一 A E N V - L UC — A T T R 表 达 载 体 , 该 载 体 与 水 泡 性 口膜 炎 病毒 ( VS V)质 粒 共 转 染 2 9 3 细胞4 8 h 后 收 集 上 清 中HI V - 1 内标 假 病 毒 颗 粒 , 检测 p 2 4 抗 原 含 量 , 定 量假
b a s e b y Ga t e wa y r e c o mb i n a n t t e c h n o l o g y . T h i s v e c t o r a n d VS V p l a s mi d we r e c o t r a n s f e c t e d i n t o 2 9 3 T
P e r f o r m a n c e , B e o ' i n g Y o u " a n Ho s p i t a l , C a p i t a l Me d i c a l U n i v e r s i t y , B e o ' i n g1 0 0 0 6 9 , C h i n a
s t a n d a r d b a s e d o n v i r u s p a r t i c l e s . Me t h o d s p 2 4 r e g i o n wa s mu t a t e d wi t h o u t c h a n g i n g p 2 4 c o n s e r v a t i v e
段:获得仅具有1 次感 染 性 的H I V - 1 假病毒颗粒 ( 3 . 6 1×1 0 I U / m1 ) ;p 2 4 抗 原检 测 含 量 为 2 8 3 . 2 p g / ml ;

HIV-1的中和抗体及其用途[发明专利]

HIV-1的中和抗体及其用途[发明专利]

专利名称:HIV-1的中和抗体及其用途
专利类型:发明专利
发明人:P·D·克翁,G·J·纳贝尔,R·S·鲁迪塞尔,J·马斯科拉,M·康纳斯,I·乔治夫,朱江,Y·D·匡,周同庆,杨永平,B·张,G-Y·
窗,伍雪玲,杨志勇,W·史
申请号:CN201810445511.2
申请日:20121210
公开号:CN108676091B
公开日:
20220401
专利内容由知识产权出版社提供
摘要:本发明公开了特异性结合HIV‑1gp120的单克隆中和抗体及这些抗体的抗原结合片段。

还提供了编码这些抗体的核酸、载体和宿主细胞。

公开了使用这些抗体检测HIV的方法。

此外,公开了这些抗体、抗原结合片段、核酸和载体用于预防和/或治疗HIV感染的用途。

申请人:美国政府(由卫生和人类服务部的部长所代表)
地址:美国马里兰
国籍:US
代理机构:永新专利商标代理有限公司
代理人:区斌
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HIV-1复制中间产物检测方法的建立及在抗HIV药物研究中的初步应用的开题报告

HIV-1复制中间产物检测方法的建立及在抗HIV药物研究中的初步应用的开题报告

HIV-1复制中间产物检测方法的建立及在抗HIV药物研究中的初步应用的开题报告一、课题背景及意义HIV-1是引起艾滋病的主要病毒,随着抗HIV药物的使用,HIV-1耐药性的出现已经成为制约抗HIV药物疗效和研究的主要挑战之一。

但是,由于HIV-1复制过程的复杂性和变异性,对HIV-1耐药性的检测和评估仍存在很大的困难和挑战。

HIV-1复制中间产物是HIV-1生命周期中的重要环节,同时也是筛选和评估抗HIV药物的关键指标。

因此,建立一种可靠的HIV-1复制中间产物检测方法,不仅可以更好地理解HIV-1的生命周期和复制机制,还可以为抗HIV药物的研究和评估提供重要的依据和参考。

二、研究内容及方法本研究拟建立一种基于PCR扩增技术的HIV-1复制中间产物检测方法,并初步应用该方法在抗HIV药物研究中。

(一)HIV-1复制中间产物检测方法的建立1. 选择PCR扩增适当的区域;2. 设计PCR扩增引物;3. 优化PCR反应条件;4. 确定PCR扩增产物的长度和鉴定PCR扩增产物;5. 建立检测标准。

(二)HIV-1复制中间产物检测方法在抗HIV药物研究中的应用使用建立的方法检测HIV-1感染细胞系在不同抗HIV药物处理下的复制中间产物,并对这些产物进行定量分析和比较,评估不同抗HIV药物的疗效和耐药性。

