细胞凋亡试验常用的方法
检测细胞凋亡的三种流式方法
检测细胞凋亡的三种流式方法细胞凋亡（apoptosis）是细胞自主性死亡的过程，是正常细胞发育和组织调控的重要途径。
为了研究细胞凋亡的机制和调控，科学家们发展出了许多方法来检测和定量细胞凋亡的发生。
其中流式细胞术（flow cytometry）是最常用的方法之一，根据不同的细胞特征和所需信息，可以有多种方法用于检测细胞凋亡。
下面将介绍三种常用的流式细胞术方法。
1. 荧光标记的Annexin V/PI双染法：Annexin V是一种细胞外结合蛋白，具有高度特异性结合细胞凋亡的特点。
当细胞凋亡发生时，磷脂酰丝氨酸（PS）从细胞内翻转至细胞外，而Annexin V能够结合在PS上。
Propidium Iodide（PI）能够穿过损伤的细胞膜，结合到细胞核内的DNA分子上。
通过将Annexin V标记为绿色荧光染料，将PI标记为红色荧光染料，通过流式细胞术定量测量荧光信号的强度，可以区分出未凋亡细胞（Annexin V和PI双阴性），早期凋亡细胞（Annexin V阳性，PI阴性），晚期凋亡和坏死细胞（Annexin V和PI双阳性）等不同状态的细胞。
2.荧光标记的DNA碎片染色法：3. 荧光标记的Caspase活性检测法：Caspases是细胞凋亡过程中的关键酶，它们在给定的信号下被激活并参与调节细胞凋亡的执行阶段。
通过使用荧光标记的Caspase底物，如FLICA系列（Fluorochrome Inhibitor of Caspases）、CaspGLOW系列（Caspase-Glo Kits），可以测量细胞中Caspase的活性。
这些底物在被Caspase酶剪切后会释放出荧光信号，通过流式细胞技术可以测量荧光信号的强度。
由于Caspase活性与细胞凋亡过程密切相关，因此可以利用这些荧光标记底物来定量测量细胞凋亡的发生。
总结起来，流式细胞术是一种非常有效的方法用于检测细胞凋亡的发生。
Annexin V/PI双染法可以定量测量不同状态的细胞，DNA碎片染色法可以测量细胞凋亡的程度，荧光标记的Caspase活性检测法可以测量细胞中Caspase的活性。
细胞凋亡的几种检测方法
细胞凋亡的几种检测方法Company number：【WTUT-WT88Y-W8BBGB-BWYTT-19998】细胞凋亡的几种检测方法1、形态学观察方法（1）HE（苏木精—伊红染色法）染色、光镜观察：凋亡细胞呈圆形，胞核深染，胞质浓缩，染色质成团块状，细胞表面有“出芽”现象。
（2）丫啶橙（AO)染色，荧光显微镜观察：活细胞核呈黄绿色荧光，胞质呈红色荧光。
凋亡细胞核染色质呈黄绿色浓聚在核膜内侧，可见细胞膜呈泡状膨出及凋亡小体。
（3）台盼蓝染色：如果细胞膜不完整、破裂，台盼蓝染料进入细胞，细胞变蓝，即为坏死。
如果细胞膜完整，细胞不为台盼蓝染色，则为正常细胞或凋亡细胞。
此方法对反映细胞膜的完整性，区别坏死细胞有一定的帮助。
（4）透射电镜观察：可见凋亡细胞表面微绒毛消失，核染色质固缩、边集，常呈新月形，核膜皱褶，胞质紧实，细胞器集中，胞膜起泡或出“芽”及凋亡小体和凋亡小体被临近巨噬细胞吞噬现象。
2、 DNA凝胶电泳细胞发生凋亡或坏死，其细胞DNA均发生断裂，细胞内小分子量DNA片断增加，高分子DNA减少，胞质内出现DNA片断。
但凋亡细胞DNA断裂点均有规律的发生在核小体之间，出现180－200bpDNA片断，而坏死细胞的DNA断裂点为无特征的杂乱片断，利用此特征可以确定群体细胞的死亡，并可与坏死细胞区别。
正常活细胞DNA 电泳出现阶梯状（LADDER)条带；坏死细胞DNA电泳类似血抹片时的连续性条带3、酶联免疫吸附法（ELISA)核小体测定凋亡细胞的DNA断裂使细胞质内出现核小体。
核小体由组蛋白及其伴随的DNA片断组成，可由ELISA法检测。
检测步骤1、将凋亡细胞裂解后高速离心，其上清液中含有核小体；2、在微定量板上吸附组蛋白体’3、加上清夜使抗组蛋白抗体与核小体上的组蛋白结合‘4、加辣过氧化物酶标记的抗DNA抗体使之与核小体上的DNA结合’4、加酶的底物，测光吸收制。
用途该法敏感性高，可检测5*100/ml个凋亡细胞。
鉴定细胞凋亡的常用方法
鉴定细胞凋亡的常用方法细胞凋亡是细胞程序性死亡的一种形式，是维持生物体正常生长发育和组织修复的重要机制。
凋亡与疾病的关系密切，如肿瘤、神经退行性疾病、心血管疾病等。
因此，鉴定细胞凋亡的常用方法对于疾病的诊断和治疗具有重要的意义。
本文将介绍几种常用的细胞凋亡鉴定方法。
一、TUNEL法TUNEL法是一种基于末端脱氧核苷酸转移酶(dUTP-nick end labeling，TUNEL)技术的细胞凋亡检测方法。
该方法通过在细胞凋亡时，末端脱氧核苷酸转移酶(dUTP-nick end labeling，TUNEL)将标记物dUTP标记在DNA的3'末端，然后使用荧光显微镜观察标记物的荧光强度。
该方法的优点是操作简便，结果准确可靠，适用于多种样本类型的细胞凋亡检测。
二、Annexin V-FITC/PI双染法Annexin V-FITC/PI双染法是一种流式细胞术检测细胞凋亡的方法。
该方法通过Annexin V结合细胞膜上的磷脂酰胆碱(PS)和PI结合细胞核DNA，将细胞分为四个区域：Annexin V-FITC(-)/PI(-)区域表示正常细胞；Annexin V-FITC(+)/PI(-)区域表示早期凋亡细胞；Annexin V-FITC(+)/PI(+)区域表示晚期凋亡细胞；AnnexinV-FITC(-)/PI(+)区域表示坏死细胞。
该方法的优点是高灵敏度和高特异性，可以同时检测细胞凋亡和坏死。
三、DNA Ladder检测DNA Ladder检测是一种检测细胞凋亡的传统方法。
该方法通过电泳分离DNA，检测DNA的大小和形态是否发生变化，如出现约180bp 的DNA片段，则提示细胞凋亡。
该方法的缺点是需要较多的细胞样本，且不能区分细胞凋亡的早期和晚期。
四、Caspase活性检测Caspase是细胞凋亡的重要调节因子，Caspase活性检测是一种检测细胞凋亡的方法。
该方法通过检测Caspase活性的改变来判断细胞凋亡的程度，如Caspase-3活性增加，则提示细胞凋亡。
TUNEL法检测细胞凋亡实验原理和方法tunel完成
<TUNEL>
TUNEL〔TdT-mediated dUTP nick end labeling法 实际上是分子生物学与形态学相结合的研究方法, 对完整的单个凋亡细胞核或凋亡小体进行原位染 色,能准确的反应细胞凋亡最典型的生物化学和形 态特征,可用于石蜡包埋组织切片、冰冻组织切片、 培养的细胞和从组织中分离的细胞的细胞凋亡测 定,并可检测出极少量的凋亡细胞,灵敏度远比一般 的组织化学和生物化学测定法要高,因而在细胞凋 亡的研究中已被广泛采用.
TUNEL原理
标 本 处 理
实 验 步 骤
实验流程
结果
注意事项
• 极少数细胞凋亡时没有DNA断裂或DNA裂解不完 全,此时不适用TUNEL法检测,进而产生假阴性结 果.
