HIV-1中和抗体检测方法的建立

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中国生物制品学杂志２００８年９Ｙ］第２１卷第９期ＣｈｉｎＪＢｉｏｌｏｇｉｃａｌｓＳｅｐｔｅｍｂｅｒ２００８。Ｖ０１．２１Ｎｏ．９．８１１．

１．２试剂

ＤＭＥＭ培养基、胎牛血清和转染试剂Ｌｉｐｏｆｅｃ—ｔａｍｉｎｅ２０００均购自美国ＧＩＢＣＯ公司；ＨＩＶ．１阳性血清分离自广西艾滋病患者；碱性磷酸酶标记的羊抗人ＩｇＧ购自ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＩＮＣ；ＢＣＩＰ／ＮＢＴ购自福建迈新生物技术公司。

１．３细胞培养和转染

于转染前一天将２．５Ｘ１０５个２９３Ｔ细胞接种于６孔板，至第２天达７０％一８０％单层时，将质粒ｐＮＬ４－３．Ｌｕｃ．Ｒ．Ｅ（９¨ｇ）分别与带有ＨＩＶ．１Ｅｎｖｅｌｏｐｅ基因的真核表达质粒ｐｅＤＮＡ３．１ＥｎｖＢ／Ｃ亚型（１斗ｇ）和ＶＲｌ０１２ＥｎｖＣ亚型（１斗ｇ）共转染２９３Ｔ细胞，两种质粒按９：１摩尔比稀释于２５０Ｉｘｌ无血清无抗性ＤＭＥＭ溶液中，温和混匀；用前混匀Ｌｉｐｏ—ｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００，取６Ｉｘｌ溶于无血清无抗性ＤＭＥＭ，温和混匀，室温作用５ｍｉｎ；将上述两种溶液混匀，室温作用２０ｒａｉｎ；加入细胞培养液内，混匀，置３７℃５％ＣＯ：培养箱中培养４８ｈ。Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测目的基因在２９３Ｔ细胞中的表达，同时检测荧光素酶含量。

１．４假病毒感染

转染４８ｈ后，收集瞬时转染的细胞培养上清，３０００ｒ／ｒａｉｎ离心１０ｍｉｎ，用Ｏ．４５¨ｍ滤器去除细胞残渣，获得ＨＩＶ．１假病毒。

将靶细胞ＨＯＳ．ＣＤ舡ＣＣＲ５／ＣＸＣＲ４接种６孔板，８×１０４个／孔，３７℃５％Ｃ０２培养２４ｈ，每孔加入２００山假病毒，置３７℃５％ＣＯ：细胞培养箱孵育ｌｈ；再向各孔中加入ＤＥＡＥ，终浓度１７ＶＬｇ／ｍｌ，置３７℃细胞培养箱培养５ｈ后，向各孔中补加无抗性完全ＤＭＥＭ培养基，至终体积为ＩＩｎｌ，培养７２ｈ后裂解细胞，检测荧光素酶含量。

１．５ＷｅｓｔｅｒｎｂＩｏｔ检测

收集感染后的细胞，进行ＳＤＳ．ＰＡＧＥ，将蛋白电转移到硝酸纤维素膜上，加入ＰＢＳ溶解的３％脱脂奶粉，室温封闭ｌｈ；用ＰＢｓＴ（Ｔｗｅｅｎ．２０终浓度为ｏ．２％）洗涤１次，５ｍｉｎ／次；加入含ＨＩＶ－１阳性血清的ＰＢＳ（含ｌ％脱脂奶粉），振摇１．５ｈ；用ＰＢｓＴ洗膜３次，５ｍｉｎ／次；加入含碱性磷酸酶标记的羊抗人ＩｇＧ的ＰＢＳ（含ｌ％脱脂奶粉），振摇３０—４５Ｉｌｌｉｎ；用ＰＢＳＴ洗膜３次，５ｒａｉｎ／次；用ＰＢＳ洗涤１次；取６６¨ｌＮＢＴ和３３斗ｌＢＣＩＰ溶液，与１０Ｉｎｌ碱性磷酸酶缓冲液混匀，浸泡膜显色。

１．６荧光素酶检测

吸弃待检细胞培养基，用ＰＢＳ漂洗细胞２—３次；加入１×裂解缓冲液覆盖细胞；将细胞从培养皿刮下，漩涡振荡５—１０ｓ，１２０００ｇ离心１５ｓ（室温）；取上清液８０仙ｌ，加入荧光仪器专用检测板中，并加平衡至室温的荧光反应底物，３０斗ｌ／孔，仪器读数检测荧光素酶含量（样品须在２０ｍｉｎ内检测，否则影响酶活力；暂时不测的样品保存于－８０℃）。