三、预期成果及意义1. 建立一种基于PCR扩增技术的HIV-1复制中间产物检测方法;2. 实现对HIV-1复制中间产物的可靠检测和定量分析;3. 开发新的抗HIV药物筛选和评估方法,为抗HIV药物的研究和开发提供重要参考。

4. 旨在为国内外在艾滋病和病毒学研究领域提供最新的技术革新,为人类抗击艾滋病的贡献研究力量。

HIV-1 Tat新型免疫原的构建及鉴定的开题报告

HIV-1 Tat新型免疫原的构建及鉴定的开题报告

HIV-1 Tat新型免疫原的构建及鉴定的开题报告一、选题背景和意义艾滋病病毒(HIV)是导致艾滋病的病原体,目前已知有两种病毒亚型:HIV-1和HIV-2。

其中,HIV-1是全球范围内最广泛传播的亚型,主要通过血液、性行为以及母婴传播等途径传播。

HIV-1 Tat(病毒转录激活转录因子)是HIV-1病毒的一个重要蛋白质,具有转录激活和增加HIV-1基因表达的作用。

因此,HIV-1 Tat蛋白是HIV-1病毒感染过程中的一个重要靶标。

目前,HIV-1病毒的传播已经成为世界性的公共卫生问题,如何研究HIV-1病毒及其蛋白质在病毒感染和发展过程中的作用,对于制定有效的预防和治疗策略具有重要意义。

因此,本研究旨在构建一种新型的HIV-1 Tat蛋白免疫原,并对其进行鉴定和评估,以期为HIV-1病毒的研究和防治提供新的思路和方法。

二、研究内容和方法1. 构建HIV-1 Tat蛋白的表达载体本研究利用分子生物学技术构建HIV-1 Tat蛋白的表达载体。

首先,从HIV-1病毒中扩增Tat基因并进行限制性酶切,将其插入到目的表达载体中,并利用PCR和DNA测序技术进行鉴定。

2. 表达HIV-1 Tat蛋白并制备多克隆抗体通过表达载体转染细胞,利用蛋白质纯化技术制备HIV-1 Tat蛋白,并通过小动物免疫技术制备Tat蛋白的多克隆抗体。

3. 鉴定HIV-1 Tat蛋白的免疫原性质利用Western blot和ELISA技术对构建的HIV-1 Tat蛋白进行鉴定。

通过检测抗体对HIV-1 Tat蛋白的绑定能力来评估其免疫原性质。

三、预期结果和意义通过本研究的实验,我们将获得一种新型的HIV-1 Tat蛋白免疫原,并鉴定其免疫原性质。

这将为HIV-1病毒研究和防治提供新的思路和方法,为研制更有效的艾滋病疫苗和药物提供一定的参考价值。

同时,本研究还为其他病原体蛋白质的构建和鉴定提供了一定的方法和经验。

免疫荧光检测HIV-1抗体方法的建立和应用

免疫荧光检测HIV-1抗体方法的建立和应用

免疫荧光检测HIV-1抗体方法的建立和应用
李敬云;王宏霞;鲍作义
【期刊名称】《中国病毒学》
【年(卷),期】1997(000)004
【摘要】无
【总页数】1页(P371)
【作者】李敬云;王宏霞;鲍作义
【作者单位】无
【正文语种】中文
【相关文献】
1.猪乙脑病毒IgG抗体间接免疫荧光检测方法的建立与初步应用 [J], 朱兆奎;张曦;滕峥;赵百慧;李燕婷;袁正宏;卢伟
2.禽波氏杆菌免疫荧光检测和抗体检测ELISA方法的建立与应用 [J], 杨春晓;王小娥;刘冠华;肖海君;崔金生;朱瑞良
3.抗鹅细小病毒单克隆抗体的制备及其免疫荧光检测方法的建立 [J], 郭卉;涂飞;吕亚楠;史荣华;金文杰;邵红霞;钱琨;秦爱建
4.PEDVN蛋白单克隆抗体的制备及间接免疫荧光检测方法的建立 [J], 邝燕齐;莫梅君;何红玲;周金柱;周如月;郭霄峰
5.家蚕微孢子虫抗体免疫荧光检测方法的建立及应用 [J], 李艳红;谢俪;潘国庆;吴正理;庞敏;周泽扬
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HIV抗体检测(胶体硒法)操作程序

