辣根过氧化物酶固定化载体材料的研究进展

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固定化酶载体的研究现状及其应用

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酶的固定化是用一定的材料将活性酶束缚或限制于一
定的区域内，但仍能进行酶所特有的催化反应，可回收及并重复使用的一种新技术。与水溶酶相比，固定化酶在保持其
质，同时又易于接枝而改性，再加上其来源丰富，成本低廉，制备简单，已成为开发固定化酶载体材料的方法之一。利用
中图分类号：３Ｏ６１
文献标识码：Ａ
文章编号：０３５１（０７０ — ０９０１０－７０２０）２０２ — ３

酶固定化技术的最新研究进展

西安工程大学学报J o u r n a l o f X i a n P o l y t e c h n i c U n i v e r s i t y第38卷第1期(总185期)2024年2月V o l .38,N o .1(S u m.N o .185)引文格式:潘虹,陆天炆,王晓军,等.酶固定化技术的最新研究进展[J ].西安工程大学学报,2024,38(1):83-91.P A N H o n g ,L U T i a n w e n ,WA N G X i a o j u n ,e t a l .R e c e n t a d v a n c e s i n e n z y m e i mm o b i l i z a t i o n t e c h n o l o g y [J ].J o u r n a l o f X i a n P o l y t e c h n i c U n i v e r s i t y,2024,38(1):83-91. 收稿日期:2023-08-06 修回日期:2023-10-21基金项目:陕西省自然科学基础研究计划项目(2021J Q -672㊁2022J Q -117);陕西省教育厅专项科研计划项目(22J K 0399) 通信作者:潘虹(1988 ),女,讲师,博士,研究方向为固定化酶和多孔水凝胶㊂E -m a i l :441595837@q q.c o m 酶固定化技术的最新研究进展潘虹,陆天炆,王晓军,洪一楠(西安工程大学环境与化学工程学院,陕西西安710048)摘要酶作为一种催化性能好且安全可靠的生物催化剂,在食品㊁医药及环境治理等诸多领域得到了广泛应用,但因受限于游离酶较差的环境稳定性而难以实现进一步的工业化应用㊂酶固定化技术有助于提高游离酶对敏感环境的耐受性和操作过程中的稳定性,大大缩减了应用成本㊂回顾了近五年内固定化技术的发展及现状,总结了吸附法㊁结合法等传统固定化方法,共固定化酶法等新型固定化方法,以及天然材料载体㊁复合材料载体和纳米载体等不同固定化载体在各个领域的研究进展㊂相比于游离酶,固定化酶体系在稳定性和重复使用性等方面得到了显著提升,但同时也存在一些不足,如固定后的活性回收率降低㊁载体合成途径繁琐且成本较高以及固定化酶作用机理尚不完善等㊂结合这些不足之处提出了酶固定化技术在未来的发展方向㊂关键词酶固定化;固定化载体;固定化方法;纳米载体;共固定开放科学(资源服务)标识码(O S I D )中图分类号:Q 814.2 文献标志码:AD O I :10.13338/j .i s s n .1674-649x .2024.01.011R e c e n t a d v a n c e s i n e n z y m e i m m o b i l i z a t i o n t e c h n o l o g yP A N H o n g ,L U T i a n w e n ,WA N G X i a o ju n ,H O N G Y i n a n (S c h o o l o f E n v i r o n m e n t a l a n d C h e m i c a l E n g i n e e r i n g ,X i a n P o l y t e c h n i c U n i v e r s i t y,X i a n 710048,C h i n a )A b s t r a c t A s a n e f f i c i e n t a n d s a f e b i o c a t a l y s t ,e n z y m e s h a v e b e e n w i d e l y u s e d i n m a n yf i e l d s s u c h a s f o o d ,m e d i c i n e a n d e n v i r o n m e n t a lg o v e r n a n c e ,b u t i t i s d i f f i c u l t t o r e a l i z e f u r th e ri n d u s t r i a l a p-p l i c a t i o n d u e t o t h e p o o r e n v i r o n m e n t a l s t a b i l i t y o f f r e e e n z y m e s .E n z y m e i mm o b i l i z a t i o n t e c h -n o l o g y h e l p s t o i m p r o v e t h e t o l e r a n c e o f f r e e e n z y m e s t o s e n s i t i v e e n v i r o n m e n t s a n d t h e s t a b i l i t yd u r i n g o pe r a t i o n ,a n d g r e a t l y r e d u c e s t h e a p p l i c a t i o n c o s t .T h i s p a p e r r e v i e w s t h e d e v e l o pm e n t a n d c u r r e n t s i t u a t i o n o f i mm o b i l i z a t i o n t e c h n o l o g yi n t h e p a s t f i v e y e a r s ,a n d s u mm a r i z e s t h e r e -s e a r c h p r o g r e s s o f d i f f e r e n t i mm o b i l i z a t i o n m e t h o d s(i n c l u d i n g t r a d i t i o n a l i mm o b i l i z a t i o n m e t h-o d s s u c h a s a d s o r p t i o n m e t h o d a n d b i n d i n g m e t h o d a n d n e w i mm o b i l i z a t i o n m e t h o d s s u c h a s c o-i mm o b i l i z a t i o n e n z y m e m e t h o d)a n d i mm o b i l i z a t i o n c a r r i e r s(i n c l u d i n g n a t u r a l m a t e r i a l c a r r i e r s, c o m p o s i t e c a r r i e r s a n d n a n o c a r r i e r s)i n v a r i o u s f i e l d s.I n g e n e r a l,c o m p a r e d w i t h f r e e e n z y m e s, t h e i mm o b i l i z e d e n z y m e s y s t e m h a s b e e n s i g n i f i c a n t l y i m p r o v e d i n t e r m s o f s t a b i l i t y a n d r e u s-a b i l i t y.H o w e v e r,t h e r e a r e s o m e s h o r t c o m i n g s,s u c h a s l o w e r r e c o v e r y r a t e a f t e r i mm o b i l i z a-t i o n,c u m b e r s o m e a n d c o s t l y c a r r i e r s y n t h e s i s p a t h w a y,a n d i m p e r f e c t m e c h a n i s m o f i mm o b i l i z a-t i o n e n z y m e.F i n a l l y,t h e d e v e l o p m e n t d i r e c t i o n o f t h e t e c h n o l o g y i n t h e f u t u r e w a s p u t f o r w a r d b a s e d o n t h e s e s h o r t c o m i n g s.K e y w o r d s e n z y m e i mm o b i l i z a t i o n;i mm o b i l i z a t i o n c a r r i e r s;i mm o b i l i z a t i o n m e t h o d;n a n o c a r r i-e r s;c o-i mm o b i l i z a t i o n0引言生物酶是一类具有催化效率高㊁专一性强的生物催化剂[1],其本质是一种蛋白质㊂因此,生物酶通常需在常温常压等温和条件下才能表现出其高催化性能,当离开特定环境就会出现酶活性和稳定性迅速降低的缺点[2]㊂活性炭可以吸附蔗糖酶进行蔗糖水解,且保持了蔗糖酶较好的催化活性[3]㊂由此,固定化酶的思想被首次提出㊂随后,研究人员开始通过一系列酶固定化技术来改善游离酶存在的缺点㊂酶固定化技术就是指将游离酶通过一定的技术手段固定在某些不溶性载体上,进而使其在敏感环境下仍然表现出较高的稳定性和酶活性[4]㊂经固定化后的酶,可以借助载体的保护作用或者与载体之间相互作用,保护了酶蛋白的空间构象[5],进而提高了对p H㊁温度㊁重金属离子等影响因素的耐受性㊂同时,固定化酶可以通过简单的离心过滤等手段从反应体系中分离出来,促进漆酶的回收和重复使用[6]㊂目前,固定化酶技术已经在食品加工[7]㊁生物传感器[8]㊁纺织印染废水处理[9-10]㊁生物漂白[11]等诸多领域得到广泛的应用,其固定化技术也表现出愈发成熟的发展㊂本文综述了近五年酶固定化技术的发展,重点表现在固定化方法和固定化载体上,以及酶固定化技术在多个领域的应用㊂1酶固定化方法酶固定化方法可分为传统固定化方法和新型固定化方法㊂表1列出来近五年的一些酶固定化技术所用的方法㊂表1固定化酶所用固定化方法T a b.1I mm o b i l i z a t i o n m e t h o d s u s e d i n d i f f e r e n t i mm o b i l i z a t i o n t e c h n i q u e s固定化方法固定化对象载体材料参考文献传统固定化方法吸附法漆酶/α-淀粉酶生物炭/复合晶凝胶[12-13]共价结合法脂肪酶M I L-53(F e)/球形S i O2[14-15]化学交联法漆酶/葡萄糖淀粉酶磁性纳米粒/纳米S i O2[16-19]包埋法漆酶海藻酸铜微球[20]新型固定化方法吸附-交联法脂肪酶/β-葡糖糖苷酶大孔树脂/纳米S i O2[21-22]吸附-包埋法多种酶/纤维素酶多孔淀粉-阿拉伯胶微囊体/仿生S i O2[23-24]交联-包埋法漆酶聚集体介孔S i O2[25]脂肪酶/磷脂酶聚乙烯亚胺[26]共固定法葡萄糖淀粉酶/葡萄糖氧化酶S i O2[27]葡萄糖氧化酶/辣根过氧化物酶磁性聚乙二醇微凝胶颗粒[28]1.1传统固定化方法1.1.1吸附法吸附法即物理吸附,物理吸附是一种简单易行的方法,通过氢键㊁疏水作用和范德华力等相互作用48西安工程大学学报第38卷使酶吸附到不溶于水的载体表面,该方法操作步骤简洁且不需要额外添加化学试剂,但其固定效果较差且容易受外界条件影响[29]㊂WA N G等采用吸附法将漆酶固定在碱改性生物炭(A-M B)上实现对孔雀石绿(MG)的吸附降解,结果表明,A-M B对MG 表现出最大吸附量757.58m g/g,固定化漆酶A/l a c @A-M B对MG的去除率可达97.70%,10次循环后仍然表现出超过75%的去除率[12]㊂A C E T等以沸石颗粒(P P A)为原料,通过简单方法制备了C u2+-A P P a C包埋型复合晶凝胶(C u2+-A P P a C)用于α-淀粉酶吸附固定,结果表明,α-淀粉酶最大吸附量可达858.7m g/g,同时相较于游离酶,其操作稳定性和存储稳定性也表现出明显的优势[13]㊂1.1.2结合法结合法是利用酶的侧链基团与载体表面的基团发生反应形成共价键,利用共价键将酶固定在载体上[30]㊂G H A S E M I等将M I L-53(F e)通过表面官能化对2种脂肪酶进行共价固定,结果显示脂肪酶固定化体系虽然没有实现对酶的高负载,但仍然表现出更广泛的温度和p