基因工程简答题

1.某学生在用EcoRI切割外源DNA片段时，出现了星号活性，请分析可能的原因?
盐离子浓度不对，温度不对，甘油浓度过高。
2。说明Sanger DNA测序法的原理。
答：Sanger DNA测序法是建立在两个基本原理之上：(1)核酸是依赖于模板在聚合酶的
作用下由5'端向3'端聚合(DNA聚合酶参与了细菌修复DNA合成过程)；(2)可延
伸的引物必须能提供游离的3'羟基末端，双脱氧核苷酸由于缺少游离的3'羟基末
端，因此会终止聚合反应的进行。如果分别用4种双脱氧核苷酸终止反应，则会获
得4组长度不同的DNA片段。通过比较所有DNA片段的长度可以得知核苷酸的
序列。
3．在序列5'-CGAACATATGGAGT-3'中含有一个6bp的Ⅱ类限制性内切核酸酶的识别序列，该位点的序列可能是什么?
回文序列是：5'-CATATG-3，
4．下面几种序列中你认为哪一个(哪些)最有可能是Ⅱ类酶的识别序列：
GAATCG，AAATTT， GATATC， ACGGCA? 为什么?
GATATC；AAATTT，因为它们是回文序列。
5．当两种限制性内切核酸酶的作用条件不同时，若要进行双酶切，应采取什么措施?
为什么?
注意星活性，先低盐，后高盐；先低温酶，后高温酶；并且可以直接在换酶前将第一
种酶失活，再加第二种酶，否则，易产生星活性。或使用通用缓冲液。

6．为什么反转录酶在聚合反应中会出错?
由于反转录酶缺少在E．coli DNA聚合酶中起校正作用的3'-5'外切核酸酶活性，所以聚合反应往往会出错，在高浓度的dNTP和Mg2+下，每500个碱基中可能有一个错配。
7．什么是测序酶(sequenaseTM)?
答：
所谓测序酶即是修饰了的T7 DNA聚合酶，是采用缺失的方法，从外切核酸酶结构域中除去28个氨基酸，这样使T7 DNA聚合酶完全失去了3'-5'的外切核酸酶活性，只有5'---3'聚合酶的活性，而且聚合能力提高了3～9倍，测序时常用此酶。

8． 什么是S1核酸酶作图(S1 nuclease mapping)?
答：
S1核酸酶作图是一种对RNA转录产物的末端和剪接位点进行作图的方法

9 YAC载体具有什么样的功能性DNA序列?为什么在克隆大片段时，YAC具有优越
性?
答：
YAC带有天然染色体所有的功能元件，包括一个着丝粒，一个DNA复制起点，两个端粒。YAC能够容纳长达几百kb的外源DNA，这是质粒和黏粒办不到的。大片段的插入更有可能包含完整的基因，在染色体步移中每次允许更大的步移距离，同时能够减少完整基因组文库所需的克隆数目。

10． 列举质粒载体必须具备的4个基本特性。
．答：
(1)独立复制； (2)有选择标记； (3)有独特的酶切位点； (4)能转化但不扩散。

11． 什么叫穿梭载体？
答：
含有细菌质粒和克

隆的真核生物DNA片段的杂种质粒，有两个复制起点和既能在细菌又能在真核细胞中进行选择的选择标记，所以，很容易从一宿主转到另一个宿主(来回穿梭)。

12． 如何将野生型的l噬菌体改造成为一个理想的载体?
答：
(1)削减分子量(除去非必需区和整合区)； (2)削减酶切位点； (3)添加选择标记；
(4)引入终止突变
13．答：

13． PCR的基本原理是什么?用PCR扩增某一基因，必须预先得到什么样的信息?
(1)DNA半保留复制的原理，在体外进行DNA的变性、复性和引物延伸。
(2)至少要预先知道足够合成一对引物的靶DNA序列。

14． cDNA克隆与基因组克隆有何不同?
．答：
基因组克隆包含所有不在cDNA中出现的内含子

15． 怎样将一个平末端DNA片段插入到EcoR I限制位点中去?
答：
化学合成一些长为10bp含有EcoRI识别位点的短的DNA片段，然后与待克隆片段两端连接起来，如果用EcoRI切割这种连接片段，就会产生EcoRI的单链末端。这种片段就可以插入到任何EcoRI的限制性内切酶位点中。

16． 简述以黏粒为载体构建基因文库的原理。
答：
(1)COS位点可以自身环化； (2)可以利用COS位点包装l噬菌体颗粒；
(3)可以感染寄主细胞； (4)利用质粒复制子复制，不整合、不裂解。