HIV抗体检测(胶体硒法)操作程序

HIV抗体检测(胶体硒法)标准操作程序1.目的:用于体外、肉眼观察、定性的免疫分析,监测血清或血浆中的HIV-1和HIV-2抗体,用于帮助检测受感染个体的HIV-1和HIV-2抗体。

本品检测阳性者,需进一步确证。

2.原理:利用免疫层析法原理,加样本入反应条,样品迁移通过结合物包被处,与硒胶体-抗原结合物混合重组结合,此混合物继续迁移通过固相包被的合成肽和重组抗原的病人结果窗口。

若样品含HIV-1/2抗体,抗体将会与硒胶体-抗原结合,并在病人窗口处被固相包被的合成肽和重组抗原所捕捉规定,形成一条红线;若样品不含HIV-1/2抗体,抗体将会通过病人窗口而不与被固相包被的合成肽和重组抗原结合,没有一条红线形成。

反应条带中含质控条带。

3.标本要求:3.1标本类型:血清3.2标本采集:见标本采集手册3.3标本储存和运输:新鲜血清2~8℃贮存时间不超过72小时3.4标本拒收状态:细菌污染,严重溶血或脂血标本不能作测定。

4.试剂:4.1试剂名称:HIV-1/2抗体诊断试剂盒。

4.2试剂生产厂家:Japan .Matsudo-shi, Chiba-ken DainabotCo .Ltd4.3包装规格:100个测试/包装袋;10个测试/板4.4试剂盒组成:雅培DETERMINE HIV-1/2 血清/血浆分析试剂盒(List No7D23-18)100个测试雅培DETERMINE HIV-1/2测试板,10板合成肽和重组抗原包被5.校准程序:(送黑龙江省质量技术监督局校准)6.操作步骤:HIV-1/2抗体诊断试剂盒操作流程7.质量控制:阴性对照显示为阴性;阳性对照显示为阳性。

8.干扰和交叉反应:其他体液或混合样品可干扰反应,不可用EDTA 抗凝的全血血浆。

9.生物参考区间:正常人为阴性10.患者检验结果的可报告区间阴性;阳性11.临床意义:监测血清或血浆中的HIV-1和HIV-2抗体,用于帮助检测受感染个体的HIV-1和HIV-2抗体。

HIV抗体检测试剂盒-工艺流程图

HIV抗体检测试剂盒-工艺流程图

HIV(1+2型)抗体检测试剂盒(免疫印迹法)生产工艺流程1、HIV抗体检测试剂盒(免疫印迹法)工艺流程图检验电泳胶配制转膜HIV膜条制备HIV膜条分装HIV反应膜条检验强阳性对照配制强阳性对照分装检验弱阳性对照配制弱阳性对照分装质控品检验阴性对照配制阴性对照分装浓缩样品稀释缓冲液10×配制浓缩样品稀释缓冲液10×分装浓缩洗膜缓冲液10×配制浓缩洗膜缓冲液10×分装酶结合物检验酶结合物分装显色试剂底物液底物液分装封闭粉封闭粉分装HIV反应膜条质控品试剂盒组装成品入库显色试剂成品检验孵育板2、各工艺的步骤和要求目录2.1 HIV反应膜条的制备2.1.1 电泳胶的制备2.1.1.1 玻璃夹板固定2.1.1.2 2%琼脂糖封边2.1.1.3 配制4%-20%聚丙烯酰胺梯度分离胶2.1.1.3.1 20ml 4%分离胶配制2.1.1.3.2 20ml 20%分离胶配制2.1.1.3.3 梯度分离胶灌胶2.1.1.4 15ml 5%积层胶制备2.1.2 蛋白电泳分离2.1.2.1 样品的制备2.1.2.2 上样2.1.2.3 电泳2.1.3 半干转膜2.1.3.1 准备滤纸和NC膜2.1.3.2 装备转移三明治2.1.3.3 转膜2.1.4 封闭2.2 质控品2.2.1 强阳性对照的配制2.2.2 弱阳性对照的配制2.2.3 阴性对照的配制2.3 显色试剂的配制2.3.1 浓缩样品稀释缓冲液10×的配制2.3.2 浓缩洗膜缓冲液 20×的配制2.3.3 酶结合物的配制2.3.4 底物液2.3.5 封闭粉2.3.6显色具体操作步骤2.3.6.1 试剂准备2.3.6.1.1稀释洗膜缓冲液2.3.6.1.2封闭缓冲液2.3.6.1.3酶结合物工作溶液2.3.6.1.4 底物液(已配制好)2.3.6.2 具体步骤2.1 HIV反应膜条的制备2.1.1 电泳胶的制备2.1.1.1 玻璃夹板固定取洁净的透明玻璃板两块(一大一小),将两个相同的透明塑料片放在小玻璃板的长边沿的两边,再将大玻璃板附上,用4个黑色夹子固定比例夹板(如图所示),放入烘箱80℃预热7min左右。