• 在个别类型的坏死细胞中也发现TUNEL检测呈阳 性.在高度增殖/代谢的组织细胞中可产生大量 DNA片断,
• 从而引起假阳性结果.在需要严格判断细胞凋亡的 情况下,最好同时检测多个凋亡指标
TUNEL
TUNEL的原理 TUNEL的操作步骤 结果及注意事项
主要试剂
1. 缓冲液<Labeling Buffer>： 用于维持一定的反应条件,含有以下成分：
500mmol/L二甲胂酸钾、 pH7.2 10mmol/L CoCl2 <氯化钴>、 1mmol/L DTT<二硫苏糖醇>. 2.末端脱氧核糖核酸转移酶<TdT> ：
放映结 感谢各位的批评指导！
谢 谢！
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TUNEL的原理是：用荧光素〔fluorescein标记的脱氧 核糖核苷酸,在TdT 的作用下连接到凋亡细胞中断 裂DNA的3’-OH末端,用荧光显微镜即可观察结果. 在此基础上连接辣根过氧化酶标记的荧光素抗体, 可进一步放大检测信号,并且普通显微镜观察实验 结果.由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA 的断裂,因而没有3’-OH形成,很少能够被染色.
不用看实验书啦！这里有最细致的检测细胞凋亡Tunel法~~
不用看实验书啦！这里有最细致的检测细胞凋亡Tunel法~~细胞凋亡中，基因组DNA双链断裂或单链断裂而暴露大量的粘性3'-OH末端，可以在末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)的催化下加上荧光素(FITC)标记的dUTP，从而可以通过荧光显微镜或流式细胞仪进行检测细胞凋亡情况。
由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA的断裂，因而没有3'-OH形成，很少能够被染色。
Tunel法可以对完整的单个凋亡细胞核或凋亡小体进行原位染色，能准确地反应细胞凋亡典型的生物化学和形态特征，可检测出极少量的凋亡细胞，因而在细胞凋亡的研究中被广泛采用。
前面我们介绍了Tunel检测样本的制备以及样品进行透膜处理，今天继续为大家介绍Tunel的标记与检测。
首先在进行Tunel检测过程中，我们需要设置四组：（1）阳性对照：DNA酶I（DNase I）处理制备阳性对照载玻片。
DNase I可以消化单链或双链DNA产生单脱氧核苷酸或单链或双链的寡脱氧核苷酸的核酸内切酶，人为造成细胞凋亡。
（2）阴性对照：使用不含TdT酶的对照孵育缓冲液，用ddH2O 替代TdT酶。
（3）实验处理组。
（4）实验对照组。
标记与检测步骤：1.阳性对照制备：按1:10的比例用去离子水稀释10×DNase I Buffer，取其中100 µl滴加到已通透的样本上，室温孵育5min。
向剩余100μl 1×DNase I Buffer中加1μl DNase I (1U/μl)。
洗掉液体，加入100μl含DNase I的缓冲液，室温孵育10min。
洗掉液体，并将载玻片放入超纯水中洗涤3次。
2．按1:5的比例用去离子水稀释5×Equilibration Buffer。
将四组样本滴加100μl 1×Equilibration Buffer覆盖样本区域（可用组化笔将样品圈好），室温孵育10-30分钟。
3.配制Tunel检测液：Tunel检测液按照下列表格配置，检测液需充分混匀。
细胞凋亡检测方法
细胞凋亡检测方法细胞凋亡是一种重要的细胞死亡方式，它在维持机体内稳态和发育过程中起着关键作用。
因此，对细胞凋亡的检测方法研究具有重要意义。
在本文中，我们将介绍几种常用的细胞凋亡检测方法，以及它们的优缺点和适用范围。
1. 形态学观察法。
形态学观察法是最早用于检测细胞凋亡的方法之一。
通过光学显微镜观察细胞形态的变化，如细胞体积缩小、胞质浓缩、核染色质凝聚和核小体形成等，来判断细胞是否发生凋亡。
这种方法简单直观，但不适用于高通量检测和定量分析。
2. DNA断裂检测法。
DNA断裂是细胞凋亡的一个显著特征，因此可以通过检测DNA 的断裂来判断细胞是否发生凋亡。
常用的DNA断裂检测方法包括凝胶电泳、TUNEL法和DNA断裂酶切法。
这些方法可以对凋亡细胞进行定量分析，但需要特殊仪器和试剂，操作较为复杂。
3. 蛋白质检测法。
细胞凋亡过程中，一些特定的蛋白质会发生变化，如Bcl-2家族蛋白、caspase家族蛋白等。
因此，可以通过检测这些蛋白质的表达水平或活性来判断细胞是否发生凋亡。
常用的蛋白质检测方法包括Western blot、免疫荧光染色和流式细胞术。
这些方法对于定量分析和高通量检测具有优势，但需要特异性抗体和专门仪器。
4. 细胞色素C释放检测法。
在细胞凋亡过程中，线粒体膜通透性增加，导致线粒体内膜空间的细胞色素C释放到细胞质中。
因此，可以通过检测细胞色素C的释放来判断细胞是否发生凋亡。
常用的方法包括免疫荧光染色和细胞色素C活性检测。
这些方法对于研究凋亡的机制和药物筛选具有重要意义。
综上所述，不同的细胞凋亡检测方法各有优缺点，研究者可以根据具体的实验目的和条件选择合适的方法。
随着生物技术的发展，新的细胞凋亡检测方法也在不断涌现，相信在不久的将来，会有更多更简便、灵敏的方法问世，为细胞凋亡研究提供更多的选择和可能性。
细胞凋亡检测细胞凋亡实验步骤检测方法
细胞凋亡检测,细胞凋亡实验步骤,检测方法一、定性和定量研究只定性的研究方法：常规琼脂糖凝胶电泳、脉冲场倒转琼脂糖凝胶电泳、形态学观察普通光学显微镜、透射电镜、荧光显微镜进行定量或半定量的研究方法：各种流式细胞仪方法、原位末端标记法、ELISA定量琼脂糖凝胶电泳;二、区分凋亡和坏死可将二者区分开的方法：琼脂糖凝胶电泳,形态学观察透射电镜是是区分凋亡和坏死最可靠的方法,Hoechst33342/PI双染色法流式细胞仪检测,AnnexinV/PI 双染色法流式细胞仪检测等;不能将二者区分开的方法：原位末端标记法、PI单染色法流式细胞仪检测等;三、样品来源不同选择组织：主要用形态学方法HE染色,透射电镜、石蜡包埋组织切片进行原位末端标记,ELISA或将组织碾碎消化做琼脂糖凝胶电泳;四、细胞凋亡检测1、早期检测:1 PS磷脂酰丝氨酸在细胞外膜上的检测2细胞内氧化还原状态改变的检测3细胞色素C的定位检测4 线粒体膜电位变化的检测2、晚期检测：细胞凋亡晚期中,核酸内切酶在核小体之间剪切核DNA,产生大量长度在180-200 bp 的DNA片段;对于晚期检测通常有以下方法：1 TUNEL末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记2 LM-PCR Ladder 连接介导的PCR检测3 Telemerase Detection 端粒酶检测3、生化检测：1典型的生化特征：DNA 片段化2检测方法主要有：琼脂糖凝胶电泳、原位末端标记TUNEL等3TUNEL末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记4通过DNA末端转移酶将带标记的dNTP 多为dUTP间接或直接接到DNA片段的3’-OH端,再通过酶联显色或荧光检测定量分析结果;可做细胞悬液、福尔马林固定或石蜡处理的组织、细胞培养物等多种样本的检测;4、LM-PCR Ladder 