17． 酵母人工染色体要在酵母细胞中稳定存在，必须有哪些基本的结构?
答：
(1)着丝粒； (2)端粒； (3)ARS序列。

18． 何谓YAC? 主要特性是什么?
答：
(1)含有来自其他生物DNA的酵母人工染色体，叫YAC；
(2)主要特性是可以克隆较大的外源片段。

19． Muller的PCR反应同大肠杆菌体内的DNA复制有哪些不同?你认为根本的差别在
哪里?
答：
PCR用双引物，体内复制用单引物。

20．欲将一真核生物的结构基因克隆后转移到原核生物(如E．coli)中进行表达，克隆时应
注意哪些问题?
答：
应注意的问题有：启动子、密码子、剪接、分泌

21．假定你分离到一个E．coli的Thy- 突变体，并推测有可能是ThyA基因突变。请设计
一个方案用PCR从染色体DNA扩增突变的ThyA基因，测定突变的序列。(注：E．coli
野生型的ThyA基因的序列是已知的)
答：
为了扩增突变体的thyA基因，先设计一对引物，其中一个引物的序列与thyA基因的5’端相同，另一个引物同该基因的3’端互补。在引物的5’端加上合适Ⅱ类限制性内切核酸酶的识别序列，以便于后来的克隆。将染色体DNA同引物混合后，进行PCR扩增。然后进行琼脂糖凝胶电泳，纯化扩增片段，可以直接测序或克隆到合适的载体再测序。

22． 你在做Southern印迹分析，并且刚完成了凝胶电泳这一步。根据

方案，下面一步骤
是用NaOH溶液浸泡凝胶，使DNA变性为单链。为了节省时间，你略过了这一步，
直接将DNA从凝胶转至硝酸纤维素膜上。然后用标记探针杂交，最后发现放射自
显影片是空白。错在哪里?
答：
如果你的杂交探针是双链的，可能因为在加人杂交混合物之前忘记将探针变性而得到空白的放射自显影结果。

23．切口移位(nick translation)标记探针的主要步骤有哪些?
答：
(1)DNaseI造成切口；
(2)DNA聚合酶III的5’ ?3’外切核酸酶进行切割；
(3)DNA聚合酶Ⅲ的5’?3’合成酶进行修补；
(4)在修补过程中，随着切口(nick)的移动，将放射性的底物掺人到双链DNA中

24．用EcoRI和Hind Ⅲ分别切割同一来源的染色体DNA，并进行克隆，在前者的克隆
中筛选到A基因，但在后者的克隆中未筛选到A基因，请说明原因。
答：
原因是：HindⅢ的切点在A基因内。

25．什么是Western印迹?它与Southern印迹有什么不同?
答：
Western印迹是将蛋白质经电泳分离后从凝胶中转移到固相支持物上，然后用特异性的抗体进行检测。它与Southern的不同在于探针的性质不同，在Western印迹中使用的探针是抗体(蛋白质)。

26．用一限制性内切核酸酶切割Lac+ Tet+的质粒载体，已知该酶识别的是4个碱基序列，
并产生有两个碱基突出的单链末端，该酶在lac基因内有切割位点，并在第二个氨基
酸密码子内，该位点可以被任何氨基酸所取代而不影响酶活性。用该酶切割后，用 DNA聚合酶将单链末端补齐为双链的平末端，然后重新连接成环，转化Lac- Tets
受体菌，筛选Tetr转化子，问：Lac的基因型是什么?并说明原因。
答：
基因型是lac-．原因是在该密码子中插入了两个碱基，造成了移码突变，所以Lac的基因是缺陷的

27．在基因工程中，为了在细菌细胞中表达真核生物的基因产物，为什么通常要用cDNA
而不用基因组DNA?为什么要在cDNA前加上细菌的启动子?
答：
这是因为细菌没有内含子剪接系统，并且不能识别真核生物的启动子之故。


四、问答题：
1． 说明限制性内切核酸酶的命名原则要点。
1． 答：
限制性内切核酸酶采用三字母的命名原则，即属名+种名+株名的各一个首字母，再加上序号。 基本原则： 3-4个字母组成，方式是：属名+种名+株名+序号； 首字母： 取属名的第一个字母，且斜体大写；第二字母： 取种名的第一个字母，斜体小写；
第三字母： (1)取种名的第二个字母，斜体小写；
(2)若种名有词头，且已命名过限制酶，则取词头后的第一字母代替。
第四字母： 若有株名，株名则作为第四字母，是否大小

写，根据原来的情况而定，
但用正体。 顺序号： 若在同一菌株中分离了几种限制酶，则按先后顺序冠以I、Ⅱ、Ⅲ、… 等，用正体。

2． 什么是限制性内切核酸酶的星号活性? 受哪些因素影向?
答：
Ⅱ类限制酶虽然识别和切割的序列都具有特异性，但是这种特异性受特定条件的限
制，即在一定环境条件下表现出来的特异性。条件的改变，限制酶的特异性就会松
动，识别的序列和切割都有一些改变，改变后的活性通常称第二活性，而将这种因
条件的改变会出现第二活性的酶的右上角加一个星号表示，因此第二活性又称为星
活性。
概括起来，诱发星活性的因素有如下几种：(1)高甘油含量(>5％, v／v)；(2)限制性
内切核酸酶用量过高(>100U／ugDNA)；(3)低离子强度(<25 mmol／L)；(4)高pH(8．0
以上)；(5)含有有机溶剂，如DMSO，乙醇等；(6)有非Mg2+的二价阳离子存在(如
Mn2+，Cu2+，C02+，Zn2+等)。