中和抗体实验原理和步骤

中和抗体实验原理和步骤

中和抗体实验原理和步骤中和抗体实验(neutralization assay)是一种用于检测抗体功能的实验,目的是评估抗体是否能够阻止病毒或其他病原体感染细胞。

这种实验常用于疫苗研发和抗病毒药物研究,帮助确认抗体对特定病原体的中和能力。

实验原理中和抗体通过与病原体的抗原位点结合,阻止其与宿主细胞受体的结合,从而抑制病原体的感染。

中和抗体实验通常通过以下步骤进行:1.抗体与病原体的结合:将抗体(通常是从血清中提取)与病毒或其他病原体混合,抗体会与病原体表面的抗原结合。

2.感染细胞:将混合物与易感宿主细胞(如人类或动物细胞系)共培养,病原体如果未被抗体中和,将能够感染宿主细胞。

3.检测感染效果:通过检测细胞感染的标志,如病毒复制、病变(细胞病变效应,CPE)等,来评估抗体是否能够阻止病原体的感染。

如果抗体有效,则宿主细胞不会表现出感染迹象。

实验步骤以下是中和抗体实验的基本步骤:1.准备样品o收集含有中和抗体的血清样品,通常来自疫苗接种者或康复患者。

o制备病原体,如病毒株,通常需要标化的浓度。

2.抗体和病毒的孵育o将不同稀释倍数的抗体样品与恒定量的病毒混合,通常在37℃下孵育一段时间(例如1小时),使抗体与病毒结合。

3.加入靶细胞o将抗体-病毒混合物接种到培养好的易感细胞中,如Vero细胞或其他相关细胞系,孵育24-72小时。

4.观察和检测感染o通过显微镜观察细胞是否出现病变,或使用定量PCR(qPCR)、ELISA等方法检测病毒复制情况。

o常见的观察指标包括:▪细胞病变效应(CPE):被病毒感染的细胞会变圆、死亡,形成细胞病变区。

▪病毒滴度:通过间接方法测量未被中和的病毒数量。

5.数据分析o计算中和抗体的效价(neutralizing titer),通常是以能够抑制50%病毒感染所需的抗体稀释倍数(IC50或NT50)为标准。

o使用对照组(不加抗体)和实验组的结果对比来分析抗体的中和效应。

应用•疫苗评估:用于评估疫苗诱导的抗体是否能够有效中和病毒,确保疫苗的保护效力。

建立反向PCR检测HIV-1整合位点的方法

建立反向PCR检测HIV-1整合位点的方法

建立反向PCR检测HIV-1整合位点的方法
焦艳梅;画伟;李娟;刘志英;陈德喜;李在村;张彤;吴昊
【期刊名称】《首都医科大学学报》
【年(卷),期】2009(30)5
【摘要】@@ 高效抗反转录病毒治疗(highly active anti-retmviral therapy,HAART)可降低艾滋病的发病率和死亡率,使感染者血浆中HIV-1 RNA降至常规方法检测不到的水平[1-2],但用敏感度高的方法仍可检测到病毒基因和低水平的病毒复制,这是因为存在HIV-1潜伏库,含有整合HIV DNA的静止性CD4+T 细胞是最主要的HIV-1潜伏库[3-5].
【总页数】4页(P635-638)
【作者】焦艳梅;画伟;李娟;刘志英;陈德喜;李在村;张彤;吴昊
【作者单位】首都医科大学附属北京佑安医院;首都医科大学附属北京佑安医院;首都医科大学附属北京佑安医院;首都医科大学附属北京佑安医院;首都医科大学附属北京佑安医院;首都医科大学附属北京佑安医院;首都医科大学附属北京佑安医院;首都医科大学附属北京佑安医院
【正文语种】中文
【中图分类】R5
【相关文献】
1.利用连接介导PCR检测外源基因整合位点体系的建立 [J], 刘娣;李斌;张冬杰
2.对定量检测整合HIV-1 DNA的PCR方法的评价 [J], KumarR;万延民;张春涛