H值稳定性,同时实现了酶的可重复使用能力和稳定性的显著改善[14]㊂此外,共价结合法由于化学键的形成,容易使酶的蛋白质构象发生改变,从而降低酶活性[31]㊂F A N等采用戊二醛多点共价结合法和吸附-交联法,以球形二氧化硅为载体,固定化皱纹假丝酵母脂肪酶(C R L),结果表明,多点共价处理后脂肪酶二级结构发生变化,使酶的残余活力下降[15]㊂但相比之下,共价结合法制备的酶体系具有更好的重复使用性和稳定性,使其在酸化油脂催化水解中更有潜力㊂1.1.3化学交联法交联法是通过一些双功能试剂将酶和载体进行连接[31],主要用到的交联剂有戊二醛㊁1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(E D C)㊁二醛淀粉和二醛纤维素[30,32-33]等㊂C H E N等以戊二醛作为交联剂制备了一种具有超顺磁性的固定化漆酶F e3O4@S i O2-N H2-L a c,该固定化体系表现出了良好的稳定性,对有机溶剂㊁金属离子有显著的耐受性和良好的循环使用性,同时在对酚类化合物的去除降解方面也表现出巨大的潜力[16]㊂Q I U等以二醛淀粉为交联剂,采用共价固定法将漆酶在离子液体改性的磁性纳米载体上进行固定,较于其他固定化漆酶,在处理含酚废水中表现出更大优势[17]㊂然而常见的交联剂在固定化过程往往会表现出一定的负面影响[34],为此研究人员着手发掘绿色安全的新型交联剂来避免这种负面影响㊂例如,O U Y A N G等提出了一种新的绿色高效固定化酶的方法京尼平苷酶解物作为交联剂固定化漆酶[18]㊂与直接使用京尼平或戊二醛作为交联剂,该方法绿色㊁安全,可应用于需要严格控制毒性的食品和医药行业㊂D A N I E L L I等研究了一种双功能交联剂2,5-二甲酰基呋喃(D F F)将葡糖淀粉酶固定在氨基官能化甲基丙烯酸树脂上[19]㊂使用海洋细菌费氏弧菌进行了生态毒性测定,相比于戊二醛,D F F表现出更低的生物毒性㊂1.1.4包埋法包埋法是将酶固定在聚合物材料的网格结构或微囊结构等多空隙载体中[35]㊂这种方法可以提供更好的保护和稳定性,限制了酶的扩散㊂但同时也存在孔隙的扩散阻碍,使得该方法的循环使用效率下降㊂例如,L A T I F等采用包埋法将漆酶固定化在海藻酸铜微球上进行双酚A的降解[20]㊂相比于游离酶,固定化漆酶表现出更高的p H㊁温度稳定性及储存稳定性,但在循环使用5次后剩余酶活降到了21.5%㊂1.2新型固定化方法1.2.1传统固定化方法的改进传统的单一固定化方法进行酶固定往往存在各自的缺点,因此出现了将单一方法进行两两结合来固定化酶的改进方法㊂常见的包括吸附-交联法[21-22]㊁吸附-包埋法[23-24]㊁交联-包埋法[25]等㊂例如,F A T H A L I等以介孔二氧化硅为载体,采用交联-包埋相结合的固定化方法制备了包埋交联漆酶聚集体(E-C L E A)[25]㊂相对于游离漆酶,条件优化后的固定化漆酶显示出较好的热稳定性和p H稳定性㊂此外E-C L E A存储21d仍然具有较高的相对活性,在重复使用20次后,其活性保持率可达初始活性的79%㊂对污染废水中苯酚的去除率可达73%[25]㊂1.2.2共固定化酶法共固定化酶是指将多种酶同时固定化在同一载体上的一种方法㊂A R A N A-P EÑA等实现了将5种酶进行逐层固定化的策略,使得整个固定化酶体系的活性明显增强[26]㊂与单一酶的固定化相比,共固定化酶法通常具有更大的优势㊂在保证了固定化后酶稳定性提高的同时,不同酶在共固定后,由于处于58第1期潘虹,等:酶固定化技术的最新研究进展同一载体上,酶之间可以发挥协同作用,且反应底物可以连续在酶之间传递,从而简化了反应步骤㊂G A O等制备了一种化学酶级联反应体系(G A&G O x@A u-S i O2),实现葡萄糖淀粉酶(G A)和葡萄糖氧化酶(G O x)共固定化[27]㊂借助于双酶和载体之间的级联效应,实现了从可溶性淀粉中高效提取葡萄糖酸㊂在保证了固定化双酶稳定性的同时,A u的加入可以使中间产物H2O2快速脱除,显著提高固定化体系的重复利用率㊂类似地,L I U等制备了一种具有可逆热响应释放的双酶固定化体系共固定G O x和辣根过氧化物酶(H R P),在葡萄糖浓度检测过程中表现出优于单酶检测试剂盒的良好性能[28]㊂此外,有学者研究发现,对于如漆酶这种绿色催化剂,较低的氧化还原电位大大限制了其在各个领域中的应用㊂但发现在固定化体系中引入具有高氧化还原电位的介体可以弥补漆酶的这一不足[36]㊂L O U等基于MO F s膜实现了漆酶和介体A B T S的共固定化,结果显示,固定化漆酶的底物亲和力要高于游离漆酶[37]㊂2酶固定化载体用于酶固定化的载体主要包括天然载体㊁人工合成载体和纳米载体,见表2㊂在选择固定化载体时要充分考虑具体的应用领域和需求等㊂表2固定化酶所用载体材料T a b.2 C a r r i e r s f o r i mm o b i l i z e d e n z y m e材料类别载体材料固定化对象固定化方法参考文献天然材料羧甲基纤维素漆酶包埋法[38]琼脂糖脂肪酶吸附法[39]磁性壳聚糖葡萄糖氧化酶共价结合法[40]藻酸盐脱氢酶/蛋白酶吸附法/包埋法[41-42]壳聚糖-黏土复合微球漆酶+介体包埋法[43]海藻酸钠-壳聚糖中性蛋白酶包埋法[44]人工合成材料改性二氧化硅乳酸脱氢酶/碳酸酐酶/甲酸脱氢酶化学交联法/共价结合法[45-47]二氧化钛漆酶吸附法[48]硅酸盐漆酶/葡萄糖氧化酶吸附-共价结合法/吸附法[49-50]氧化铝漆酶共价结合法[51]聚酰胺-胺树枝状大分子脂肪酶化学交联法[52]聚乙烯醇水凝胶-硅胶烯还原酶包埋法[53]二氧化硅-壳聚糖漆酶共价结合法[54]纳米材料磁性纳米粒子漆酶共价结合法[55]金属有机框架MO F s漆酶化学交联法[56]介孔Z I F-8过氧化物酶化学交联法[57]中空微球漆酶吸附法[58]共价有机框架C O F葡萄糖氧化酶+F e3O4吸附法[59]金属酚醛网络M P N酒精脱氢酶吸附法[60]磁性纳米颗粒漆酶+介体A B T S吸附法[61]2.1天然载体材料天然载体最大的优点就是来源广泛㊁低成本和低生物毒性㊂常用的天然载体有纤维素[38]㊁琼脂糖[39]㊁壳聚糖[40]和藻酸盐[41-42]等㊂同时,将天然载体杂化后用于酶固定化可以表现出更优良的固定化能力㊂M E H A N D I A[43]等利用天然载体制备了壳聚糖-黏土复合微球(C C B-L),采用包埋法对漆酶和介体进行共固定㊂微球在洗涤和储存期间均未观察到酶泄漏㊂同时固定化漆酶-介体体系通过填充床反应器系统(P B R S),对纺织废水的脱色率可达78%,C O D㊁B O D以及毒性水平均下降㊂类似地, B A I等将海藻酸钠和壳聚糖交联形成复合凝胶球,采用包埋法固定中性蛋白酶[44]㊂固定化酶在较宽的p H(5~8)和温度(30~80ħ)范围表现出高于游离酶的相对活性,循环使用性和存储稳定性也保持在良好水平㊂68西安工程大学学报第38卷2.2人工合成载体材料2.2.1无机材料无机材料来源广泛㊁合成简单㊁机械强度高,可以直接用于酶的固定㊂常见的无机材料有二氧化硅[45]㊁二氧化钛[48]㊁硅酸盐[49-50]和氧化铝[51]等㊂为了提高固定化效率,常常会先对无机材料进行表面改性再用于固定化㊂Z H A I等使用聚乙烯亚胺(P E I)和多巴胺的共沉积对二氧化硅微球进行改性,用于C O2酶促转化甲酸盐㊂优化后P D A/P E I-S i O2载体使得甲酸盐合成的初始反应速率从13.4倍增加至27.2倍㊂再通过固定化碳酸酐酶(C A)后,甲酸盐的合成速率增加到48.6倍[46]㊂随后,L I U等同样对S i O2微球进行P E I的表面改性后用来固定化甲酸脱氢酶,同样实现了C O2酶促转化甲酸盐的高效合成[47]㊂2.2.2高分子材料人工合成的高分子材料具有良好的结构刚性和其他优良的力学性能㊂如聚酰胺㊁聚乙烯醇等具有良好的固定化能力㊂Z H A O等采用3种胺类试剂将聚酰胺-胺树枝状大分子(P AMAM)接枝到F e3O4纳米粒子上,利用戊二醛作为交联剂得到了不同代数的F e3O4@S i O2/P AMAM磁性纳米载体[52]㊂固定化酶表现出相对游离酶更高的活性,而且改善了其在更宽的p H和温度范围内的耐受性㊂A L A GÖZ等先用聚乙烯醇水凝胶包裹烯还原酶(E R),再固定到氨基官能化的硅胶上㊂包埋后的E R比游离E R的热稳定性高34.4倍㊂在重复使用10次后,固定后的E R仍保持其初始活性的85%[53]㊂2.2.3复合材料针对有机㊁无机材料在实际应用中存在的不足,不少文献报道了将2类材料通过物理或化学手段进行复合得到新型复合材料,可以得到性能更优的固定化载体㊂例如,G I R E L L I等将二氧化硅和壳聚糖杂化得到复合材料,相比单材料拥有更好的机械强度㊁热稳定性及生物相容性㊂存储30d后仍具有大于70%的相对活性㊂对漆酶进行固定化后,固定化率达到92%,在较宽的温度和p H范围内固定化后漆酶表现出的稳定性也要高于游离漆酶,重复循环利用15次剩余活性仍在61%以上[54]㊂2.3纳米材料载体纳米材料凭借其小尺寸㊁高表面积和易改性等特点,成为了酶固定化载体研究的焦点㊂各种改性后的纳米材料也在酶固定化领域得到蓬勃发展㊂2.3.1磁性纳米载体磁性纳米载体是一种可以通过外部磁场实现固定化酶快速分离的良好材料㊂凭借这种磁学性质和低生物毒性[16],其在固定化载体的选择上表现突出㊂F e3O4是被广泛使用的一种磁性材料㊂但由于纯F e3O4自身的表面惰性和高团聚,往往需要对其进行表面改性后再应用于固定化㊂R A N等制备了一种壳核结构的磁性纳米载体F e3O4@M o S2@P E I 用于漆酶固定㊂在二硫化钼(M o S2)和聚乙烯亚胺(P E I)的修饰下,磁性载体拥有较大的比表面积并减弱了自身团聚效应,对漆酶的负载量可达120m g/g,酶活回收率可达90%,同时对于水中持久性致癌有机污染物也表现出了良好的降解效率[55]㊂2.3.2介孔纳米载体介孔材料作为一种多孔材料,凭借多孔结构和大的比表面积,也是酶固定化的理想载体㊂金属有机框架(MO F s)[56]凭借着可调控的孔径和较大的比表面积在酶固定化方面得到广泛应用㊂L I等采用水热法合成氨基官能化的MO F材料制备固定化漆酶,在最优条件下实现了95%的刚果红去除率,6次循环后降解率仍达到84.63%[56]㊂L U等以酵母为生物模板,将Z I F-8自组装到酵母上得到杂合Y@ Z I F-8,再用交联剂固定过氧化物酶得到Y@Z I F-8 @t-C A T㊂固定化酶的温度㊁p H耐受性得到提高,更值得一提的是固定化酶在存储45d后活性仍保持在99%以上[57]㊂除此以外,T A N G等还制备了具有中空结构的共价有机骨架微球(H-C O F-OM e)[58]㊂这种孔缺陷的中空结构有助于加快反应物的扩散,从而改善催化反应过程,对四环素具有优秀的降解效果㊂2.3.3金属纳米载体金属纳米材料由于引入了金属离子,可以提高载体的理化性质,在酶固定化过程中表现出重要作用㊂F U等将F e3+/F e2+固定到纳米花形的共价有机框架(C O F)中实现了固定化酶的磁分离[59]㊂L I 等研究了以磁性F e3O4为核,将单宁酸(T A)与不同类型金属离子(C u㊁F e㊁Z n㊁M n㊁A u)配位获得了用于固定化的金属酚醛网络(M P N)涂层[60]㊂不同金属离子的不同极化能力对M P N涂层的亲水性和疏水性造成影响,从而给酶的固定化效率㊁催化活性78第1期潘虹,等:酶固定化技术的最新研究进展和稳定性带来影响㊂对于漆酶而言,引入C u2+对漆酶的活性中心具有正向的促进作用,可以大大提高固定化漆酶的催化活性和底物亲和力[61]㊂3结论与展望生物酶作为一种极具潜力的生物催化剂,通过固定化技术使其在污染物的降解㊁食品加工㊁生物传感器等诸多领域得到了广泛应用㊂酶固定化技术促使酶在较宽的p H值和温度范围下表现出更优良的催化活性,大大提高了生物酶在敏感环境下的稳定性,实现了生物酶的可分离性及循环使用性㊂但目前看来,酶固定化技术依然存在一些不足㊂1)酶在固定化后,由于载体的存在使得底物扩散受阻,无法与酶充分接触,导致酶活性降低㊂可以通过基因工程技术从酶本身出发,利用定点突变或基因重组改变酶结构来提高酶活㊂同时,通过掺杂合适的单一过渡金属离子或多金属离子协同作用激发酶活也值得深入研究㊂2)目前固定化酶技术在污染物降解等领域的实际应用已经颇为成熟,但对于更深层次的作用机制还停留在较为浅薄的层面㊂在未来,随着生物信息技术的不断发展,将固定化酶技术与计算机模拟技术交叉,利用计算机软件模拟分析更深层次的机制原理,可以更好地掌握酶固定化技术㊂3)酶固定化技术仍处在实验室研究阶段,在实现更大规模的工业化应用仍然存在较大的挑战㊂同时,考虑到有些固定化载体制备的时间成本和资金成本,载体若仅用于一次固定化后就无法回收再利用就会造成过度浪费㊂如何实现固定化酶失活后固定化载体与酶的高效分离,从而实现载体的循环使用是一个新的挑战㊂因此,酶固定化技术仍然处在不断发展进步的阶段,需要更多的科研者来完善研究㊂参考文献(R e f e r e n c e s)[1]刘茹,焦成瑾,杨玲娟,等.酶固定化研究进展[J].食品安全质量检测学报,2021,12(5):1861-1869.L I U R,J I A O C J,Y A N G L J,e t a l.A d v a n c e s o f e n-z y m e i mm o b i l i z a t i o n[J].J o u r n a l o f F o o d S a f e t y&Q u a l i t 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辣根过氧化物酶酶学特性及应用进展