3． 影响DNA连接酶催化连接反应的因素有哪些?
答：
影响DNA连接酶催化连接反应的因素有很多，但温度对连接反应的影响较大。黏性末端链通常以12°C一15°C最好，这种温度有利于末端退火和连接酶的活性稳定。温度高了难以进行末端退火，低于上述温度会降低连接酶的活性。平末端连接以室温为宜，因为平末端连接不存在DNA的退火问题，但是温度高于30℃，连接酶特别不够稳定。平末端连接时连接酶的浓度要比黏性末端连接时高10-100倍。DNA中有残存的tRNA不会抑制DNA连接酶的活性，但是，如果NaCl的浓度高于150mmol／L，则对连接反应有强的抑制作用。
另外反应体系中有NH4+离子的存在，对E．coli DNA连接酶具有激活作用。E．coli DNA
连接酶需要NAD+作辅助因子，而T4 DNA连接酶需要ATP。

4． 什么是Klenow酶?有哪些活性?在基因工程中有什么作用?
答：
Klenow酶是1974年Klenow用枯草杆菌蛋白酶水解DNA聚合酶I，得到两个片段，其中大片段的分子量为75kDa，它具有5'-3'聚合酶和3'-5'外切核酸酶的活性，小片段具有5'-3'外切核酸酶活性。由于大片段失去了DNA聚合酶I中会降解5'引物的5'-3'外切核酸酶的活性，所以在基因工程中更有用。
Klenow酶主要有下列用途：
(1)修复反应，制备平末端
可用Klenow酶修复限制性内切核酸酶或其他方法产生的5'或3'突出末端，制备平末端，这样可以使原来具有不相容的黏性末端的DNA片段通过平末端重组。如在反应系统中加入放射性同位素标记的脱氧核苷酸，用这种末端填补的方法可以制备3'末端标记的探针。
用Klenow酶修复5'突出末端的反应主要是利用了Klenow酶的DNA聚合酶活性，是填补反应；而

修复3'突出末端则是用Klenow酶的3'-5'外切核酸酶的活性，是切割反应。用Klenow酶的切割反应来修复3'突出末端是不理想的，改用T4DNA聚合酶或其他的酶是更好的选择。
(2) 标记DNA3'突出末端(protruding end)
该反应分两步进行：先用3'-5'的外切核酸酶活性除去3'突出末端，产生3'隐含末端，然后在高浓度的标记底物( -32p-dNTP)存在下，使降解(3'-5')作用与聚合(5'-3')作用达到平衡。这种反应也叫交换或取代反应(exchange／replacement reaction)。不过这一反应用T4DNA聚合酶的效果更好，因它的3'-5'外切核酸酶活性较强。
(3)其他的一些用途：包括用双脱氧末端终止法进行DNA序列分析、用于cDNA第二链的合成、在定点突变中用于合成第二链、用引物延伸法(primer extension)制备单链DNA探针等。

5．细菌碱性磷酸酯酶和小牛肠碱性磷酸酯酶有什么不同?在基因工程中有什么用途?
答：
主要差别是：CIP68°C时失活，而BAP68°C稳定，且耐酚抽提。应用：
(1)dsDNA的5'端脱磷酸，防止DNA的自身连接。但是用CIP处理后，最好将CIP除去后，再进行连接反应。
(2)DNA和RNA脱磷酸，然后用于多核苷酸激酶进行末端标记。

6．λ外切核酸酶(1ambda exonuclease)基本活性是什么?在基因工程中有什么应用?
答：
外切核酸酶是从 噬菌体感染的E．coli中分离纯化的，能够从双链DNA上依次切下5'单核苷酸，作用底物是双链DNA的5'磷酸末端，不能切割羟基化5'端。该酶虽然能切割单链DNA,但效率较低(下降200倍)。不能切割带切口或缺口的dsDNA。该酶作用时是行进性的，一步一步进行的。在基因工程中主要用于除去双链DNA突出的5'末端，以便让末端转移酶加尾。

7．Mn2+、Mg2+对Dnase I(deoxyribonuclease ?)的活性有什么影响?Dnase I在基因工程中有什么作用?
答：
DNase I是一种内切核酸酶，在Mg2+存在下，DNase I随机切割DNA两条链中的任意一条链；当Mn2+代替Mg2+时，DNase I几乎是在双链DNA两条链相对的位置上打开缺口，使双链DNA断裂，产生的末端几乎是平末端或只突出1～2个核苷酸的DNA片段。
DNase I有许多用途：(1)在切口移位标记中，制造切口；(2)在足迹法中保护DNA；
(3)除去RNA制备物中的DNA；(4)体外转录中除去DNA模板；(5)检测染色体中的转录活性区；(6)产生可在噬菌体M13载体上进行测序的随机克隆。