3.TaqMan荧光定量PCR检测HIV-1 DNA方法的建立及初步应用 [J], 韩根鹏;熊勇;高雨;杨小霞
4.应用定量PCR技术检测HIV-1逆转录环节的方法的建立 [J], 杨颖;陈勍;郭颖
5.Alu-LTR PCR检测整合型HIV-1实验方法的优化 [J], 李娟;焦艳梅;画伟;张彤;吴昊;高艳青
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针管残留血HIV-1抗体检测方法的建立及在静脉吸毒人群中HIV感染现况的应用

针管残留血HIV-1抗体检测方法的建立及在静脉吸毒人群中HIV感染现况的应用

针管残留血HIV-1抗体检测方法的建立及在静脉吸毒人群中HIV感染现况的应用目的:通过运用微量明胶颗粒凝集(Micro Liquid-Particle Agglutinate, ML-PA)试验对静脉注射吸毒人员针管残留血中的HIV-1抗体进行检测,建立检测针管残留血中HIV-1抗体的微量明胶颗粒凝集试验法,并应用该方法对静脉吸毒人群的HIV感染现况和感染影响因素进行研究。

研究方法:建立阶段试验一:旨在探讨微量明胶颗粒凝集试验法用于检测针管残留血中HIV-1抗体的可行性。

在2010年6月,收集5份已知的HIV感染阳性者抽血的针管,应用微量明胶颗粒凝集试验法检测针管残留血中的HIV-1抗体。

建立阶段试验二:旨在了解当针具残留血在常温下保存不同时间后,该方法还能否检测出其中的HIV-1抗体。

在2010年6月,挑选10名静脉吸毒者(其中8名为已知HIV感染阳性者,2名为HIV阴性者)和10名健康体检者,对每人人为制造10支含有少量残留血的针管。

具体做法为:先用干净的针管每人抽取2毫升血放入干净的试管,然后用10支1毫升针管抽取试管中的血液再全部注回到原试管,反复10次即获得人为制造的10支含有少量残留血的针具,编号后保存在常温条件下。

针对每人抽血后的人为制造的10个针具残留血标本分别于7天、1个月、2个月、半年、1年五个不同时间点进行HIV-1抗体检测,共计五次,每次检测2支。

收集其检测结果。

建立阶段试验三:旨在通过小型现场实验,进一步检验ML-PA实验法能否检测出针具残留血中的HIV-1抗体。

在2011年10月,到德宏州盈江县戒毒所对新入所的126名静脉注射吸毒人员同时进行血浆HIV-1抗体检测和针具残留血中HIV-1抗体检测,分析比较二者结果的一致性。

建立阶段试验四:进一步通过现场实验,检验ML-PA试验法能否检测出针具残留血中的HIV-1抗体。

2012年4月,到云南省第三强制戒毒所对536名静脉注射吸毒人员同进行血浆采集和针管残留血的收集,对血浆HIV-1抗体检测和针管残留血中HIV-1抗体检测,分析比较二者结果的一致性。

HIV测定(胶体金法)标准操作规程

HIV测定(胶体金法)标准操作规程

For personal use only in study and research; not蚄文件编号:for commercial use芃 For personal use only in study and research;notfor commercial use肇第1页共 3 页肁莈南宁市红十字会医院检验科螆 HIV 筛查实验室肅 2011 年 10 月版第 0 次修订袆HIV 测定(英科新创、胶体金法)标准操作规程膀实施日期: 2011 年 10 月 18 日羆1、检验目的节用于快速定性检测人全血、血清或血浆样品中的HIV 1/2 型抗体。