连接介导的PCR检测当凋亡细胞比例较小以及检测样品量很少如活体组织切片时,直接琼脂糖电泳可能观察不到核DNA的变化;通过LM-PCR,连上特异性接头,专一性地扩增梯度片段,从而灵敏地检测凋亡时产生梯度片段;此外,LM-PCR 检测是半定量的,因此相同凋亡程度的不同样品可进行比较;如果细胞量很少,还可在分离提纯DNA后,用32P-ATP和脱氧核糖核苷酸末端转移酶TdT使DNA标记,然后进行电泳和放射自显影,观察凋亡细胞中DNA ladder的形成;上述两种方法都针对细胞凋亡晚期核DNA断裂这一特征,但细胞受到其它损伤如机械损伤,紫外线等也会产生这一现象,因此它对细胞凋亡的检测会受到其它原因的干扰;需结合其它的方法来检测细胞凋亡;其它方法：1Telemerase Detection 端粒酶检测端粒酶是由RNA和蛋白组成,它可以自身RNA为模板逆转录合成端粒区重复序列,使细胞获得“永生化”;正常体细胞是没有端粒酶活性的,每分裂一次,染色体的端粒会缩短,这可能作为有丝分裂的一种时钟,表明细胞年龄、复制衰老或细胞凋亡的信号;研究发现,90%以上的癌细胞或凋亡细胞都具有端粒酶的活性;2mRNA水平的检测研究者们发现了很多在细胞凋亡时表达异常的基因,检测这些特异基因的表达水平也成为检测细胞凋亡的一种常用方法;据报道,Fas 蛋白结合受体后能诱导癌细胞中的细胞毒性T细胞cytotoxic T cells 等靶细胞;Bcl-2 和bcl-X 长的作为抗凋亡bcl-2 和bcl-X的调节物,它们的表达水平比例决定了细胞是凋亡还是存活;用荧光定量PCR技术来检测基因表达水平无疑比之前者更快更准确;通过检测fas, bax-alpha 和bcl-X 长的基因的mRNA表达水平来进行细胞凋亡的检测; 5、细胞内氧化还原状态改变的检测：正常状态下,谷光苷肽GSH作为细胞的一种重要的氧化还原缓冲剂;细胞内有毒的氧化物通过被GSH还原而定期去除,氧化型的GSH又可被GSH还原酶迅速还原;这一反应在线粒体中尤为重要,许多呼吸作用中副产物的氧化损伤将由此被去除;当细胞内GSH的排除非常活跃时,细胞液就由还原环境转为氧化环境,这可能导致了凋亡早期细胞线粒体膜电位的降低,从而使细胞色素C三羧酸循环中的重要组分从线粒体内转移到细胞液中,启动凋亡效应器caspase的级联反应;6、细胞色素C的定位检测细胞色素C作为一种信号物质,在细胞凋亡中发挥着重要的作用;正常情况下,它存在于线粒体内膜和外膜之间的腔中,凋亡信号刺激使其从线粒体释放至细胞浆,结合Apaf-1 apoptotic protease activating factor-1后启动caspase级联反应：细胞色素C/Apaf-1复合物激活caspase-9,后者再激活caspase-3和其它下游caspase; 7、线粒体膜电位变化的检测：1线粒体跨膜电位的耗散与细胞凋亡有密切关系2近年来陆续有报道说明线粒体跨膜电位的耗散早于核酸酶的激活,也早于磷酯酰丝氨酸暴露于细胞表面;而一旦线粒体跨膜电位耗散,细胞就会进入不可逆的凋亡过程;3在细胞凋亡过程中线粒体跨膜电位的耗散主要是由于线粒体内膜的通透性转变,这是由于生成了动态的由多个蛋白质组成的位于线粒体内膜与外膜接触位点的通透性转变孔道PT孔道能稳定线粒体跨膜电位就能防止细胞凋亡;线粒体在细胞凋亡作用中的进一步证据：1若将纯化的正常的线粒体与纯化的细胞核在一起保温,并不导致细胞核的变化;但若将诱导生成PT 孔道的线粒体与纯化的细胞核一同保温,细胞核即开始凋亡变化;2形态学观察,看到细胞数目有限,统计学上的准确性受影响；3凝胶电泳检测DNA破坏了细胞的完整性也不能测出凋亡细胞占总细胞的比例；4流式细胞术可检测细胞、亚细胞及分子水平的特征性变化;用于流式细胞仪检测的染料：PI、Hoechst、EB、DAPI、丫啶橙等,其中PI、Hoechst 最常用;PI和Hoechst33342双标：PI、Hoechst33342均可与细胞核DNA或RNA结合;但是PI不能通过正常的细胞膜,Hoechst则为膜通透性的荧光染料,故细胞在处于坏死或晚期调亡时细胞膜被破坏,这时可为PI着红色;正常细胞和中早期调亡细胞均可被Hoechst着色,但是正常细胞核的Hoechst着色的形态呈圆形,淡兰色,内有较深的兰色颗粒；而调亡细胞的核由于浓集而呈亮兰色,或核呈分叶,碎片状,边集; 故PI着色为坏死细胞；亮兰色,或核呈分叶状,边集的Hoechst着色的为调亡细胞;PI和Annexin-V双标：磷脂酰丝氨酸PS正常位于细胞膜的内侧,但在细胞凋亡的早期或细胞损伤时PS可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面,暴露在细胞外环境中; Annexin-Vgreen可以和磷脂酰丝氨酸PS特异性结合;因此细胞处于调亡或坏死时,Annexin-V可为阳性早期的坏死细胞可能为阴性;但是只有坏死的细胞PI是阳性五、形态学观察1、普通光学显微镜观察2、透射电子显微镜观察3、荧光显微镜观察1、普通光镜下观察：1用苏木素-伊红HE染色：细胞核固缩碎裂、呈蓝黑色、胞浆呈淡红色凋亡细胞,正常细胞核呈均匀淡蓝色或蓝色,坏死细胞核呈很淡的蓝色或蓝色消失2Giemsa染色法、瑞氏染色法等,正常细胞核的色泽均一,凋亡细胞染色变深,坏死细胞染色浅或没染上颜色直接用倒置显微镜观察：1细胞体积变小,全面皱缩；2凋亡小体为数个圆形小体围绕在细胞周围;2、透射电子显微镜观察凋亡细胞体积变小,细胞质浓缩;细胞凋亡过程中细胞核染色质的形态学改变分为三期：Ⅰ期的细胞核呈波纹状或呈折缝样,部分染色质出现浓缩状态；Ⅱa期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化；Ⅱb期的细胞核裂解为碎块,产生凋亡小体;3、荧光显微镜常用的荧光染料：丫啶橙、PI 、DAPI、Hoechst33258 和Hoechst33342、EB等Hoechst 33342、Hoechst 33258、DAPI三种染料与DNA的结合是非嵌入式的,主要结合在DNA的A-T碱基区;紫外光激发时发射明亮的蓝色荧光;1PI双染色法基本原理Hoechst是与DNA特异结合的活性染料,能进入正常细胞膜而对细胞没有太大得细胞毒作用;Hoechst 33342在凋亡细胞中的荧光强度要比正常细胞中要高;DAPI为半通透性,用于常规固定细胞的染色;碘化丙啶PI是一种核酸染料,它不能透过完整的细胞膜,但在凋亡中晚期的细胞和死细胞,PI能够透过细胞膜而将细胞核染红;因此将Annexin-V与PI匹配使用,就可以将凋亡早晚期的细胞以及死细胞区分开来;注意事项：细胞凋亡时,其DNA可染性降低被认为是凋亡细胞的标志之一,但这种DNA可染性降低也可能是因为DNA含量的降低,或者是因为DNA结构的改变使其与染料结合的能力发生改变所致;在分析结果时应该注意;六、细胞凋亡的分子生物学检测方法:细胞凋亡中染色体DNA的断裂是个渐进的分阶段的过程,染色体DNA首先在内源性的核酸水解酶的作用下降解为50-300kb的大片段;然后大约30 ﹪的染色体DNA在Ca ²+和Mg²+依赖的核酸内切酶作用下,在核小体单位之间被随机切断,形成180～200bp核小体DNA多聚体;DNA双链断裂或只要一条链上出现缺口而产生的一系列DNA的3’-OH末端可在脱氧核糖核苷酸末端转移酶TdT的作用下,将脱氧核糖核苷酸和荧光素、过氧化物酶、碱性磷酸化酶或生物素形成的衍生物标记到DNA的3’-末端,从而可进行凋亡细胞的检测,这类方法一般称为脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法TUNEL;由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA的断裂,因而没有3’-OH形成,很少能够被染色;低分子量的DNA分离后,也可使用DNA聚合酶进行缺口翻译nick translation,使低分子量的DNA标记或染色,然后分析凋亡细胞;TUNEL或缺口翻译法实际上是分子生物学与形态学相结合的研究方法,对完整的单个凋亡细胞核或凋亡小体进行原位染色,能准确的反应细胞凋亡最典型的生物化学和形态特征,可用于石蜡包埋组织切片、冰冻组织切片、培养的细胞和从组织中分离的细胞的细胞凋亡测定,并可检测出极少量的凋亡细胞,灵敏度远比一般的组织化学和生物化学测定法要高,因而在细胞凋亡的研究中已被广泛采用;过氧化物酶标记测定法原理：脱氧核糖核苷酸衍生物地高辛digoxigenin-11-dUTP在TdT酶的作用下,可以掺入到凋亡细胞双链或单链DNA的3-OH末端,与dATP形成异多聚体,并可与连接了报告酶过氧化物酶或碱性磷酸酶的抗地高辛抗体结合;在适合底物存在下,过氧化物酶可产生很强的颜色反应,特异准确的定位出正在凋亡的细胞,因而可在普通光学显微镜下进行观察;毛地黄植物是地高辛的唯一来源;在所有动物组织中几乎不存在能与抗地高辛杭体结合的配体,因而非特异性反应很低;抗地高辛的特异性抗体与脊椎动物甾体激素的交叉反应不到1％,若此抗体的Fc部分通过蛋白酶水解的方法除去后,则可完全排除细胞Fc受体非特异性的吸附作用;本方法可以用于福尔马林固定的石蜡包埋的组织切片、冰冻切片和培养的或从组织中分离的细胞凋亡测定;一试剂配制1、磷酸缓冲液PBS：磷酸钠盐50mM,NaCl 200mM;2、蛋白酶K200μg/ml,：蛋白酶K 0.02g；PBS 100ml;3、含2%H2O2的PBS缓冲液：H2O2 ；PBS缓冲液;4、TdT酶缓冲液新鲜配：Trlzma碱3.63g用HCl调节pH至,加ddH2O定容到1000ml；再加入二甲砷酸钠29．96g和氯化钴0.238g;5、TdT酶反应液：TdT酶32μl；TdT酶缓冲液76μl,混匀,置于冰上备用;6、洗涤与终止反应缓冲液：氯化钠17. 4g；柠檬酸钠8.82g；ddH2O 1000ml7、％二氨基联苯DAB溶液：DAB 5mg；PBS 10ml,, 临用前过滤后,加过氧化氢至%;8、％甲基绿：甲基绿0.5g；0.1M乙酸钠100ml;9、100％丁醇,100％、95％、90％、80％和70％乙醇,二甲苯,10％中性甲醛溶液,乙酸,松香水等;10、过氧化物酶标记的抗地高辛抗体ONCOR二实验步骤1、标本预处理：1石蜡包埋的组织切片预处理：将组织切片置于染色缸中,用二甲苯洗两次,每次5min;用无水乙醇洗两次,每次3min;用95％和75％乙醇各洗一次,每次3min;用PBS洗5min 加入蛋白酶K溶液20ug／ml,于室温水解15min,去除组织蛋白;用蒸馏水洗4次,每次2min,然后按下述步骤2进行操作;2冰冻组织切片预处理：将冰冻组织切片置10％中性甲醛中,于室温固定10min后,去除多余液体;用PBS洗两次,每次5min;置乙醇：乙酸2：1的溶液中,于-20℃处理5min,去除多余液体;用PBS洗两次,每次5min,然后按下述步骤2进行操作;3培养的或从组织分离的细胞的预处理：将约5 × 107个/ml细胞于4％中性甲醛室温中固定10min;在载玻片上滴加50～100μl细胞悬液并使之干燥;用PBS洗两次,每次5min,然后按下述步骤2进行操作;2、色缸中加入含2％过氧化氢的PBS,于室温反应5min;用PBS洗两次,每次5min;3、用滤纸小心吸去载玻片上组织周围的多余液体,立即在切片上加2滴TdT酶缓冲液,置室温1～5min;4、用滤纸小心吸去切片周围的多余液体,立即在切片上滴加54μl TdT酶反应液,置湿盒中于37C反应1hr注意：阴性染色对照,加不含TdT酶的反应液;5、将切片置于染色缸中,加入已预热到37℃的洗涤与终止反应缓冲液,于37℃保温30min,每10min将载玻片轻轻提起和放下一次,使液体轻微搅动;6、组织切片用PBS洗3次,每次5min后,直接在切片上滴加两滴过氧化物酶标记的抗地高辛抗体,于湿盒中室温反应30min;7、用PBS洗4次,每次5min;8、在组织切片上直接滴加新鲜配制的％DAB溶液,室温显色3～6min;9、用蒸馏水洗4次,前3次每次1min,最后1次5min;10、于室温用甲基绿进行复染10min;用蒸馏水洗3次,前两次将载玻片提起放下10次,最后1次静置30s;依同样方法再用100％正丁醇洗三次;11、用二甲苯脱水3次,每次2min,封片、干燥后,在光学显微镜下观察并记录实验结果;三注意事项一定要设立阳性和阴性细胞对照;阳性对照的切片可使用DNaseI部分降解的标本,阳性细胞对照可使用地塞米松1μM处理3-4hr的大、小鼠胸腺细胞或人外周血淋巴细胞;阴性对照不加TdT酶,其余步骤与实验组相同;一、吖啶橙简称AO荧光染色法原理：吖啶橙Acridine Orange是吖啶的衍生物之一;它是一种荧光染料,激发峰492nm,荧光发射峰530nmDNA,640nmRNA,它与双链DNA的结合方式是嵌入双链之间,而与单链DNA和RNA则由静电吸引堆积在其磷酸根上;在蓝光给502nm激发下,细胞核发亮绿色荧光约530nm,核仁和胞质RNA发桔红色荧光＞580nm;吖啶橙的阳离子也可以结合在蛋白质、多糖和膜上而发荧光,但细胞固定阻抑了这种结合,从而主要显示DNA、RNA两种核酸;1试剂AO贮备液：AO 50mg分析纯蒸馏水 50ml4℃冰箱保存4个月;Tris缓冲液：Tris 50mmol/LMgCl2 LKCl 25mmol/LAO工作液：将AO贮备液10:1用蒸馏水稀释,再用Tris缓冲液将AO稀释到μg/ml的终浓度;2操作步骤①取乙醇固定的细胞悬液,浓度为107/ml,1500r/min,5分钟,弃乙醇;②加入2ml AO工作液,室温染10分钟;③滴在载玻片上,加缓冲甘油封片;④在荧光显微镜下用吸收波长405nm,发射波长530-640nm观察;结果：活细胞核呈黄绿色荧光,胞质呈红色荧光;凋亡细胞核染色质呈黄绿色浓聚在核膜内侧,可见细胞膜呈泡状膨出及凋亡小体;二、Hoechst33258染色Hoechst33258为特异性DNA染料,,与A-T键结合,但在环境下则优先与RNA 结合,染色DNA时应调整染液的pH至,这种染料不溶于磷酸缓冲液；所以配制时必须先以蒸馏水溶解配成储存液在4℃中避光保存;本方法是用于培养细胞、细胞涂片或细胞甩片;试剂及配制1Hoechst33258贮存液：称取Hoechst33258试剂1mg,用20ml蒸馏水溶解后,滤过,4℃避光保存;用时蒸馏水10倍稀释成染色液;2 ,;3封片液：20mmol/L柠檬酸,50mmol/L 磷酸氢二钠,50%甘油;4细胞固定液：甲醇/冰乙酸3:1,现配;操作方法1原代细胞培养、细胞学涂片或细胞甩片机制制备的单细胞片;2细胞固定液4℃固定5min;3蒸馏水稍洗后,点加Hoechst33258染色液,10min;4蒸馏水洗片后,用滤纸沾去多余液体;5封片剂封片后荧光显微镜观察;结果：在荧光显微镜下,活细胞核呈弥散、均匀荧光,坏死细胞不被Hoechst 染色;出现细胞凋亡时,细胞核或细胞质内可见浓染致密的颗粒块状蓝色荧光及明显核形态变化,如果见到3个或3个以上的DNA荧光碎片被认为是凋亡细胞;三、甲基绿-派诺宁染色法一原理细胞凋亡和细胞坏死均可表现为细胞核固缩等细胞死亡形态,但两者发生机制不同;细胞凋亡是一种细胞主动死亡过程,需要有细胞内蛋白酶的激活,细胞质内常有mRNA表达的增强;而细胞坏死是一种被动的细胞死亡过程,细胞质内常有RNA的损失;根据这一特点,可应用试剂甲基绿对DNA染色的特异性和派诺宁对RNA的亲和性,使甲基绿对固缩细胞核内的脱氧核糖核酸着染,如果细胞质内核糖核酸呈派诺宁阳性染色者为凋亡细胞,呈阴性染色者为坏死细胞;二试剂及配制1. 