8．质粒如何维持在细胞中的稳定？
质粒通过以下几种机制维持在细胞中的稳定：
(1)多聚体质粒的分解
如果质粒在复制时形成多聚体的话，在细胞分裂过程中质粒丢失的可能性就会增加。一个多聚体是由多个单体相互连接而成的。多聚体的形成可能是由于在复制终止时发生错误或者是由于单体间

重组的结果。由于多聚体在细胞分裂时将作为一个质粒进入一个子细胞，这样，多聚体的形成就大大降低了质粒的有效拷贝数，因此，多聚体也就大大增加了细胞分裂时质粒丢失的机会。为了避免这种情况的发生，很多质粒都具有位点专一性重组的系统，可以破坏多聚体。
(2)分离(partitioning)
质粒通过一种分离系统来防止在细胞分裂过程中质粒的丢失，这种机制保证在细胞分裂过程中每个子细胞至少可得到一个质粒拷贝，这是由称为par功能(Par functions)完成的。 所谓par功能是指某些质粒，包括F、R1等质粒上具有的一些短的区域，这些区域能够增强质粒拷贝的合适分配。如果从质粒中将这种区域拿掉，质粒丢失的频率就会相当高。已经深入研究过P1质粒的分离系统，发现P1质粒的分离系统由一个顺式激活par序列和两个蛋白ParA和，ParB的基因构成，其中一个蛋白同par位点结合。
关于par位点是怎样增强质粒适当分离的机制有两种模型，按照这两种模型，细菌的膜具有真核生物有丝分裂纺锤体的功能，在细胞分裂之前将质粒分开。par位点是质粒同质膜结合的区域，在细胞分裂时，由于膜的生长，质粒的两个拷贝就被拉到两个子细胞中。这两个模型对于细胞分裂时，质粒同质膜的结合是怎样保证每个细胞至少得到一个质粒的解释是不同的。
模型．A：par位点同细菌质膜的一个假定位点结合。在这个模型中，每一种质粒都有它自己独特的同质膜结合的位点。当细胞生长时，位点也加倍，每一个质粒拷贝结合一个位点。由于这些位点随着细胞分裂而分开，每一个质粒拷贝将分配到一个子细胞。这就保证了质粒不会丢失。该模型要解决的问题是质膜上必须有许多独特的位点以供不同的质粒拷贝结合，这似乎不太可能。
将模型A稍微改动一下，就可以满足质粒分离所需的位点。如果我们假定质粒结合的位点不在质膜而是在细菌的染色体上就可以了。染色体上有很多的位点，并且随着DNA的复制而加倍，这些位点可供质粒结合。剩下的唯一问题就是在质膜上有同染色体结合的独特位点，这样，质粒将随着染色体的分离而分离。
模型B同模型A基本类似，在这个模型中，质粒的两个拷贝在同质膜结合之前必须通过它们的par位点相互配对。然后这两个质粒在细胞分裂过程中随着质膜位点的分离而分离。高拷贝数的质粒常常具有增加质粒适当分离的位点，但是这些区域并没有相同的结构，并不以相同的机制起作用。例如，质粒pSCl01的par区可以增加质粒的超螺旋，至于超螺旋的增加如何帮助质粒的适当分离是不清楚的。可能是增强了质粒分离后的迅速

复制，防止了下次分裂时的丢失。
(3)质粒溺爱(plasmid addiction)
即使质粒具有分离功能，质粒也会从增殖的细胞中丢失。在一类复仇的细胞中，质粒能够编码一些杀死丢失了质粒的细胞。像F质粒、R1质粒、以及P1噬菌体都有这种功能。这些质粒编码一些毒性蛋白质，这些蛋白质一旦表达就会杀死细胞。根据质粒的来源不同，毒性蛋白质可通过各种方式杀死细胞。
例如，质粒的毒性蛋白Ccd,通过改变DNA螺旋酶来杀死细胞，由于螺旋酶的改编，引起了双螺旋DNA的断裂。质粒R1的杀手蛋白Hok,破坏细菌细胞质膜的功能，引起细胞活力的丧失。为什么毒性蛋白仅仅是在细胞丢失了质粒之后立即杀死细胞?当细胞含有这种质粒时，沉溺系统的蛋白质或RNA可作为一种解毒药，既能阻止毒蛋白的合成，又能同毒蛋白结合并阻止毒蛋白起作用。
然而，这些其他基因的产物要比毒性蛋白不稳定得多，所以它们会很快失活。如果一个细胞丢失了质粒，既没有毒性蛋白也没有解毒剂的合成。但是，由于解毒剂更不稳定，当解毒剂失活后，毒性蛋白就可以起杀伤作用。这些系统使细胞对质粒产生溺爱，并防止细胞丢失质粒。