形式下，一些键才是稳定的，这是通过氢键与远端
性（ＨＲＰ — Ｄ，一Ｅ）含糖量较低，ｐ，值在１０．６＞１２范围
内。１９９０年Ｓｍｉｔｈ等最早成功研制出重组酶，而且对ＨＲＰ — Ｃ的结构和功能研究有了重大的进展。１９９７年，Ｇａｊｈｅｄｅ等人通过ｘ射线晶体学解出了ＨＲＰ的三维结构，２００２年贝里隆德等嘲人描述出酶
收稿日期：２０１４－０２－１５
血红素Ａｒｇ３８（远端精氨酸）和Ｈｉｓ４２（远端组氨酸）的氨基酸侧链之间的相互作用。２个钙原子的结合
位点分别位于血红素平面的远端和近端，并且通过氢键被连接到血红素结合区。每个钙原子结合位
Ａｕｇ２０１４
文章编号：１６７４ — ０８７４ｆ２Ｏ１４１Ｏ４一（）０３０一Ｏ５
辣根过氧化物酶酶学特性及应用进展
张丽华，蒋俊峰
（山西大同大学化学与环境工程学院，山西大同０３７００９）
催化循环的高分辨率中间体。ＨＲＰ — Ｃ含有２种不同类型的金属中心，铁（ＩＩＩ）原卟啉ＩＸ（通常被称为
“ 血红素 ” ）和２个钙原子（图１，２）。
化物酶也是一种利用过氧化氢可以氧化大多数有机物和无机物的血红素酶。由于其比活性高、耐热性高、酸碱稳定性好，对污染物浓度和盐度都有较高的耐受性，与抗原或抗体偶联后，活性损失很少，因此被广泛用于污水处理、食品工业、有机合成和分析检测等领域。本文介绍了ＨＲＰ的结构、固定化及其在各个领域中的应用，并对其应用前景进

