发酵工程 第四章 灭菌技术

Production fermenter
Computer control
Air Recovery
Purification Effluent treatment
Products
第四章 灭菌技术
第一节 培养基灭菌 第二节 空气除菌
Consequence of contamination
Loss of productivity Displace of production organism Contamination of final product, e.g. SCP Contaminant produce other compound,
lgk - 14845 36.127 T
Bacillus stearothermophilus 脂肪嗜热芽孢杆菌
the effect of sterilization time on the availability of glucose in a corn-steep
liquor medium
发酵生产中杂菌污染的后果
杂菌可能会消耗培养基中的底物或产物，造成产品 产率的下降；
杂菌可能会产生一些有毒副作用的物质，从而抑制 发酵菌的生长、造成发酵的异常；
杂菌的大量繁殖可能会造成发酵液pH等参数的变化， 从而改变发酵液的理化性质、抑制产物的合成、增 加产物分离提取的难度；
杂菌可能会通过分泌某些酶类来降解目的代谢产物， 从而使发酵失败；
3.火焰灼烧灭菌法，是一种最彻底的干热灭菌方法， 但它只能用于接种环、针、钩，试管口，三角瓶口 等少数对象的灭菌。种子罐（小型罐）接种时火焰 保护开口接种。
4.虽简单有效，但不能用于发酵生产的消毒灭菌。
干热灭菌（烘箱）
表4-1干热灭菌温度和时间的关系
灭菌温度/（℃） 170 160 150 140 121
make extraction difficult. Degradation of final product, e.g.
bacterial contamination of antibiotic fermentation Contamination of bacterial fermentation with phage, lysis of the culture.
辐射灭菌（无菌室）
(三)干热灭菌法
1.利用火焰和热空气进行灭菌的方法。
2.电热烘箱灭菌法，在150～170℃下维持1～2小时， 细胞成分发生氧化、细胞蛋白质变性、电解质浓缩 等效应，其中导致微生物死亡的主要作用是氧化。 适用于工业要求为灭菌后能保持干燥状态物料的灭 菌 ，如棉塞、金属制品、玻璃器皿等。
而在不同温度（110℃， 115℃， 121℃， 125℃），灭菌不 同时间，使R0维持50，则菌体生长和磷酸盐消耗没有差异。
5.理论灭菌时间的确定
根据对数残留定律
ln Nt kt N0
t 1 ln N0 t 1 lg N0
k Nt
2.303 k Nt
（1）从公式可以看出，若要N=0时，t=∞，即灭菌后绝 对无菌在实际工作中是不可行的。因此，工程设计时 常采用N=0.001（个/罐），即灭菌1000罐中只残留一 个活菌数，可满足生产要求。
③ 石炭酸，2％～5％溶液，用于器械和环境的喷雾消毒。 ④ 来苏尔，2％，较石炭酸刺激性小，用于皮肤消毒。 ⑤ 新洁尔灭，由5％原液稀释至0.25％水溶液采用杀菌作用，用于
无菌室的喷雾消毒和皮肤，器械的表面消毒。 ⑥ 漂白粉，配成10％的水溶液，用于环境及发酵车间内的下水道、
地沟等污染地段的消毒。
3.适用范围：只适合于无菌室或实验室的净化消毒灭菌，或 用于发酵车间的环境消毒灭菌，而不能用于发酵工业生 产设备和物料的消毒灭菌。
Typical Bioprocess
Stock culture Microorganism cell preparation Shake flask
Seed fermenter
Raw materials Medium preparation
Medium formulation
Sterilization
4.培养基灭菌温度的选择
（为何要高温瞬时灭菌？）
培养基成分破坏也可看作一级反应，同样遵循：
dc kc dt
c－热敏感营养物质浓度，mol/L; t－灭菌时间，min k－分解速率常数，min -1
k与温度的关系也可用阿伦尼乌斯方程表示
k Ae-E/RT
A－频率因子； E －反应所需活化能，
lgk - E lgA 2.303RT
fermenter （所有材料的灭菌） Maintaining aseptic conditions（设备严密、无
菌条件的维持）
无菌接种