9．由于基因工程是人为改变遗传信息的操作，因此必须注意被操作基因的安全，进行
严格的监控，质粒载体的安全性是十分重要的。请问质粒载体的安全条件包括哪几
个方面?
答：
(1)非传递性和不被带动转移。对于多数基因克隆操作来说，都不希望载体能够进行自主传递，也不希望被带动转移。
(2)具有条件致死突变，如温度敏感质粒pJC307(ColEl的衍生质粒)在哺乳动物正常体温下就丧失复制能力，可防止克隆基因扩散，只存在于限定的宿主细胞中。(3)一般情况下不希望与宿主染色体发生重组，因为重组后有可能给宿主带来突变。
(4)有较小的宿主范围。

10．为什么野生型的l噬菌体DNA不宜作为基因工程载体?
答：
(1)菌体DNA没有容载能力，因为噬菌体的头部对DNA包装的量是有限制的，不能大于基因组的105％，所以要将l噬菌体改造成载体，必须削减分子量。
(2)野生型的lDNA对于一些常用的酶都有多个识别和切割位点，不便于克隆。
(3)没有可供选择的标记。
(4)野生型的l噬菌体具有感染性，因此不够安全。

11． 什么是蓝白斑筛选法?
．答：
这种方法是根据组织化学的原理来筛选重组体。主要是在l载体的非必要区插入一个带有大肠杆菌b—半乳糖苷酶的基因片段，携带有lac基因片段的l载体转入lac的宿主菌后，在含有5—溴—4—氯—3—引哚—b—D—半乳糖苷(X-gal)平板上形成浅蓝色的噬菌斑。外源基因插

人lac(或lac基因部分被取代)后，重组的噬菌体将丧失分解X-gal的能力，转入lac-宿主菌后，在含有5—溴—4—氯—3—引哚—b—D—半乳糖苷 (X-gal)平板上形成白色的噬菌斑，非重组的噬菌体则为蓝色噬菌斑。

12． 蓝白斑筛选法为什么也会有假阳性?
．答：
b—半乳糖苷酶的N末端是非必需的，，可以进行修饰，并不影响酶的活性或a肽的互 补性。如果插入的外源DNA引起a肽的可读框的改变，或者插入片段在正确的可读框中含有终止密码的话，就会形成白色噬菌斑。如果插入DNA的碱基数正好是3的倍数，或者插入的DNA中不含有终止密码的话，仍然会形成蓝色噬菌斑。这种插入物的长度可达几百个碱基对。M13载体的这种性质可以用来检测和选择产生新的终止密码或改变可读框，即移码突变。

13． M13系列载体具有哪些优缺点?
答
M13克隆系统具有很多优点：
(1)克隆的片段大：M13噬菌体的DNA在包装时不受体积的限制，所以容载能力大，有报道，有些噬菌体颗粒可以包装比野生型丝状噬菌体DNA长6—7倍的DNA(插人片段可达40kb)。
(2)可直接产生单链DNA，这对于DNA测序、DNA诱变、制备特异的单链DNA探针都是十分有用的。
(3)单链DNA和双链DNA都可以转染宿主，并可根据人工加上的选择标记进行筛选。
M13克隆系列的不足：
(1)较大的外源片段插入后，在扩增过程中往往不够稳定，一般说，克隆的片段越大，发生丢失的机率越大。
(2)单链载体分子感染的细胞中，往往是单链和双链混杂，分离双链比较麻烦。

14．黏粒载体具有哪些特点与不足?
主要特点有：
(1)具有质粒复制子，进入寄主细胞后能够像质粒一样进行复制，并且能够被氯霉素扩增。
(2)具有质粒载体的抗生素抗性基因的选择标记。
(3)具有l噬菌体的包装和转导特性。
(4)容载能力大。克隆的最大片段在45kb，最小片段为19kb。
(5)简化了筛选。如果载体的分子量在5kb的话，得到的转导子几乎排除由载体自连的可能性，因为要被成功包装，至少要7个分子的载体自连，尽管如此，也是不能被包装的，因为COS位点太多了。
黏粒载体也有如下不足：(1)如果两个黏粒之间有同源序列，可能会发生重组，结果会使被克隆的片段重排或丢失。
(2)含不同重组DNA片段的菌落生长速度不同，会造成同一个子板上菌落大小不一。另外由于不同大小的插入片段对宿主细胞的作用不同，会造成文库扩增量的比例失调。
(3)包装过程复杂，包装效率不稳定，代价高。