１．７统计学分析

实验数据应用统计学软件ＳＰＳＳＩＯ．０进行统计学分析，样本显著性分析用配对ｔ检验。

２．结果

２．１目的蛋白在２９３Ｔ细胞中的表达

Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ结果显示，共转染质粒ｐｅＤＮＡ３．１ＥｎｖＢ／Ｃ与ｐＮＬ４．３．Ｌｕｃ．Ｒ．Ｅ和ＶＲｌ０１２ＥｎｖＣ与ｐＮＬ４．３．Ｌｕｃ．Ｒ．Ｅ的２９３Ｔ细胞均有ＨＩＶ．１结构蛋白Ｇ／ｌｇ：ｐｏｌ和Ｅｎｖ的表达，相对分子质量分别为５５０００和１６００００；而单独转染ｐＮＩＡ．３．Ｌｕｃ．Ｒ．Ｅ及ｐＮＩＡ．３．Ｌｕｃ．Ｒ．Ｅ＋ＶＲｌ０１２质粒的细胞只有结构蛋白Ｇａ９１）ｏｌ的表达，见图１。

ｌ：ｐｒ岫ｍａｒｋｅｒ；２：ｐＮＬ４－３．Ｌｕｇ．Ｒ．Ｅ＋ｐｃＤＮＡ３．１ＥｎｖＢ／Ｃ；３：ｐＮＬ４－３．Ｌｕｃ．Ｒ－Ｅ４－ＶＲｌ０１２ＥｎｖＣ；４：ｂｌａｎｋｃｏｎｔｒｏｌ；５：ｐＮＩＡ－３．Ｌｕｃ．Ｒ－Ｅ＋ＶＲｌ０１２；６：ｐＮＩＡ－３．Ｌｕｃ．Ｒ－Ｉｌ图１目的蛋白在２９３Ｔ细胞中表达的Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测№１．Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇｏｆｅｘｐｒｅｓｓｅｄｐｒｏｄｕｃｔｉｎ２９３Ｔｃｅｌｌｓ

２．２转染的２９３Ｔ细胞荧光素酶含量

将表达荧光素酶的ｐＮＬ４．３．Ｌｕｃ．Ｒ．Ｅ质粒单独转染或与表达Ｅｎｖ基因的质粒共转染２９３Ｔ细胞后，均有很强的荧光素酶的表达。ｐｅＤＮＡ３．１ＥｎｖＢ／Ｃ共转染组和ＶＲｌ０１２ＥｎｖＣ共转染组与空白对照组（２９３Ｔ细胞）相比，其荧光素酶表达强度均显著升高（ｔｌ－１．５７０，ｔ２＝１．１８９，Ｐ均小于０．０１），见图２。２．３假病毒感染ＨｏＳ－ＣＤ４·ＣＣＩ巧／ＣＸＣＲ４细胞后的荧光素酶含量

结果表明，ｐＮＬ４．３．Ｌｕｃ．Ｒ．Ｅ和ｐｃＤＮＡ３．１ＥｎｖＢ／Ｃ以及ｐＮＩＡ．３．Ｌｕｅ．Ｒ．Ｅ和ＶＲｌ０１２ＥｎｖＣ共转

染后的细胞上清均能检测到荧光素酶表达，证明荧

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HIV-1中和抗体检测方法的建立

作者：赵东海， 张喜珍， 马红霞， 孔维， 于湘晖

作者单位：赵东海(吉林大学生命科学学院,吉林大学疫苗研究中心,长春,130021;吉林医药学院病理学教研室,吉林,132013)， 张喜珍,马红霞,孔维,于湘晖(吉林大学生命科学学院,吉林大学疫

苗研究中心,长春,130021)

刊名：

中国生物制品学杂志

英文刊名：CHINESE JOURNAL OF BIOLOGICALS

年，卷(期)：2008,21(9)

1.Ferrantelli F.Rasmussen RA.Hofmann-Lehman R Do not underestimate the power of antibodies21essons from adoptive transfer of antibodies against HIV 2002(06)

2.黑发欣.邵一鸣HIV中和抗体的免疫机制、诱导和检测[期刊论文]-国外医学(病毒学分册) 2004(01)

3.马红霞.于湘晖.姜春来中国流行株HIV-B/C重组亚型包膜蛋白真核表达载体的构建及稳定表达细胞株的筛选[期刊论文]-中国生物制品学杂志 2006(04)

4.Mascola JR.Louder Mk.Winter C Human immunodeficiency virus type 1 neutralization measured by flow cytometric quantitation of single-round infection of primary human T ceils[外文期刊] 2002(10)

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