无菌接种技术：是指利用无菌的接 种工具在无菌环境条件下将微生物 纯种由一个培养器皿转移到另一个 培养器皿的技术。
无菌环境：在生物安全柜（BSC）、 超净工作台、无菌操作室和无菌接 种箱中或酒精度火焰旁进行操作， 还需提前使用甲醛、紫外线或70% 的乙醇等对周围环境进行预处理。
一、常用的灭菌方法
(一)化学物质灭菌
1.原理：与微生物细胞中的某种成分产生化学反应，如使蛋 白质变性、酶类失活、破坏细胞膜通透性而杀灭微生物。
2.常用化学灭菌剂：
① 甲醛（福尔马林），主要是气体杀菌，常用于染菌罐的处理和发 酵厂房内部环境的定期消毒灭菌，10mL / M3。
② 乙醇，70％，皮肤及器皿的消毒，浓度过高会在菌体表面形成膜， 影响乙醇进入菌体。
如发生噬菌体污染，会使微生物细胞发生裂解和死 亡，从而导致发酵失败。
Avoidance of contamination
Pure inoculum（无菌接种） Sterilizing the medium（培养基灭菌） Sterilizing the fermenter vessel（发酵设备灭菌） Sterilizing all materials to be added to
对培养基进行灭菌的目的是杀灭培 养基中的所有微生物，为后续发酵 过程创造无菌的条件。
与消毒（disinfection）的区别
消除毒害，这里的“毒害”就是指传染源或致病菌 的意思，英文中的“dis-infection”也是“消除传 染”的意思。
消毒是一种采用较温和的理化因素，仅杀死物体表 面或内部一部分对人体有害的病原菌，而对被消毒 的物体基本无害的措施。一般只能杀死营养细胞而 不能杀死细菌芽孢 。
Nt
N1
N2
Nt
1 2 3 T
T 高于40，效果变差
6.影响培养基灭菌的因素
（1）pH值的影响
pH 值 对 微 生 物 的 耐 热 性 影 响 很 大 ， pH 为 6.0～8.0时微生物最不易死亡， pH <6.0时 氢离子易渗入微生物的细胞内，促使其死亡。
（2）培养基成分
①油脂、糖类、蛋白质，尤其是蛋白质，凝固在菌体表面形 成膜，会增加微生物的耐热性，使灭菌困难。 ②高糖、高氮的丰富培养基（培养基基础料和中间补料）既 要考虑营养不被破坏，又要考虑灭菌的难度，如玉米浆、麸 质粉本身含有大量的蛋白质且寄生大量杂菌，尤其是芽孢杆 菌。实消，加热升温40min,控制125℃，0.12MPa，保温30min。 ③易挥发物料，如尿素，硫酸铵等，本身较纯净，高温破坏 本身成分，较低温度，压力和较短时间为宜。实消，加热升 温20min,控制105℃～110 ℃ ，0.05MPa，保温10min足够。 ④一般葡萄糖，淀粉，无机盐，较纯净，易于消透，实消， 加热升温40min,控制121℃，0.10～0.12MPa，保温20min。 ⑤高浓度的盐类、色素则削弱其耐热性，故较易灭菌。
ln
k2 k1
E , E＞E, ln k2
E
k1
＞ln
k2 k1
随着温度升高，菌体死 亡速率常数增加的倍数 大于培养基成分分解速 率常数增加的倍数。
在较高的温度下达到同样的灭菌效果所需的灭菌时 间缩短，有利于减少营养物质的降解，提高灭菌后 培养基的质量。
高温对培养基成分的有害影响及其防 止
（2）K取值耐热芽孢杆菌
lgk -14845 36.127 T
实际上，培养基要经历升温，保温，降温 三个阶段，升温和降温的一定阶段（温度高 于100℃）也有灭菌作用。
假设培养基中污染的耐热杂菌数为N0，升 温结束开始保温时残留菌数为N1，保温结束 时残留菌数为N2，冷却后残留菌数为Nt。
ln N0 ln N0 ln N1 ln N2

灭菌时，温度由T1升高到T2，灭菌速率常数k变化如
下， E k1 Ae , RT1
k2
E
Ae RT2
ln
k2 k1
E(1 R T1
1) T2
同理，培养基成分破坏也可得到类似关系，
k1
E
Ae , RT1
k2
E
Ae RT2
ln
k2' k1'
E 1 (
R T1
1) T2
两式相除得：
ln k2
k1
整个操作过程要做到正确、迅速。
接种工具包括接种环、接种针等， 一般都采用易于快速加热和冷却的 铂金、镍铬合金等金属制备（或者 一次性的塑料接种环、接种针）。
第一节 培养基灭菌
何谓灭菌（sterilization）？
灭菌是指用化学的或物理的方法杀 灭或去除物料及设备中所有生命物 质的技术或工艺过程。
总之，培养基灭菌一般都采用高温短时加热的方式，这样可以 达到彻底灭菌和把营养物质破坏减少到最低程度的目的。
Q10：一般化学反应，1.5～2；杀灭芽孢，5～10； 杀灭微生物细胞，35
Boeek等提出指标R0，
t
E
R0 t Ae RT