15．辅助噬菌体DNA和相应的噬菌粒是如何协同工作的?
．答：
虽然噬菌粒载体携带有M13的IG区，能够合成单链DNA，但

是它没有M13的功能基因，没有M13基因2的产物存在，所以不能合成单链DNA。而辅助噬菌体具有M13的所有功能基因，但是IG区是缺陷的，辅助噬菌体本身的DNA不能进行单链复制，于是就可以为噬菌粒提供基因2产物和包装蛋白。
辅助噬菌体必需具备如下条件：
(1)助噬菌体的DNA IG区必需失去功能，其本身的DNA不会被包装到成熟的噬菌体颗粒中；
（2）由于辅助噬菌体的IG区失活，其本身的基因不能表达，要使辅助噬菌体的所有功能基因都能进行表达，必须在辅助噬菌体的基因组中导人新的复制起点；
(3)辅助噬菌体的基因组中具有选择标记，便于识别和收集一定数量的辅助噬菌体。

16． 如果知道某一基因的功能及其相应的蛋白质的氨基酸序列组成，可以通过何种方法
克隆该基因?
．答：
可以通过合成核苷酸探针或设计简并PCR引物从cDNA文库或基因组文库中筛选。或者利用相应的抗体从cDNA表达文库中筛选相应的克隆。

17． 什么是基因文库?
答：
基因文库，或克隆文库，是一群细菌克隆，每个克隆含有一个带有某一供体生物不同DNA片段的质粒或噬菌体载体；这群克隆有95％-99％的可能性使基因组DNA的每一片段至少存在于一个克隆中。一个基因文库一旦建立，任一特定的克隆都可被回收用于研究其所携带的基因，因而在需要克隆某一特定基因时就避免了逐个巡查克隆的耗时过程。为减少所要收集的克隆的数目，最普遍采用的载体是l噬菌体的一种衍生载体，它可容纳12~20kb的供体DNA片段，这点与pBR322不同，它可插入的外源DNA最大约为5kb．

18． 什么是基因组文库(genomic library)?构建基因组文库，涉及哪些基本过程?它同遗
传学上的基因库有什么不同?
答：
基因组文库是用基因工程的方法，人工构建的含有某一生物基因组DNA的各种片段 的克隆群。一般以改造的噬菌体DNA或黏粒作为载体，包括下列过程：(1)高分子量染色体DNA的制备；(2)体外重组连接；(3)包装蛋白的制备；(4)重组体的体外包装；(5)将重组DNA导人寄主细胞；(6)筛选。基因组文库同遗传学上所讲的基因库是完全不同的概念。基因库(gene pool)是指在进行有性生殖的某一群体中，能进行生殖的个体所含总的遗传信息。在基因组文库的构建中，由于使用的载体不同，分为噬菌体载体和黏粒载体构建的基因组文库、YAC文库、BAC文库等。

19． 什么是cDNA文库(complementDNAlibrary)?同基因组文库有何差别?
答：
同mRNA互补的DNA称为cDNA。cDNA文库是以某一生物的总mRNA为模板，在无细胞系统中，在反转录酶的作用下，首先合成一互补的DNA, 即第一链，破坏RNA模板后，再以第一链

为模板合成第二链，得到的双链DNA称为cDNA。选用适合的载体，将合成的cDNA重组导人寄主细胞，经筛选得到韵cDNA克隆群称为cDNA文库。由于cDNA技术合成的是不含内含子的功能基因，因此是克隆真核生物基因的一种通用方法。
由于细胞内的基因在表达的时间上并非是统一的，具有发育的阶段性和时间性．有些则需要特殊的环境条件。所以，cDNA文库是不可能构建得十分全，也就是说任何一个cDNA文库都不可能包含某—生物全部编码基因。
cDNA文库与基因组文库的主要差别是：
(1)基因组文库克隆的是任何基因，包括未知功能的DNA序列，cDNA文库克隆的是具有蛋白质产物的结构基因，包括调节基因；
(2)基因组文库克隆的是全部遗传信息，不受时空影响；cDNA文库克隆的是不完全的编码DNA序列，因它受发育和调控因子的影响；
(3)基因组文库中的编码基因是真实基因，含有内含子和外显子；而eDNA克隆的是不含内含子的基因。

20． 黏性末端连接法是最常用的连接方法，具有许多优点，但是也有一些不足，请指出
这些不足之处。
．答：
黏性末端连接法不足之处有：(1)载体易自身环化；(2)若是用同一种限制性内切核酸酶产生的黏性末端连接又不易定向克隆；(3)难插入特定的基因；(4)再者就是大片段DNA的重组率较低，即使用碱性磷酸酶处理了载体，防止了载体的自身环化，载体也有成环的倾向；(5)用这种方法产生的重组体往往含有不止一个外源片段或不止一个载体连接起来的串联重组体，增加筛选工作的困难。