固定化酶载体材料的研究进展

1 对固定化酶载体材料性能要求
存和操作稳定性，酶活性损失较小。
成性质稳定、生物相容性高、并且具有高强度、
由于固定化酶载体材料对酶的性质影响
2.2 合成有机高分子载体
适于工业化生产的固定化酶载体材料，仍然是
极大，因此，对载体材料的种类和性能要求十分
合成有机高分子材料由于其化学、物理性固定化酶技术研究领域的重要课题。
天然多糖类化合物比较适合担当酶的载 PCVA 进行交联反应，得亲水性显著改善的球学报，1998(2):66-68.
体材料，此类材料具有无毒，传质性能好和丰富状载体，载体与胰蛋白酶进行偶联反应制备了 [5]潘丽军，陈实公，赵妍嫣.多孔淀粉接枝聚合
易的等特点，主要有壳聚糖、海藻酸钠和淀粉固定化胰蛋白酶，该固定化酶的比活大幅提高。物为载体固定化纤维素酶的研究[J].食品科学,
效果，近年来也有学者通过制备磁性壳聚糖微程度提高。
球固定化酶，从而达到比较好的分离效果。如王
2.3 无机载体
[8]钱军民，李旭祥.HEC/SiO2 凝胶复合物包埋固定化葡萄糖氧化酶的研究 [J]. 应用化学，2002,
斌等[3]利用反相总浮交联法制备磁性壳聚糖微
无机载体具有一些有机材料不具备的优 19(2)：153-157.
学等生命科学等领域的研究异常活跃，并得到对酶有一定的保护作用，易接枝，并对酶热处理丙烯酸羟乙酯的共聚体系中加人磁流体，制得
迅速发展和广泛的应用。在固定化酶技术中，载一段时间后，酶的活力最大可提高 40%，这为苯乙烯磁性微球，利用碳化二亚胺法固定中性
体材料的结构和性能对酶的活性保持及应用至工业应用提供了一条新途径。例如，以淀粉接枝蛋白酶，发现粒径越小，固定化酶的活性越高。