组织固定液无水乙醇 600ml氯仿 300ml冰醋酸 100ml2.甲基绿纯化新购买的甲基绿需用氯仿进行纯化处理以去除甲基紫;方法是将2％甲基绿水溶液20ml倾入洁净分液漏斗,加入氯仿20ml充分,使其内的甲基溶于氯仿中而呈紫红色;旋动分液漏斗下部的砂塞,慢慢把下沉带比红色的氯仿移去,再加入新的氯仿10ml,如此反复更换氯仿,直到无紫红色为止;该液作为贮存液,4℃保存;3.染色液甲基绿贮存液 5ml5%派诺宁水溶液 1ml蒸馏水 12mlL乙酸钠 18ml临用前配制,滤纸过滤;三操作方法1.新鲜取材组织置固定液中4℃固定3-6h或培养细胞、细胞学甩片固定10min;2.直接转入95%乙醇脱水和无水乙醇脱水,二甲苯透明,石蜡包埋;3.切片经二甲苯脱蜡,梯度乙醇水化至蒸馏水;细胞学涂片不用梯度酒精4.置染色液中室温下染色约1h;5.取出切片,不经水洗,用滤纸吸干多余染液;6.插入丙酮中迅速分化;7.转入丙酮二甲苯1:1稍洗;8.二甲苯透明2-3次;9.中性树胶封固;四结果光学显微镜下凋亡细胞固缩,细胞核呈绿色或绿蓝色着染,胞质呈红紫色着染,坏死细胞只有固缩细胞核呈绿色着染;观察时可用凋亡指数进行计数,即随机选择约10-20个视野每张切片约1000-2500个细胞,计数凋亡细胞百分率;四、TdT介导的dUTP缺口末端标记技术TUNEL原理：在机体内部随时都在发生着细胞的死亡;传统上用显微镜来观察细胞的死亡,其特征为核染色质的浓缩及碎片的形成;但是这种现象出现的很晚,时间也很短暂;凋亡的特征是内源性核酸内切酶被激活,细胞自身的染色质或DNA被切割,出现单链或双链缺口,并产生与DNA断点数目相同的3ˉ-OH 末端;末端脱氧核糖核酸转移酶Terminal deoxynucleotidyl Transferase TdT可以将地高辛标记的dUTPDIG-dUTP标记至3’-OH末端,DIG-dUTP核苷酸结合在DNA断点部位,可以通过生物标记的抗地高辛抗体Anti-DIG-Biotin反应后,再结合链酶亲和素-过氧化物酶SABC,然后加入显色底物DAB予以显示;凋亡的细胞核呈棕黄色,从而可以在显微镜下观察到着色的凋亡细胞;试剂1.标记缓冲液Labeling Buffer5×浓度的TdT反应缓冲液,含有以下成分：500mmol/L二甲胂酸钾;10mmol/L CoCl2 氯化钴1mmol/L DTT二硫苏糖醇2.末端脱氧核糖核酸转移酶TdT,×20×204.封闭液Blocking Reagent5.生物素化抗地高辛抗体×100×100×2008.抗体稀释液9. 多聚赖氨酸或APES;10. 0.01M TBS,配法：1L双蒸馏水中加入8.5克氯化钠,1.2克Tris和纯乙酸;11. DAB显色试剂;操作步骤1.样品处理1玻片预先用多聚赖氨酸或APES进行处理;2细胞涂片和冰冻切片：最重要的是及时固定;用4%多聚甲醛/0.01M PBS室温下固定30-60分钟;0.01M PBS洗2分钟×2次;蒸馏水洗涤2分钟×2次; 3组织：有条件时应及时固定;常规4%多聚甲醛/0.01M PBS或10%中性缓冲福尔马林固定4小时以上,石蜡包埋;切片常规脱蜡入水脱蜡务必干净;2.新鲜配制3%H2O2,室温处理10分钟;蒸馏水洗涤2分钟×3次;3.标本片加0.01M TBS1:200新鲜稀释Proteinase K37℃消化5-15分钟,0.01M TBS洗2分钟×3次;细胞涂片和冰冻切片一般不消化或消化10-60秒钟;新鲜石蜡切片消化5-10分钟;陈旧石蜡切片消化10-30分钟;4.标本片加标记缓冲液Labeling Buffer20μl/片,以保持切片湿润;按每张切片取TdT和DIG-d-UTP各1μl,加入18μl标记缓冲液中,混匀;甩去切片上多余液体后加标记液,20μl/片;置样品于湿盒中,37℃标记2小时;5.0.01M TBS洗2分钟×3次;6.加封闭液50μl/片,室温30分钟,甩掉封闭液,不洗;7.用抗体稀释液1:100稀释生物素化抗地高辛抗体：取1ml抗体稀释液加生物素化抗地高辛抗体10μl,混匀后50μl/片加至标本片上;置样品于湿盒中,37℃反应30分钟;0.01M TBS洗2分钟×3次;8.用抗体稀释液1:100稀释SABC：取1ml抗体稀释液加SABC10μl,混匀后50μl/片加至切片;37℃反应30分钟;0.01M TBS洗5分钟×4次;显色;10.苏木素轻度复染;脱水,透明,封片;显微镜观察;结果判定细胞核固缩有的呈碎片状,不规则,大小不一致,呈棕黄色颗粒者为阳性细胞; 即凋亡的细胞TUNEL改良方法在细胞凋亡检测中的应用.0M枸橼酸盐缓冲液、通透液%Triton-100、枸橼酸钠、标记缓冲液：二甲胂酸钠100mmol/L标记、二巯基苏糖醇L,氯化钴coci;TdT反应液；标记缓冲液中加TdT酶100U/ml,biotin-dUTP；链霉菌素标记的辣根过氧化物酶,蛋白酶K20μg/ml;显色剂氨乙基咔唑amino ethyl carbazole,AEC的配制AEC 20mg二甲酰胺DMF0.05M醋酸缓冲液 50ml%H2O2实验步骤1切片用冷风吹干后为防止冰冻切片脱片用1%火棉胶封片1分钟,PBS漂洗3×5分钟；23%H2O2阻断10分钟后PBS洗3×5分钟；3组织切片浸泡于盛有L枸橼酸盐缓冲液的烧杯中,置于微波炉内,在650W,辐射时间15min的条件下进行组织处理;冷却至室温;4放在通透液%Triton -100溶于%枸橼酸钠溶液中室温20分钟,PBS漂洗3×5分钟；5滴加50μl TdT反应液37℃1h,PBS漂洗3×5分钟；6滴加50μl biotin-dUTP,反应液37℃1h,PBS漂洗3×5分钟；7滴加50μl链霉菌标记辣根过氧化物酶液37℃孵育30分钟,8PBS漂洗3×5分钟, AEC-H2O2显色10-15分钟,苏木素复染用1%的酸性水分化,水洗、水溶性封片;阳性对照dTd 反应前用20μg/ml蛋白酶K处理切片;阴性对照用PBS代替dTd反应液; 结果判断及标准改良的方法：凋亡细胞核呈红色固缩,有白边集或碎列,细胞膜皱褶,有的卷曲和出泡,在计数时避开坏死区域,以避免假阳性;计数500个细胞中的凋亡细胞数目,得出凋亡百分率;凋亡染色分度如下：每个高倍视野平均1-3个为Ⅰ级；3-6个为Ⅱ级；6-10个为Ⅲ级；>10个者为IV级;阳性对照：经在dTd反应认前用20μg/ml蛋白酶,处理切片30分钟的切片同改良方法基本相同,但红色较浅;阴性对照：切片无棕色反应;评价正常的或正在增殖的细胞没有DNA的断裂,没有3’-OH末端被标记,因此镜下无显色的物质;这种分子生物学与形态学相结合的方法,可以对完整的单个凋亡细胞核或凋亡小体进行标记,准确反应细胞凋亡最典型的生物化学与形态学特征,灵敏度远远高于一般的组织化学和生物化学方法;在检测过程中,可设阴性对照不加TdT阳性对照已知的阳性标本;注意:AEC孵育切片,反应产物为红色;可用苏木精对衬染色,反应产物是纯酒精溶性的,因此;可用酸性水溶液分化,然后用水溶性封固剂封片;五、凋亡细胞：凝胶电泳检测前已提及凋亡细胞的突出特征是由于内源性核酸内切酶的激活而导致细胞核DNA的断裂;典型的细胞凋亡,在核内形成大量200bp大小及其倍体的核苷酸片段,而非典型的凋亡细胞,由于核内的DNA降解不完全,仅形成300~50kb的DNA大片;利用这一特性,可通过DNA凝胶电泳来判定凋亡的发生和发展情况;试剂1. PBS缓冲液2. 消化液的配制：100mmol/L NaCl10mmol/L Tris-HCL25mmol/L EDTA%SDSml蛋白酶K3. 酚：氯仿：异戊醇混合液按25:24:1比例配制;4. 氯仿：异戊醇混合液按24:1比例配制;5. 醋酸铵,L;6. 100%和70%的乙醇;7. TE 缓冲液：100mmol/L Tris-HCL,5mmol/L EDTA;8. TBE缓冲液;9. 电泳仪;。