21．什么是同聚物加尾连接法(homopolymer tails joining)?用何种方法加尾?具有哪些优
缺点?
答：
所谓同聚物加尾法就是利用末端转移酶在载体及外源双链DNA的3’端各加上一段寡聚核苷酸，制成人工黏性末端，外源DNA和载体DNA分子要分别加上不同的寡聚核苷酸，如dA(dG)和dT(dC),然后在DNA连接酶的作用下涟接成为重组的DNA。这种方法的核心是利用末端转移酶的功能，将核苷酸转移到双链DNA分子的突出或隐蔽的3'-OH上。以Mg2+作为辅助因子，该酶可以在突出的3'-OH端逐个添加单核苷酸，如果用Co2+作辅助因子则可在隐蔽的或平末端的3'-OH端逐个添加单个核苷酸。
同聚物加尾法实际上是一种人工黏性末端连接法，具有很多优点：．(1)首先不易自身环化，这是因为同一种DNA的两端的尾巴是相同的，所以不存在自身环化。(2)因为载体和外源片段的末端是互补的黏性末端，所以连接效率较高。(3)用任何一种方法制备的DNA都可以用这种方法进行连接。同聚物加尾法也有一些不便之处：(1)方法繁琐；(2)外源片段难以回收。由于添加了许多同聚

物的尾巴，可能会影响外源基因的表达。另外要注意的是，同聚物加尾法同平末端连接法一样，重组连接后往往会产生某种限制性内切核酸酶的切点。

22．何谓接头连接法(1inker ligation)?
答：
将人工合成的或来源于现有质粒的一小段DNA分子(在这一小段DNA分子上有某种限制性内切核酸酶的识别序列)，加到载体或外源DNA的分子上，这样便在载体DNA和外源DNA上制造出新的酶切点。把这一小段含有酶切点的DNA分子称为连接器分子，这种方法称为接头连接法。

23．什么是同裂酶?为什么说用同裂酶进行体外重组效率最高?
．答：
同裂酶是一类识别序列不完全相同，但是产生的黏性末端至少有四个碱基相同的限制性内切核酸酶。用这些限制性内切核酸酶处理载体和外源DNA得到的末端可以通过黏性末端连接法连接。
同裂酶产生的黏性末端虽然可以像完全亲和的黏性末端那样进行连接，但是它与完全亲和的黏性末端连接不同的是，连接后的产物往往失去原有的限制性内切核酸酶的切点，但是能够被另外一种同裂酶识别。这样用同裂酶进行体外重组时，在限制性内切核酸酶切割反应之后不必将原有的内切酶失活，就可直接进行重组连接。由于连接体系中有原有的限制性内切核酸酶的存在，就不会发生载体自连，从而保证了载体同外源DNA的连接。所以在这种连接反应中不必用碱性磷酸酶进行载体的脱磷反应而得到最高的连接效率。
反应中通常要涉及三种不同的限制性内切核酸酶，其中两种是识别六碱基的酶，另一种是识别四碱基的酶。

24．为了大量获得许多用于生化鉴定的产物，你想将拟南芥中的一个序列已知、编码单
体酶蛋白的基因在单细胞微生物中表达，你如何确保最终能得到产物?
答：
由于基因已被测序并进行了分析，因此前体mRNA结构是已知的。这对了解蛋白质的功能区是十分重要的，可以避免有关多肽翻译后加工的一些问题。对于间断基因，cDNA可以用外显子DNA探针通过体外杂交得以鉴定。将拟南芥的基因组DNA或cDNA分别克隆到酵母人工染色体(YAC)上作为定位或筛选的融合标签，基因可以在酵母中作为细胞质蛋白质或分泌蛋白质进行表达。

25．某一质粒载体具有Tetr和Kanr的表型，在Kan抗性基因内有一Bgl I的切点。现用
Bgl I切割该载体进行基因克隆，问：(1)转化后涂皿时应加什么样的抗生素?(2)培
养后长出的菌落具有什么样的抗性基因型?(3)如何利用抗性变化筛选到含有插入片
段的重组体?
答：
(1)加四环素；(2)Tetr Kans和Tetr Kanr；(3)重新点种在含Tet、Kan和只加Tet的平板上，选择只在Tet平板上生长的菌落，

即为所需的重组体。

26． 以pBR322 DNA作为载体，从四环素抗性基因区克隆外源DNA时，可采用环丝氨
酸富集法筛选重组体，说明其基本原理和基本操作过程。
．答：
原理：
由于四环素的作用只是抑制细菌蛋白质的合成，而不是杀死细菌；而氨基酸类似物环丝氨酸如果掺人蛋白质，则是致命的。因此在有四环素的条件下，环丝氨酸能够杀死tetr而不杀死tets的细菌。经过环丝氨酸处理后，存活的细胞中tets型得到很大富集，而经过若干次连续处理，即能获得在tetr基因内含有插人物的质粒的细胞。
基本操作：
(1)转化后有三种表型的细菌，其中只有一种是重组体：AprTcs；
(2)用重组DNA转化受体菌后，将受体菌培养在加有四环素和环丝氨酸的培养液中培养；此时只有非重组的双抗性菌可以生长，其他都被抑制；
(3)由于有环丝氨酸的存在，AprTcs表型的菌生长到一定程度就会死亡；
(4)由于四环素只有抑菌而无杀菌作用，此时若解除四环素(离心洗涤)，加入氨基苄青霉素继续培养，则可使重组体大量生长。