酶固定化技术的研究进展

的固定化酶研究中，非常关键的一个方面就是定向固定化酶技
酶分子和交联试剂之间，将不同的材料添加于交联体系中，再加上一些不同的交联条件，从而产生固定化酶。交联法往往不会独立存在，通常作为其他固定化方法的辅助手段。
包埋法指的是混合载体和酶溶液，加入一些引发剂，使其
体和固定化酶，稳定性和重复使用性较好，因此，目前应用比较
广泛。但是，这种方法有着剧烈的反应，会严重损失固定化酶的
活性。
２新型酶固定化方法
在开发新型酶固定化方法时，需要遵循以下原则：在进行酶的固定化时，需要在比较温和的条件下实现，并且在酶活力损失方面，也需要最大限度地减少，甚至避免。在制备高活性固
１传统的酶固定化方法
很多的高度激发原子、分子和离子等，在常温下存在着大量的
等离子体。等离子体可以自由修饰载体材料表面，从而实现活
性基团引入的目的。Ｐｕｌｅｏ等将钛合金Ｔｉ一６Ａｖ表面用丙烯
传统的酶固定化方法主要包括四个类型，分别是吸附法、
定化技术，并且得到了快速的发展［】】。酶固定化技术指的是采用
离子体等。ｔＷＣｓ为辐射源，利用射线在尼龙膜表面共聚甲基丙烯酸甲酯接枝，进一步活化，就可以固定青霉素酚化酶。光偶联单体聚合物包埋具有光敏基团载体的共价固定化酶或者普通的固定化酶，在温和的条件下实现转化，因此获得的固定化酶
其是使用光敏性和催化活性等等；但是，游离状态的酶对很多物质却有着较差法是获得具有较高活力固定化酶的一种方法，

酶固定化载体的性能研究

酶固定化载体的性能研究摘要：固定化酶可以提高游离酶的稳定性，而且利于回收，能提高酶的循环利用率。

选择大孔吸附树脂HPD750和大孔离子交换树脂DK110两种填料作为载体，利用交联吸附法固定化括环酶，并对比酶液加入量、温度和固定化时间对两种载体的影响。

结果表明，吸附树脂最适固定化温度为35℃，离子交换树脂最适固定化温度为40℃。

对于固定化时间，吸附树脂固定6h时达到最大酶活，离子交换树脂在4h时达到最大酶活。

两种树脂在相同的酶液加入量时离子交换树脂的酶活更高。

经过比较，离子交换树脂的固定化效果最优。

关键词：扩环酶；树脂；固定化；酶活酶工程属于生物技术，是利用生物酶分子作催化剂，解决酶在化工、医药、轻工、能源、食品和环境工程等方面实际应用的相关技术[1]。

酶的催化作用具有专一性，催化效率高，可以在温和条件下进行反应，副产物少，具有很强的市场竞争力和发展前景[2]。

根据酶的使用形式不同，可以分为固定化酶和游离酶。

游离酶易溶于水,与底物作用面积大，反应充分，但是游离酶的稳定性差，在高温、酸碱和有机溶剂环境中容易失活，而且与底物难以分离，不能反复使用，不利于工业化生产[3]。

为了解决游离酶的缺陷，科研人员将酶固定在载体上以提高其稳定性，达到回收再使用的目的[4]。

酶固定化是将游离酶束缚在一定空间或一不溶性载体上，限制游离酶自由流动[5]。

酶固定后，与固定基质间相互作用可能会改变酶催化活性中心以外的空间结构，由此改善酶在强酸强碱、高温或有机溶剂中的稳定性，同时还可以从酶反应体系中分离目标产物[6]。

这样，固定化酶可通过简单的机械分离或离心被移除，从而不再需要使用复杂的透析等产物分析技术[7]。

酶固定化最大的优势在于可产生一种新的酶系统，该系统可在连续催化反应循环中重复使用，降低生产成本[8]。

固定化在抗生素产业的发展中起着关键作用，而载体的设计与及其固定化方法是固定化能否充分发挥其潜力并被广泛扩展应用范围的关键所在。

辣根过氧化物酶活性的电化学研究

辣根过氧化物酶活性的电化学研究
张四方王春涛张亚媛安小花
（原师范学院化学系，太山西太原００３）３０１
［要］将辣根过氧化酶固定在铜电极的表面制成酶电极，用循环伏安法从ｐ值、集时摘利Ｈ富间、ｚＨ０浓度三方面寻求酶活性的最佳条件，出ｐ一６７富集时闯为２ｉ时，的活性最得Ｈ．，５ｍｎ酶
展有限公司）邻苯二胺（津市光复精细化工研究所）３的双氧水（津市大毛化学试剂厂）同浓度的；天；０天不
Ｈ用３０采０％的双氧水稀释而成，的浓度采用高锰酸钾法标定；有试剂均为分析纯，验用水均ＨＯ所实
第９卷第４期太原师范学院学报（然科学版）自２１００年１２月ＪＯＵＲＮＡＬＯＦＴＡＩＹＵＡＮ）Ｎ（ＲＭＡＩＵＮＩＶＥＲＳＴＹ（ｔｒｌｃｅｃｉｏ）ＩＮａｕａＳｉｎｅＥｄｔｎｉ
Ｖｏ．Ｎ．１９ｏ４Ｄｅ．２１ｃ００
大，Ｈ）且（浓度在１．０× １～４０× １ｔｏｌ之间呈良好的线性关系．０．０ｏ／Ｉ
［键词］关
辣根过氧化物酶；的活性；环伏安法酶循
‘
［章编号］１７ — ０７２１）４００一４［图分类号］文６２２２（０００ — １０Ｏ中

共固定化辣根过氧化物酶的最新研究进展

ＡｂｔａｔｓｒｃＨｏｓｒｄｓｅｏｉａｅｈｓｂｅｄｌｓｄｉｈｒａｏｎｌｔａｅｅｔｎｒｅａｉｈｐｒｘｄｓａｅｎｗｉｅｙｕｅｎｔｅａｅｆａａｙｉｌｄｔｃｉ，ｏｇｎｃｓｎｈｓｓｃｏｒａｉｙｔｅｉ
ＧＬＯＤ，ｅｃｎｔｙｅｅｂｕ，ｔｉｎｎ，ａｉｎｅ，ｗｈｃｒｏ－ｎｙｅＩｄｉｉｎｔｅｐｏｐｃｓｏｈｐｌｔ，ａｄｍｅｈｌｎｌｅｈｏｉｅｎｌｅｒｄｉｉｈａｅｎｎｅｚｍ．ｎａｄｔ，ｈｒｓｅｔｆｔｅａｐｉｏ — ｃｔｎｆｈｒｅａｉｈｐｒｘｄｓＯｉａｉｓｏｏｓｒｄｓｅｏｉａｅＣ —ｍｍｏｉｚｔｎｉｔｅｒａ，ｓｃｓｏｇｎｃｓｎｈｓｓａｅｐｏｏｅ．ｏｂｌａｉｎｏｈｒａｅｓｕｈａｒａｉｙｔｅｉｒｒｐｓｄｉｏＫｅｒｓｙｗｏｄｈｒｅａｉｈｐｒｘｄｓ，ｃ－ｏｓｒｄｓｅｏｉａｅｏｉｍｍｏｉｚｔｎ，ｅｚｅｅｇｎｅｉｇｂｌａｉｉｏｎｙｎｉｅｒｎｍ
１１ＨＲ．Ｐ和葡萄糖氧化酶的共固定化
葡萄糖氧化酶（（）ＨＰ共固定是最常见的共固定Ｇ）和ＲＤ体系，们存在着如下所示的反应偶联：它
ｂｏｒｎｆｒｔｎａｄｆｏｄｓｒｉｔａｓｏｍａｉｎｏｄｉｕｔｙ，ｅｃｏｎｔ．Ｃｕｒｎｌ，ｔｅｒｓａｃｏｕｅｎｔｅｂｏｅｓｒａｅ．Ｔｈａｅｔｅｅｒｈｒｅｔｙｈｅｅｒｈｉｆｃｓｄｏｈｉｓｎｏｒａｓｅｌｔｓｓａｃｒｄｖｌｐｅｔｆｉｏｉｅｅｏｍｎｓｏｔｃ－ｍｍｏｉｚｔｏｔｎｙｒｕｓｂｌａｉｎｗｉｈｅｚｍｅａｅｓｍｍａｉｅ，ｉｃｕｉｇｇｕｏｅｏｉａｅｈｌｓｅｏｘｄｓ，Ｉｉｒｚｄｎｌｄｎｌｃｓｘｄｓ，ｃｏｅｔｒｌｉａｅ．ｏ－