细胞凋亡常见的检测方法
细胞凋亡常见的检测方法
细胞凋亡常见的检测方法包括：
1. 细胞形态观察：细胞凋亡时，细胞会出现形态改变，如细胞体积减小、细胞核变小、细胞膜起泡等，可以通过显微镜观察细胞形态的改变来判断细胞是否发生凋亡。
2. 核染色观察：通过核染色技术，如单染色或双染色，可使用碘化丙啶、DAPI等荧光染料或Giemsa染色等方法，观察细胞核的形态和染色情况，从而判断细胞是否发生凋亡。
3. DNA损伤分析：通过DNA断裂、破碎等损伤的检测方法，如凝胶电泳分析、单细胞凝胶电泳分析、TUNEL染色等，可以检测细胞DNA的完整性，判断细胞是否发生凋亡。
4. 细胞膜的磷脂外翻：通过荧光标记磷脂的外露，如荧光标记的Annexin V结合细胞膜上翻暴露的磷脂，可以评估细胞凋亡程度。
5. 细胞色素C的释放：细胞凋亡时，线粒体膜破裂导致细胞色素C的释放，可以通过免疫荧光染色或Western blot等方法检测细胞色素C的定位及含量，来判断细胞是否发生凋亡。
6. caspase酶活性检测：Caspase酶是细胞凋亡过程的关键执行酶，通过检测Caspase活性、测定Caspase相关蛋白的水解活性，如Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9等，可以判断细胞是否发生凋亡。
7. Annexin V/PI染色：通过Annexin V与细胞膜外露的磷脂结合，并使用胞内核酸染料PI进行双染色，可以实现对活细胞、早期凋亡细胞、晚期凋亡细胞的区分和定量。
tunel和dapi染色原理
TUNEL 和 DAPI 染色原理近年来，细胞生物学和病理学领域的研究对于细胞凋亡和核酸染色方法的需求逐渐增加。
TUNEL 和 DAPI 染色方法作为常用的细胞学染色技术，被广泛运用于细胞凋亡和核酸检测方面。
下面将对 TUNEL 和DAPI 染色原理进行详细介绍。
TUNEL（Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP Nick End Labeling）染色原理：1. TUNEL 染色原理概述TUNEL 技术是一种用于检测细胞凋亡的方法。
在细胞凋亡过程中，DNA 断裂是一个重要的特征。
TUNEL 技术利用末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）在 DNA 断裂端引入标记的 dUTP 的原理，通过检测 DNA 断裂端的标记来识别凋亡细胞。
2. TUNEL 染色方法步骤（1）取样处理：将样本固定和包埋后，进行脱水和脱脂等处理。
（2）蛋白酶预处理：利用蛋白酶处理打开细胞核膜，提高核酸的透过性。
（3）TUNEL 反应：在 TdT 的作用下，未修饰的末端脱氧核苷酸与荧光素化的 dUTP 形成共价结合。
（4）显微镜观察：使用荧光显微镜观察并拍摄图像。
3. TUNEL 染色原理应用TUNEL 染色方法被广泛应用于许多领域，如肿瘤研究、病理学、药理学等。
通过检测细胞中凋亡的程度，可以对生物样品进行定量和定性分析。
DAPI（4',6-diamidino-2-phenylindole）染色原理：1. DAPI 染色原理概述DAPI 是一种结合到 DNA 的蓝色荧光染料，具有高度亲和力和高度特异性。
DAPI 与 DNA 结合后在核型显微镜下会呈现出亮蓝色的荧光。
2. DAPI 染色方法步骤（1）细胞固定：利用适当的方式将细胞固定在载玻片上。
（2）DAPI 染色液：将含有 DAPI 的染色液滴在载玻片上，让细胞充分吸收。
（3）显微镜观察：利用蓝光激发荧光显微镜观察并拍摄图像。
3. DAPI 染色原理应用DAPI 染色方法在细胞学和病理学领域有着广泛的应用。
细胞凋亡检测方法
细胞凋亡检测方法细胞凋亡检测方法是利用特定的实验手段和技术来识别细胞凋亡的发生与否，观察细胞凋亡的程度。
细胞凋亡检测是生物过程中重要的一块，其能够反映细胞死亡的类型，从而可以帮助研究者确定细胞是否已经进入凋亡状态。
现在，细胞凋亡检测的常用方法有多样，包括水解酶活力分析、流式细胞术、免疫组化、细胞图像分析等。
1. 水解酶活力分析：水解酶活力分析法是目前使用最多的细胞凋亡检测方法，原理是以细胞内的水解酶活性（如肌酸激酶、核糖核酸酶）来反映细胞凋亡程度。
细胞凋亡检测方法将细胞悬液添加到活性检测液体，然后经过细胞溶解和脱水稀释后，细胞内的水解酶（如肌酸激酶或核糖核酸酶）就会被释放出来，测定其活力值。
通过比较正常细胞和凋亡细胞的活力值，可以判定细胞凋亡的程度。
2. 流式细胞术：流式细胞术是一种常用的检测细胞凋亡的方法，主要以细胞的DNA含量与形态特点作为检测凋亡的标志物。
通常，凋亡细胞的DNA含量要明显低于正常细胞，且凋亡细胞的形态特征也会发生明显的变化，比如大小、形状、酸性等。
3. 免疫组化：免疫组化是一种利用免疫细胞学技术检测细胞凋亡的方法，它主要是针对细胞凋亡伴随而出现的特定抗原，如多种酶、APO2.7及特有蛋白等。
通过洗涤细胞，并用带有特定抗原的抗体制作出免疫印迹，就可以观察到细胞凋亡的现象。
4. 细胞图像分析：这是一种以细胞形态及细胞图像分析来检测细胞凋亡的方法，主要是利用荧光显微镜或电子显微镜观察细胞，以及对被观察细胞的形态特点进行分析，根据细胞形态变化观察凋亡程度。
通过观察正常细胞与凋亡细胞的形态比较，便可以判断细胞是否进入凋亡状态。
上述是现时比较常用的细胞凋亡检测方法，它们都有一定的特点，可以根据不同的实验需求选择合适的检测方法。
然而，对于不同的细胞类型，其凋亡方式也可能会有所不同，可能需要使用不同的检测方法来进行识别细胞凋亡的发生与否。
因此，根据具体的实验，研究者可以选择合适的检测方法，配合研究凋亡发生机制，为研究凋亡提供科学依据。
细胞凋亡 染色种类
细胞凋亡染色种类
细胞凋亡染色有多种方法，包括以下几种常见的染色种类：
1. HE染色：这是一种常用的细胞凋亡染色方法，使用苏木素-伊红染料对细胞进行染色。
在光学显微镜下观察，凋亡细胞会呈现圆形，胞核深染，胞质浓缩，染色质成团块状的现象。
2. Giemsa染色：Giemsa染色也是一种常见的细胞凋亡染色方法。
正常细胞的核色泽均一，而凋亡细胞的染色质会浓缩、边缘化，核膜裂解，染色质分割成块状和凋亡小体等。
3. AO/PI双染色法：吖啶橙(AO)是一种荧光染料，能透过细胞膜使核DNA和RNA染色。