27． 放射性抗体检测法(radioactive antibody test)的基本原理是什么?
答：
这一方法的基本原理是根据抗体、抗原分子的三个基本特性而设计的一种筛选鉴定重组体的方法。这三个基本特性是：
(1)抗体分子可以牢固地吸附在固体基质(如聚乙烯塑料)上而不被洗脱掉；
(2)一个抗原可以同几种不同的抗体结合；
(3)抗体分子可以通过碘化作用被125I标记。

28． 什么是随机引物(random primer)?如何标记DNA?
答：
随机引物是人工合成的长度为6个核苷酸的寡聚核苷酸片段群体，含有各种可能的排列顺序(46=4096)；或是用DNA酶处理小牛胸腺DNA后获得的6—12个碱基的片段。将待标记的DNA片段同随机引物一起进行杂交，并以杂交体上的寡聚核苷酸为引物，在Klenow酶的作用下合成互补DNA链，当反应底物中有放射性的dNTP时，新合成的DNA就带上了标记。

29．什么是印迹(blotting)杂交?
答：
通过一定的物理学方法将DNA或RNA从凝胶上转移到固体支持物，然后同液体中的探针进行杂交。DNA或RNA从凝胶向滤膜转移的过程称为印迹，故此将这种杂交称为印迹杂交。

30．什么是原位菌落杂交(colony hybridization)?
答：
根据微孔滤膜杂交和原位杂交的原理而改良的一种筛选重组体的一种核酸杂交方法。它是将生长在或影印在微孔滤膜上的菌落(或噬菌斑)原位溶菌，原位进行DNA变性并原位固定在滤膜上，然再从参比平板上选取重组体

31．说明Southern杂交的原理和方法。
答：
1975年Southern建立起来的一种杂交方法，属固相—液相杂交。该法的主

要特点是利用毛细现象将DNA转移到固体支持物上，称为Southern转移或Southern印迹 (Southern blotting)。它首先用合适的限制性内切核酸酶将DNA切割，进行电泳分离后，利用干燥的吸水纸产生毛细作用，使液体经过凝胶，从而使DNA片段由液流携带从凝胶转移并结合在固体支持物表面。

32．Northern印迹与Southern印迹有什么不同?
答：
Northern印迹的原理同Southern印迹相比有两点不同：
(1)转移的对象不同，Northern印迹是将RNA变性及电泳分离后，将其转移到固相支持物上的过程。
(2)虽然RNA电泳前不需像DNA那样进行酶切，但也需要变性。不过变性方法是不同的，它不能用碱变性，因为碱变性会导致RNA的降解。

33．建立了一个基因文库后，如何鉴定一个携带目的基因的克隆?
答：带有某一细菌基因的克隆通常可以直接看出来，因为基因表达引起了宿主细胞表型的可见变化。然而，真核生物的基因不都表达，则需用相应的方法来找出带有所需基因特定克隆。一个常用方法是杂交(图A21．1)：
(1)从不同的克隆提取DNA，固定于硝酸纤维素滤膜上，然后用NaOH使之变性(图 A21．1.1)。
(2)探针必须能与所需的基因互补且被32p标记。探针可以是来自另一不同生物体的相关的基因，或是依据与基因特异相关蛋白质的氨基酸序列设计并经化学合成的一小段DNA分子(图A21．1．2)。
(3)探针只会与特定基因进行碱基配对(杂交)，冲洗滤膜后，未结合上的标记探针会被除去(图A21．1.3)。
(4)烘干滤膜后进行放射自显影后，所需的克隆就以一个黑点在胶片上显示出来，这就是菌落或原位杂交分析。

基因工程：是利用重组技术，在体外通过人工“剪切”和“拼接”等方法，对各种生物的核酸（基因）进行改造和重新组合，然后导入微生物或真核细胞内进行无性繁殖，使重组基因在细胞内表达，产生出人类需要的基因产物，或者改造、创造新的生物类型。
限制性内切酶的Star活性：限制性内切酶的识别和酶切活性一般在一定的温度、离子强度、pH等条件下才表现最佳切割能力和位点的专一性。如果改变反应条件就会影响酶的专一性和切割效率，称为星号（*）活性。
T-DNA：是农杆菌侵染植物细胞时，从Ti质粒上切割下来转移到植物细胞的一段DNA。该DNA片段上的基因与肿瘤的形成有关。
受体细胞 ：又称为宿主细胞或寄主细胞等，从试验技术上讲是能摄取外源DNA并使其稳定维持的细胞；从试验目的讲是有应用价值和理论研究价值的细胞
克隆基因的表达：克隆基因的表达为人工修饰的外源基因导入宿主细胞中，在其中进行转录、翻译，产生有生物活性的蛋白质的过程。

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