羃2、原理衿采用胶体金免疫技术和层析原理,定性测定全血、血清或血浆样本中的HIV 1/2 型抗体。

检测陽性样本时,样本中的 HIV 抗体与胶体金标记抗原结合形成复合物,由于层析作用复合物沿纸条向前移动,经过检测线时与预包被的重组抗原结合形成夹心物而凝聚显色,游离的胶体金标记重组抗原则在对照线处与抗 HIV 单克隆抗体结合而富集显色。

阴性标本则仅在对照线处显色,30 分钟内观察结果即可。

肆3、性能参数蚃用国家参考品测定,阳性参考品符合率、阴性参考品符合率、精密性、最低检出量、稳定性能均符合要求,测定类风湿因子阳性血清、乙型肝炎、甲型肝炎、梅毒及非肝炎传染病患者等各种类型的血清不得引起干扰。

莀本测试条 / 卡仅用于体外诊断试验,仅用于人全血、血清或血浆,其他体液和样本可能得不到准确的结果。

蚇对于下列物质在所给出的浓度下对测试结果不造成影响:肆测定物质名称肃测定的浓度膂测定物质名称蒆测定的浓度膆胆固醇蒄≤200 mg/ml薀血红蛋白葿≤178 g/L芆甘油三酯薁≤200 mg/ml节胆红素芈≤16 mg/L莅4、标本要求羂标本类型:血清或血浆,血浆样本对临床常用抗凝剂(EDTA、肝素、枸橼酸钠)无要求。

螀标本采集:见标本采集手册。

标本储存和运输:如果血清或血浆样品收集后 7 天内检测,样品须放在 2~ 8℃保存,如果肇大于 7 天则须冷冻保存;全血标本建议在 3 天内检测,样品放在 2~8℃保存,不得冻存。

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万方数据
中国生物制品学杂志2008年9Y]第21卷第9期ChinJBiologicalsSeptember2008。

V01.21No.9.811.
1.2试剂
DMEM培养基、胎牛血清和转染试剂Lipofec—tamine2000均购自美国GIBCO公司;HIV.1阳性血清分离自广西艾滋病患者;碱性磷酸酶标记的羊抗人IgG购自JacksonImmunoResearchlaboratories,INC;BCIP/NBT购自福建迈新生物技术公司。

1.3细胞培养和转染
于转染前一天将2.5X105个293T细胞接种于6孔板,至第2天达70%一80%单层时,将质粒pNL4-3.Luc.R.E(9¨g)分别与带有HIV.1Envelope基因的真核表达质粒peDNA3.1EnvB/C亚型(1斗g)和VRl012EnvC亚型(1斗g)共转染293T细胞,两种质粒按9:1摩尔比稀释于250Ixl无血清无抗性DMEM溶液中,温和混匀;用前混匀Lipo—fectamine2000,取6Ixl溶于无血清无抗性DMEM,温和混匀,室温作用5min;将上述两种溶液混匀,室温作用20rain;加入细胞培养液内,混匀,置37℃5%CO:培养箱中培养48h。

Westernblot检测目的基因在293T细胞中的表达,同时检测荧光素酶含量。

1.4假病毒感染
转染48h后,收集瞬时转染的细胞培养上清,3000r/rain离心10min,用O.45¨m滤器去除细胞残渣,获得HIV.1假病毒。

将靶细胞HOS.CD舡CCR5/CXCR4接种6孔板,8×104个/孔,37℃5%C02培养24h,每孔加入200山假病毒,置37℃5%CO:细胞培养箱孵育lh;再向各孔中加入DEAE,终浓度17VLg/ml,置37℃细胞培养箱培养5h后,向各孔中补加无抗性完全DMEM培养基,至终体积为IInl,培养72h后裂解细胞,检测荧光素酶含量。