聚苯乙烯微孔膜固载辣根过氧化物酶降解苯酚

１２实验方法．
定化后稳定性大大提高，可重复或连续使用，这
样不仅降低了废水处理的成本，而且还避免了蛋白质的污染等问题 … ．随着科学技术的发展，固定化的载体材料已从最初的天然高分子材料发展到合成高分子材料、机材料以及复合材料无等．多孔的高分子化合物具有表面积大，化学稳定性高，有更好的疏水性和生物兼容性，具可
配置溶液质量浓度为５Ｌ将载玻片在超声０．波清洗器中依次用重铬酸钾洗液、乙醇及蒸馏水充分清洗，干备用．温下，相对湿度６烘室在５％条件下，移液器移取约８Ｌ聚合物溶液浇铸用０在载玻片上，即用经水饱和的湿空气吹拂溶液立表面，空气流量６０ｍ／ｎ待溶剂和水挥发完０Ｌｍｉ，毕后，制得Ｐｓ微孔膜．蒸馏水冲洗，微孔膜用使从载玻片上脱落，室温下烘干待用．
定化条件如酶溶液质量浓度、定化时间对ＨＲ固Ｐ酶活性的影响，及固定化ＨＰ酶催化氧化苯酚以Ｒ
性能．结果显示，固定化ＨＰ适宜酶溶液质量浓度为ｌＬ，Ｒ固定化时间３ｈ固定化ＨＰ酶催化氧．Ｒ
第２６卷
２０１０３２．
第１期
沈
阳
化
工
大
学
学
报
Ｖｏ．６Ｎｏ１１２．
Ｍａ．Ｏｌｒ２２
ＪＯＵＲＮＡＬＨＥＯＦＳＮＹＡＮＧＵＮＩＶＥＲＳＹ Ⅱ ＯＦＣＨＥＭＩＣＡＬＴＥＣＨＮＯＬｏＧＹ

固定化酶载体的研究进展

固定化酶载体的研究进展牛亚楠;侯红萍【摘要】As an important part of immobilized enzymes technology, the structure and the properties of carrier would influence directly catalysis activity and operation stability of immobilized enzyme. In this paper, the research progress in carrier materials for immobilized enzymes at home and abroad in recent years and its development trend were reviewed.%作为固定化酶技术的重要组成部分，载体的结构及性能在很大程度上直接影响着固定化酶的催化活性及操作稳定性。

综述了近年来国内外有关固定化酶载体材料的研究现状和发展趋势。

【期刊名称】《酿酒科技》【年(卷),期】2011(000)009【总页数】3页(P97-99)【关键词】固定化酶;载体;研究进展【作者】牛亚楠;侯红萍【作者单位】山西农业大学食品科学与工程学院,山西太谷030801;山西农业大学食品科学与工程学院,山西太谷030801【正文语种】中文【中图分类】Q814载体材料的选择是决定酶能否成功固定化以及固定化酶活力高低的重要因素。

酶蛋白的活性中心是酶催化活性所必需的，酶蛋白的空间结构也与酶活力密切相关，因而，在固定化的过程中，必须注意酶活性中心的氨基酸残基不受到载体的影响，而且要避免酶蛋白高级结构的破坏。

从载体材料的组成来看，固定化酶所使用的载体可以分为无机载体、高分子载体、复合载体及新型载体等。

无机载体稳定性好、机械强度高、对酶和微生物无毒性、不易被酶和微生物分解、耐酸碱、成本较低、寿命长，如氧化硅、活性炭、氧化铁(铝)、多孔玻璃等。

纳米氧化硅固定辣根过氧化物酶处理苯酚废水

摘要：温和条件下（温、中性ｐ，以聚乙烯亚胺（Ｅ）为诱导剂诱导纳米氧化硅粒子的形成，同时固定在室Ｈ）ＰＩ
化辣根过氧化物酶（ＨＲＰ。Ｆ —Ｒ表征结果证实载体为氧化硅，且ＨＲ）ＴＩＰ被成功固定于载体中。ＳＭ分析显Ｅ
ＷＡＮＧｉＩＣｕ，ＪＡＮＧＹａｊｎ。ＺｎｕＨＯＵｙＬｉａ，ＧＡＯｉｇＪｎ
（ｃｏｌｆｈｍｉａｇｎｅｉｇ，ＨｅｅＵｎｖｒｉｆｃｎｌｇＳｈｏＣｅｃｌＥｎｉｅｒｎｏｂｉｉｅｓｔｏＴｅｈｏｏｙ，Ｔｉｎｉ０１０ｙａｊｎ３０３，Ｃｈｎ）ｉａ
文献标志码：Ａ
文章编号：０３ —１５（０１７０６７４８１７２１）０ —２２ —０
Ｈｏｓｒｄｓｅｏｉｓｎａｓｌｔｄｏｎｏｉｉａｒｅａｉｈｐｒｘｄａｅｅｃｐｕａｅｎｎａｓｌｃｆｒｐｈｎｏｅｏａｏｅｌｒｍｖｌ
Ａｂｔａｔ：ＥｎａｓｌｔｏＳｄｍｏｔａｅｏｂｅａｆｅｔｖｅｈｏｏｎｚｍｅｉｓｒｃｃｐｕａｌｎｉｅｎｓｒｔｄｔｎｅｆｃｉｅｍｔｄｆｒｅｙｍｍｏｂｌａｉｎ．ｍｐｒｄｔｉｉｔｏＣｏｚａｅｏｔａｉｉｎｅｈｏ，ｔｂｉｒｄｔｏａｌｍｔｄｓｈｅｏｍｉｔｃｐｏｃａｍｉｄｏｉｉｈｓｍｅｉａｐｒａｈｔｌｃｎｄｔｏｎｓａｇａｎｒｄｒｅｅｍｕｈｎｔｒｓ．ｒｈｅｃｉｅｅｔＦｏｔｒｍｏｖｎｐｈｎｉｗａｔ— ｔｒｓｌｃｆｍｅｂｙｅｉｇｅｏｌｎｓｅｗａｅ，ｉｉａｏｒｄｐｏｙｅｈｙｅｅｍｉ —ｎｃｒｌｔｌｎｉｎｅｉｄｕｅｗａｕｅｔｉｓｓｄｏｍｍｏｌｅｂｉｚｉ