在荧光显微镜下观察，活细胞核呈黄绿色荧光，胞质呈红色荧光。
凋亡细胞核染色质呈黄绿色浓聚在核膜内侧，可见细胞膜呈泡状膨出及凋亡小体。
碘化丙啶(PI)是一种DNA 结合性染料，它不能透过完整的细胞膜，但在凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI能够透过细胞膜而将细胞核染红。
因此，通过AO/PI双染色法可以区分活细胞、凋亡细胞和坏死细胞。
4. Hoechst染色：Hoechst染料与DNA的结合是非嵌入式的，主要结合在DNA的A-T碱基区。
在紫外光激发下，活细胞核呈均匀淡蓝色荧光，凋亡细胞则呈现亮蓝色，或核呈分叶状、边集的荧光。
5. TUNEL染色：这是一种检测细胞凋亡中DNA断裂的方法。
在细胞凋亡过程中，会激活DNA内切酶，导致DNA断裂。
TUNEL 染色可以标记这些断裂的DNA，从而检测细胞凋亡。
以上信息仅供参考，如需了解更多关于细胞凋亡染色的信息，建
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细胞凋亡的几种检测方法
PI单染：实验方法原理其原理主要是根据细胞凋亡时在细胞、亚细胞和分子水平上所发生的特征性改变。
这些改变包括细胞核的改变、细胞器的改变、细胞膜成分的改变和细胞形态的改变等，其中细胞核的改变最具特征性，主要包括以下几个方面：1. 细胞核的改变由于凋亡细胞核的改变，造成各种染色体荧光染料对凋亡细胞DNA可染性发生改变。
研究表明，用各种染色体荧光染料对经固定的凋亡细胞进行染色，其DNA可染性降低。
许多学者把这种DNA可染性的降低认为是凋亡细胞的标志之一。
2. 光散射特性凋亡细胞形态上的改变影响它们的光散射特性。
在流式细胞仪上，前散射光与细胞的大小有关，而侧散射光反映的是光在细胞内的折射作用，与细胞内的颗粒多少有关。
在细胞凋亡时，细胞固缩，体积变小，故前散射光降低，这一特性往往被认为是凋亡细胞的特点之一。
此外细胞凋亡时由于染色体降解，核破裂形成，细胞内颗粒往往增多，故凋亡细胞侧散射光常增加。
细胞坏死时，由于细胞肿胀，其前散射光增大；侧散射光在细胞坏死时也增大，因此可根据前散射光和侧散射光区别凋亡细胞和坏死细胞。
但需要注意的是，根据前散射光和侧散射光判断凋亡细胞的可靠性受被检测细胞形态上的均一性和核胞浆比率影响很大。
因此在某些淋巴细胞凋亡中，用光散射特性检测凋亡的可靠性较好，而在肿瘤细胞凋亡中，其可靠性就较差。
根据光散射特性检测凋亡细胞最主要的优点是可以将光散射特性与细胞的表面免疫荧光分析结合起来，用以区别经这些特殊处理发生选择性凋亡的淋巴细胞亚型。
也可用于活细胞的分类。
实验材料细胞试剂、试剂盒PBS PI 蒸馏水乙醇仪器、耗材棕色瓶400目筛网流式细胞仪实验步骤一、收集细胞收集细胞｛数目约（1~ 5）×106个/mL｝，500~ 1 000 r/min离心5 min，弃去培养液。
二、细胞洗涤3 ml PBS洗涤1次。
三、乙醇固定离心去PBS，加入冰预冷的70%的乙醇固定，4℃，1-2小时。
四、细胞重悬离心弃去固定液，3 mlPBS重悬5 min。
流式细胞凋亡检测步骤
流式细胞凋亡检测步骤引言：细胞凋亡是一种正常的生理现象，它在维持机体稳态和调节细胞数量方面起着重要作用。
流式细胞凋亡检测是一种常用的方法，用于定量测量细胞凋亡程度。
本文将介绍流式细胞凋亡检测的步骤，并详细阐述每一步的操作方法和注意事项。
一、细胞准备在进行流式细胞凋亡检测之前，首先需要获得待检测的细胞样品。
这些细胞可以是体外培养的细胞系，也可以是从动物或人体组织中分离得到的原代细胞。
细胞样品应该在合适的培养条件下生长，确保其细胞活力和凋亡状态的稳定。
二、细胞收集细胞收集是流式细胞凋亡检测的关键步骤之一。
常用的方法有机械剥离、消化酶处理和离心等。
在收集过程中，需要注意尽量减少细胞损伤和凝聚物的形成。
收集的细胞应该进行适当的洗涤，以去除培养基中的残留物。
三、细胞固定细胞固定是为了防止细胞在后续处理过程中的损伤和凋亡。
常用的固定剂有甲醛、乙醛和乙酸等，可根据实验需要选择合适的固定剂和浓度。
固定处理后的细胞需要进行洗涤，以去除固定剂的残留物。
四、细胞染色细胞染色是流式细胞凋亡检测的核心步骤。
常用的染色剂有荧光素酶标记的Annexin V和PI（propidium iodide）等。
Annexin V 用于检测细胞外磷脂外翻的现象，而PI则用于判断细胞膜完整性。
染色剂的选择应基于实验目的和细胞类型，同时需要根据厂家提供的说明书进行操作。
五、流式细胞仪检测流式细胞仪是流式细胞凋亡检测的重要工具。
在进行检测之前，需要对流式细胞仪进行校准，包括激光功率、流速和检测通道的设置等。
校准后，将染色后的细胞悬浮液注入流式细胞仪中，通过激光的照射和细胞的流动，测量细胞的荧光强度和散射信号。
六、数据分析流式细胞仪检测得到的数据需要进行后续的分析和解释。
常用的数据分析软件有FlowJo、ModFit和Cyflogic等。
通过设置门，可以将细胞分为不同的亚群，分析细胞的凋亡率和凋亡类型等。
此外，还可以进行统计学分析，比较不同实验组之间的差异。
常用细胞凋亡检测方法
常用细胞凋亡检测方法一、细胞凋亡的形态学检测二、磷脂酰丝氨酸外翻分析（Annexin V法）三、线粒体膜势能的检测四、DNA片断化检测五、TUNEL法六、Caspase-3活性的检测七、凋亡相关蛋白TFAR19蛋白的表达和细胞定位分析一、细胞凋亡的形态学检测1 光学显微镜和倒置显微镜（1）未染色细胞：凋亡细胞的体积变小、变形，细胞膜完整但出现发泡现象，细胞凋亡晚期可见凋亡小体。
贴壁细胞出现皱缩、变圆、脱落。
（2）染色细胞：常用姬姆萨染色、瑞氏染色等。
凋亡细胞的染色质浓缩、边缘化，核膜裂解、染色质分割成块状和凋亡小体等典型的凋亡形态。
2 荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜一般以细胞核染色质的形态学改变为指标来评判细胞凋亡的进展情况。
常用的DNA特异性染料有：HO 33342 (Hoechst 33342)，HO 33258 (Hoechst 33258), DAPI。
三种种染料与DNA的结合是非嵌入式的，主要结合在DNA的A-T碱基区。
紫外光激发时发射明亮的蓝色荧光。
Hoechst是与DNA特异结合的活性染料，储存液用蒸馏水配成1mg/ml的浓度，使用时用PBS稀释，终浓度为10 ug/ml。
DAPI为半通透性，用于常规固定细胞的染色。
储存液用蒸馏水配成1mg/ml的浓度，使用终浓度一般为10 ug/ml。
结果评判：细胞凋亡过程中细胞核染色质的形态学改变分为三期：Ⅰ期的细胞核呈波纹状（rippled）或呈折缝样（creased），部分染色质出现浓缩状态；Ⅱa期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化；Ⅱb期的细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体(图1)。
3 透射电子显微镜观察结果评判：凋亡细胞体积变小，细胞质浓缩。