1.5WesternbIot检测
收集感染后的细胞,进行SDS.PAGE,将蛋白电转移到硝酸纤维素膜上,加入PBS溶解的3%脱脂奶粉,室温封闭lh;用PBsT(Tween.20终浓度为o.2%)洗涤1次,5min/次;加入含HIV-1阳性血清的PBS(含l%脱脂奶粉),振摇1.5h;用PBsT洗膜3次,5min/次;加入含碱性磷酸酶标记的羊抗人IgG的PBS(含l%脱脂奶粉),振摇30—45Illin;用PBST洗膜3次,5rain/次;用PBS洗涤1次;取66¨lNBT和33斗lBCIP溶液,与10Inl碱性磷酸酶缓冲液混匀,浸泡膜显色。

1.6荧光素酶检测
吸弃待检细胞培养基,用PBS漂洗细胞2—3次;加入1×裂解缓冲液覆盖细胞;将细胞从培养皿刮下,漩涡振荡5—10s,12000g离心15s(室温);取上清液80仙l,加入荧光仪器专用检测板中,并加平衡至室温的荧光反应底物,30斗l/孔,仪器读数检测荧光素酶含量(样品须在20min内检测,否则影响酶活力;暂时不测的样品保存于-80℃)。

1.7统计学分析
实验数据应用统计学软件SPSSIO.0进行统计学分析,样本显著性分析用配对t检验。

2.结果
2.1目的蛋白在293T细胞中的表达
Westernblot结果显示,共转染质粒peDNA3.1EnvB/C与pNL4.3.Luc.R.E和VRl012EnvC与pNL4.3.Luc.R.E的293T细胞均有HIV.1结构蛋白G/lg:pol和Env的表达,相对分子质量分别为55000和160000;而单独转染pNIA.3.Luc.R.E及pNIA.3.Luc.R.E+VRl012质粒的细胞只有结构蛋白Ga91)ol的表达,见图1。

l:pr岫marker;2:pNL4-3.Lug.R.E+pcDNA3.1EnvB/C;3:pNL4-3.Luc.R-E4-VRl012EnvC;4:blankcontrol;5:pNIA-3.Luc.R-E+VRl012;6:pNIA-3.Luc.R-Il图1目的蛋白在293T细胞中表达的Westernblot检测№1.Westernblottingofexpressedproductin293Tcells
2.2转染的293T细胞荧光素酶含量
将表达荧光素酶的pNL4.3.Luc.R.E质粒单独转染或与表达Env基因的质粒共转染293T细胞后,均有很强的荧光素酶的表达。

peDNA3.1EnvB/C共转染组和VRl012EnvC共转染组与空白对照组(293T细胞)相比,其荧光素酶表达强度均显著升高(tl-1.570,t2=1.189,P均小于0.01),见图2。

2.3假病毒感染HoS-CD4·CCI巧/CXCR4细胞后的荧光素酶含量
结果表明,pNL4.3.Luc.R.E和pcDNA3.1EnvB/C以及pNIA.3.Lue.R.E和VRl012EnvC共转
染后的细胞上清均能检测到荧光素酶表达,证明荧
 万方数据
 万方数据
HIV-1中和抗体检测方法的建立
作者:赵东海, 张喜珍, 马红霞, 孔维, 于湘晖
作者单位:赵东海(吉林大学生命科学学院,吉林大学疫苗研究中心,长春,130021;吉林医药学院病理学教研室,吉林,132013), 张喜珍,马红霞,孔维,于湘晖(吉林大学生命科学学院,吉林大学疫
苗研究中心,长春,130021)
刊名:
中国生物制品学杂志
英文刊名:CHINESE JOURNAL OF BIOLOGICALS
年,卷(期):2008,21(9)
1.Ferrantelli F.Rasmussen RA.Hofmann-Lehman R Do not underestimate the power of antibodies21essons from adoptive transfer of antibodies against HIV 2002(06)
2.黑发欣.邵一鸣HIV中和抗体的免疫机制、诱导和检测[期刊论文]-国外医学(病毒学分册) 2004(01)
3.马红霞.于湘晖.姜春来中国流行株HIV-B/C重组亚型包膜蛋白真核表达载体的构建及稳定表达细胞株的筛选[期刊论文]-中国生物制品学杂志 2006(04)
4.Mascola JR.Louder Mk.Winter C Human immunodeficiency virus type 1 neutralization measured by flow cytometric quantitation of single-round infection of primary human T ceils[外文期刊] 2002(10)
本文链接:/Periodical_zgswzpxzz200809025.aspx。

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