镍离子增强辣根过氧化物酶法合成联苯研究

ＭａｓａｄＨＰＬＣ．Ｔｅｐｏｕｔｗａ “ ４，４ｓｎｈｒｄｃｓ２，２一ｔｔａｙｒｘｅｒｈｄｏｙ一５，ｄ５一ｉ—ｔｒｅｔ—ｂｙｕｔｌ—ｂｐｅｙ ” ａｓｌｏｔｘｃ，ｉｈｎｌｓａｍｏｔｎｎｏｉｙａｄｃｎｂｓｂｅａｈａｍａｅｉａｒｃｒｏｓｎａｅｕａｌｓｐｒｃｕｔｌｐｅｕｓｒ．ｃ
的重要来源。许多研究者发现利用酶可以去除环境中的污染物一。其中，辣根过氧化物酶（Ｐ是一种含有血红素辅基ＨＲ）的蛋白酶，催化多种有机和无机物的氧化，可以在广泛的可并
一
二叔丁基联苯，是一种几乎无毒的化合物，可作为制药前体的使用。
关键词：镍离子；辣根过氧化物酶；联苯
ＢｉｃｅｉａｙｈｅｉｆＢｉｏｈｍｃｌＳｎｔｓｓｏｐｈｅｙｒｍ — ｔｒ — ｔｌｅｏｙＨｏｓｒｄｉｈｎｌｆｏ２ — ｅｔ—ｂｕｙｐｈｎｌｂｒｅａｓＰｅｏｉａｅＡｃｉａｅｔｒｘｄｓｔｖｔｄｗｉｈＮｉ
每个酶样品都用含２ｍＭＮ的磷酸盐缓冲溶液处理２，ｉ４ｈ然后透析约１。酶样品特定的活性用光度法在１ｒｎ反应过０ｈｉａ程中测定，该过程使用４一氨基安替比林一苯酚作为供氢体。
（ｏｌｅｏｉｃｎｅＨｅａｎｅｓｙＨｅａａｅｇ７００ｈｎ；ｓｔｔｏｉｈｍｓｙ１ＣｌｇｆｆＳｉｃ，ｎｎＵｉｒｔ，ｎｎＫｉｎ５０，Ｃｉａ２ＩｔｕｅｆｏｅｉｒｅＬｅｅｖｉｆ４ｎｉＢｃｔ

辣根过氧化物酶直接电化学研究进展

大．在低浓度的溶液中产生的响应电流一般较小。其信号容易被电容电流、残余电流等掩盖等。同
因此．实现酶的直接电化学．需要满足以下两个条件：一是缩短酶的活性中心与电极间的距离，二是
在呼吸链中生物氧化和新陈代谢是靠多种酶的共同
作用才完成的研究酶的直接电化学无论在理论上
还是在应用中都具有重要意义。在理论上，酶与电极之间的直接电子传递过程更接近生物氧化还原系
统的原始模型．这就为揭示生物氧化还原过程的机理奠定了基础。另外．酶直接电化学的研究也可望
程。如生物活化氧分子和生物合成细胞壁等，因此。一直被作为研究过氧化物酶结构、热力学和动
散分子的电子转移：蛋白质表面电荷分布的非均匀
性，影响了其电子反应的可逆性；蛋白质分子量较
力学性质的代表性化合物。特别是被广泛用于阐明
的羧基结合．这时．固定化的ＨＲ在生物传感电极Ｐ
ＨＰ／ＣＰ／Ｃ产生了一对氧化还原峰．研究ＲＴＡＧ就认为．这归于ＨＲ的直接电子转移过程。固定在Ｐ
ＴＡ／ＣＣＰＧ的ＨＲ表面覆盖量约为１ｘ０１ｍｏ・ｍ－Ｐ．１— ｌｃ２２２．
通过聚合物表面活性剂膜修饰电极并结旮纳米技术辣根过氧化物碑hrp重组及定点突变技术和方法实现了hrp与电梗同的直接电于转穆简要舟绍了辣根过氯化酶直接电化学的研究进展

辣根过氧化物酶活性检测方法研究

辣根过氧化物酶活性检测方法研究张挺;何智敏;钟瑞敏;张世伟【摘要】通过单因素实验和正交实验研究了辣根过氧化酶(HRP)活性测定条件:缓冲溶液种类、缓冲溶液离子浓度、pH值、温度对其影响.实验结果表明在25℃下,0.1mol/L,pH=7.0的磷酸盐缓冲溶液中反应,辣根过氧化物酶的酶活力达到最大值1.13×107 U/g;确定辣根过氧化物酶活性的最佳检测方法:1mg HRP溶解于1mL 0.1mol/L磷酸盐缓冲溶液(pH=7.0),反应温度为25℃,检测波长为436nm.该方法简单可靠,操作简便,可有效应用于实验室和常规生化检测.【期刊名称】《广州城市职业学院学报》【年(卷),期】2017(011)003【总页数】4页(P73-76)【关键词】辣根过氧化物酶;酶活力;活性检测【作者】张挺;何智敏;钟瑞敏;张世伟【作者单位】广州城市职业学院食品系,广东广州510405;韶关学院英东食品科学与工程学院,广东韶关512005;韶关学院英东食品科学与工程学院,广东韶关512005;深圳市计量质量检测研究院,广东深圳518055【正文语种】中文【中图分类】O657.32辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase，HRP)是常用抗体标记物之一，具有特异性强、灵敏度高的优点，作为标记酶应用在免疫细胞组织化学和酶免疫测定等技术[1,2]。

辣根过氧化物酶的活性测定对免疫反应等实验效果影响较大[3,4]。

而对于测定酶活性的检测方法，因为缺少统一的标准，使得在进行生化实验中难以确保实验数据的重复性、科学性和准确性。

因此建立一个辣根过氧化物酶活性测定标准显得尤为重要。

本研究利用紫外分光光度法检测辣根过氧化物酶活性，优化了缓冲液种类、缓冲液离子浓度、温度、pH值因素。

(一)材料1.试剂辣根过氧化物酶(sigma)、愈创木酚(99.5%，深圳市锐普德生物科技有限公司)、过氧化氢(30%，广州威佳科技有限公司)、三羟甲基氨基甲烷(99.50%，广州威佳科技有限公司)，其它试剂为分析纯。

酶固定化载体材料综述

酶的固定化载体材料综述摘要：固定化酶是一种高效、高选择性和反应条件温和的生物催化剂。

有关酶固定化的研究越来越受到人们的重视，相关的研究报道很多。

酶固定化载体材料按组成可分为无机载体材料、高分子载体材料以及复合载体材料三大类。

本文从这三个方面简单综述了一些相关研究实例。

关键词：酶固定化，载体材料，无机，高分子，复合材料1.引言酶（enzyme）是天然的生物催化剂，可以在常温、常压下参与体内的各种代谢反应。

相比于传统的催化剂，由于具有能量消耗低、催化效率高、立体选择性专一以及合成路线较短等特点，使用酶催化反应被认为是环境友好且经济的[1]。

然而，酶也不可避免地存在一些缺点，比如反应操控性低，不能回收利用，难以商品化发展。

为克服这些问题，固定化酶（immobilized enzyme）的概念被提了出来。

早在1910年，人们就已经开始了酶的固定化研究，然而直到上世纪60 年代，酶固定化技术才得到快速发展。

通俗来讲，酶固定化就是利用固体材料将游离态的酶在一定范围内束缚受限起来，赋予酶易分离、可回收利用等特点的同时保持其本身优异特性不变。

研究酶的固定化可从两个方向进行，一个是固定化方法与技术的改进，另一个方向是改进或开发新的用于固定化的载体材料。

对于前者，我们知道，主要的方法包括吸附法（包含物理吸附与离子吸附），交联法，共价键法以及包埋法，以及近年来研究得比较多的定向固定技术等［2］。

对于后者的研究，我们也能发现，越来越多的新材料开始被开发应用于酶固定化。

本文从载体材料方向出发，结合若干实例，来简单介绍下酶的固定化研究。

2.酶固定化载体材料经过半个多世纪的发展，已经开发出来的用于固定化酶的载体种类繁多。

按照载体材料的基本组成，可以分为无机载体材料、高分子载体材料、复合载体材料三大类。

2.1无机载体材料这一类研究得比较多的是介孔材料，如介孔硅粒子（mesoporous silica particles）。

根据国际纯粹与应用化学（IUPAC ）定义，孔径在2-50nm 的材料被称为介孔材料。

固定化酶技术及应用的研究进展

固定化技术研究进展摘要:固定化酶技术作为一门交叉学科技术,在生命科学、生物医学、食品科学、化学化工及环境科学领域得到了广泛应用。

新型载体材料的合成是今后固定化酶发展的一个非常重要的研究领域。

本文主要介绍了固定化酶的载体,固定化技术以及在不同行业的应用,主要介绍了在污水处理和医疗行业的应用和发展趋势。

关键词:固定化载体污水医疗应用酶是重要的生物催化剂，具有专一性强、催化效率高、无污染、反应条件温和等特点，在制药、食品、环保、酿造、能源等领域都得到了广泛的应用。

但在实际应用中,酶也存在许多不足，如大多数的酶在高温、强酸、强碱和重金属离子等外界因素影响下,都容易变性失活,不够稳定；与底物和产物混在一起,反应结束后,即使酶仍有很高的活力,也难于回收利用，这种一次性使用酶的方式，不仅使生产成本提高，而且难于连续化生产；并且分离纯化困难，也会导致生产成本的提高等。

固定化酶技术(Immobiｌｉzed eｎzｙme techｎolｏgy)克服了酶的上述不足。

酶的固定化是指采用有机或无机固体材料作为载体,将酶包埋起来或束缚、限制于载体的表面和微孔中,使其仍具有催化活性，并可回收及重复使用的酶化学方法与技术。

１.传统酶固定化技术传统酶的固定化方法可分为吸附法、共价偶联法、交联法和包埋法等4 种。

吸附法是指通过载体表面和酶表面间的次级键相互作用而达到酶固定化的方法，根据吸附剂的特点又可分为物理吸附和离子交换吸附。

该法具有操作简便、条件温和及吸附剂可反复使用等优点，但也存在吸附力弱，易在不适pH、高盐浓度、高底物浓度及高温条件下解吸脱落的缺点。

共价偶联法是将酶的活性非必须侧链基团与载体的功能基通过共价键结合，故表现出良好的稳定性,有利于酶的连续使用,是目前应用和研究最为活跃的一类酶固定化方法，但共价偶联反应容易使酶变性而失活。

交联法是利用双功能或多功能基团试剂在酶分子之间交联架桥固定化酶的方法，其更易使酶失活。

包埋法包括网格包埋、微囊型包埋和脂质体包埋等，包埋法中因酶本身不参与化学结合反应,故可获得较高的酶活力回收，其缺点是不适用于高分子量底物的传质和用于柱反应系统，且常有扩散限制等问题。

葡萄糖氧化酶和辣根过氧化物酶共固定化

葡萄糖氧化酶和辣根过氧化物酶的共固定化摘要：酶的共固定化是在原有的单酶固定化技术的基础上,将单酶体系改为双酶或多酶体系,或将酶同辅酶及其他与酶有相互作用的活性物质共同固定化在同一介质中形成偶联反应体系的过程。

因为要兼顾不同酶的不同最适pH值、最适温度、共固定比例以及固定化次序等问题,所以酶的共固定相对单酶固定化要复杂得多。

葡萄糖氧化酶(GOX)和辣根过氧化物酶(HRP)是常用的两种酶，前者多提取自黑曲霉发酵产物，而后者则来自天然植物辣根，两种酶在很多领域都有极为广泛的应用。

本文主要概述这两种酶的共固定化方法及对共固定化酶(HRP 是主酶,GOX提供H2O2是辅助酶)催化苯甲硫醚不对称氧化成苯甲亚砜的反应的应用。

酶的共固定化酶催化反应具有专一性强、效率高、作用条件温和等特点，因而在生物技术、生物医学，医药化工，食品等行业具有广泛的应用价值。

然而，酶制剂由于造价昂贵，将其以游离酶的形式用于生产过程，存在稳定性差，难以回收利用，产物分离难度高等缺点，天然游离酶已经越来越不能胜任规模化生产的要求，也难以同传统化工和发酵产业相抗衡。

酶的固定化不仅可以解决酶的回收，下游产物污染问题，还可以提高酶的稳定性，并在一定程度上加强了酶对高温，酸，碱乃至有机溶剂等条件的承受能力，拓宽了酶的应用范围，增强了酶的应用价值。

葡萄糖氧化酶葡萄糖氧化酶(Glucoseoxidase，GOX)，属氧化还原酶类，产自真菌和某些昆虫（如蜜蜂）。

葡萄糖氧化酶分子量为160kDa，由两个亚基构成，每个亚基的分子量为80kDa，并且，每个亚基的上分别通过非共价键结合着一分子的辅酶——黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）。

辅酶FAD在酶反应过程中起着电子传递体的作用。

葡萄糖氧化酶的等电点（PI）为4.2，能选择性地在有分子氧的条件下，将β-D-葡萄糖氧化为1,5-葡萄糖酸内酯和过氧化氢，产物过氧化氢的积累，会对GOX 的活性起到产物抑制作用。

所以要保持GOX的活性，往往需要及时地去除或者消耗掉产生的过氧化氢。

辣根过氧化物酶在碳纳米管上的固定化及其固定化酶去除苯酚的研究

使用。
基金来源：宁省教育厅高等学校科研计划资助项目（０８６）辽２０３７＊作者简介：唐艳（９４）女，士研究生。Ｅｍａ：ｎｙｎＯ３２＠１３ｃｒ；１８，硕 — ｉｔｇａｌ２２２６．ｏ１ａｎ通讯联系人：鑫（９５）女，士，教授，要从事有机一无机杂化多材料的设计、成及应用研究。Ｅ— ｍａ：ｉ石１７一，博副主Ｌ合ｉｘｎｌ
珀酰亚胺（ＮＨＳ、）柠檬酸、苯二胺、硝酸、（、酚、邻浓Ｈ。）苯２ＡｌＳ）、酸氢二钠、酸二氢钠、酸氢钠，为分析Ｋ（Ｏ４。磷磷碳均
纯，津市科密欧化学试剂有限公司；温一２、乙二醇天吐０聚
中国材料科技与设备（双月刊）辣根过氧化物酶在碳纳米管上的固定化及其固定化酶去除苯酚的研究
２１０１年・２第期
辣根过氧化物酶在碳纳米管上的固定化及其固定化酶去除苯酚的研究
唐艳，鑫，石冯春梁
（宁师范大学化学化工学院功能材料化学研究所，宁辽辽大连１６２）１０９
乙基一３（一三甲氨丙基）二亚胺盐（Ｄ、３碳ＥＣ）Ｎ一羟基琥
简单 ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ 诸多优点。但令人遗憾的是自由的ＨＲＰ容易失活，