凋亡Ⅰ期（pro-apoptosis nuclei）的细胞核内染色质高度盘绕，出现许多称为气穴现象（cavitations）的空泡结构(图2)；Ⅱa期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化；细胞凋亡的晚期，细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体。
细胞凋亡检测方法总结
1、磷脂酰丝氨酸外翻分析（Annexin V法）磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine, PS）正常位于细胞膜的内侧，但在细胞凋亡的早期，PS可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中(图3)。
Annexin-V是一种分子量为35~36KD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，能与PS 高亲和力特异性结合。
将Annexin-V进行荧光素（FITC、PE）或biotin标记，以标记了的Annexin-V作为荧光探针，利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生。
PS转移到细胞膜外不是凋亡所独特的，也可发生在细胞坏死中。
两种细胞死亡方式间的差别是在凋亡的初始阶段细胞膜是完好的，而细胞坏死在其早期阶段细胞膜的完整性就破坏了。
碘化丙啶(propidine iodide, PI)是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但在凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI能够透过细胞膜而使细胞核红染。
因此将Annexin-V与PI匹配使用，就可以将凋亡早晚期的细胞以及死细胞区分开来。
在双变量流式细胞仪的散点图上，左下象限显示活细胞，为（FITC-/PI-）；右上象限是非活细胞，即坏死细胞，为（FITC+/PI+）；而右下象限为早期凋亡细胞，显现（FITC+/PI-）。
右上象限为独立的核（FITC-/PI+）。
Annexin-V可以再钙离子存在的情况下，和细胞表面外翻的磷脂酰丝氨酸结合，而磷脂酰丝氨酸的外翻是细胞凋亡的早期事件。
PI是一种DNA染料，当细胞凋亡的晚期，细胞的细胞膜通透性增加，PI从而进入细胞核与DNA结合。
所以Annexin-V阴性-PI阴性代表正常细胞Annexin-V阳性-PI阴性代表凋亡早期的细胞Annexin-V阳性-PI阳性代表凋亡晚期的细胞或坏死的细胞Annexin-V阴性-PI阳性一般不存在这一群细胞，如果出现这一团细胞可能是PI标记时间过长，或者操作过于剧烈而伤害到原本正常的细胞。
鉴定细胞凋亡的常用方法
鉴定细胞凋亡的常用方法细胞凋亡是一种重要的细胞程序性死亡方式，它在维持生物体内部环境平衡、维护组织器官正常生理功能、抵御病原菌感染等方面发挥着重要作用。
因此，研究细胞凋亡机制以及鉴定细胞凋亡的常用方法对于深入了解生物学过程、发现疾病的发生机制、开发新的治疗方案具有重要意义。
一、细胞凋亡的基本过程细胞凋亡是一种高度有序的细胞死亡方式，其基本过程包括：1. 细胞收缩：细胞核和细胞质均发生收缩，细胞体积明显缩小。
2. 核破裂：细胞核表现出凹陷、凝固和分裂等现象，核分裂成数个碎片，称为“凋亡小体”。
3. 细胞膜破裂：细胞膜破裂，凋亡小体释放出来。
4. 清除凋亡小体：周围的细胞或巨噬细胞将凋亡小体吞噬。
二、细胞凋亡的调控机制细胞凋亡的调控机制非常复杂，涉及到细胞内外多种信号通路的相互作用。
其中，主要的调控因子包括：1. 细胞因子：细胞因子可以促进或抑制细胞凋亡，例如，TNF-α、FasL等细胞因子可以诱导细胞凋亡，而FGF、IGF等细胞因子则可以抑制细胞凋亡。
2. 细胞内信号通路：细胞内信号通路包括细胞周期调控、细胞增殖、DNA损伤修复等，这些信号通路的失衡都可能导致细胞凋亡。
3. 凋亡相关蛋白：凋亡相关蛋白包括Bcl-2家族、Caspase家族、p53等，它们在细胞凋亡过程中发挥着重要作用。
三、鉴定细胞凋亡的常用方法为了鉴定细胞是否发生了凋亡，研究者们开发了多种方法。
下面我们将介绍几种常用的鉴定方法。
1. 细胞学观察法：细胞学观察法是最常见的鉴定细胞凋亡的方法之一。
通过显微镜观察细胞形态、核形态、凋亡小体等特征，可以判断细胞是否发生了凋亡。
2. DNA片段化检测法：DNA片段化检测法是检测细胞凋亡的一种常用方法。
在细胞凋亡过程中，由于核酸酶的作用，DNA会被分解成数个片段，这些片段可以通过电泳等方法检测出来。
3. TUNEL法：TUNEL法是检测细胞凋亡的一种敏感方法。
该方法基于末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）的作用，将dUTP标记在DNA断裂的3'末端，通过荧光或酶标记检测dUTP的存在，从而鉴定细胞是否发生了凋亡。
细胞凋亡 凋亡小体检测
细胞凋亡是一种程序性的细胞死亡过程，通常包括细胞收缩、核形态改变、染色质凝聚和最终形成凋亡小体等特征。
检测凋亡小体是判断细胞是否正在经历凋亡的一种方法。
以下是一些常用于凋亡小体检测的技术：
1. 荧光显微镜观察：可以使用荧光染色剂，如荧光显微镜观察凋亡小体的形成。
例如，使用DNA染色剂，如DAPI（4',6-diamidino-2-phenylindole）或者荧光标记的DNA结合染料，如Hoechst 33342，可以用来观察细胞核的变化。
2. 流式细胞仪：流式细胞仪是一种用于分析细胞的工具，可以通过流式细胞仪测定荧光标记的凋亡小体。
一些可用于凋亡小体检测的标记物包括荧光标记的DNA结合染料和特定的抗体。
3. 电镜观察：透射电镜可以提供高分辨率的图像，用于观察凋亡小体的超微结构。
这对于详细研究细胞内部的变化非常有用。
4. 凋亡小体DNA片段检测：凋亡小体形成通常伴随着DNA的断裂。
通过凝胶电泳或PCR等技术，可以检测到凋亡小体中的DNA片段，这也是一种常见的凋亡检测方法。
5. TUNEL染色法：终末脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP辅助染色法（TUNEL）是一种用于检测DNA断裂的方法，可以通过荧光或酶标记观察。
选择适当的方法取决于实验的具体需求和可用的实验设备。
在实验设计和执行中，注意选择合适的控制组，确保结果的准确性。
细胞增殖凋亡检验方法
细胞增殖凋亡检验方法细胞增殖和凋亡是细胞生物学中两个重要的过程，对于细胞生长、发育和疾病发展起着关键作用。
因此，研究细胞增殖和凋亡的检验方法对于揭示相关生物学过程以及发现新的治疗靶点具有重要意义。
本文将介绍几种常用的细胞增殖和凋亡检验方法。
一、细胞增殖检验方法1.MTT法MTT法（3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-2,5-二苯基四氮唑溴化物）是一种常见的细胞增殖检验法。
MTT可以在活细胞内还原生成紫色的福尔马因酸化物，通过测定细胞活性来评估细胞增殖情况。
该方法的优点是简便、快速、应用广泛，但只能评估细胞整体增殖情况。
2. Bromodeoxyuridine（BrdU）标记法BrdU标记法是一种侵入法，可以评估细胞的DNA合成和增殖。
细胞在培养基中加入BrdU，细胞会将其代入新合成的DNA链中。
然后，可以使用抗BrdU抗体来检测BrdU标记的细胞。
该方法对于细胞周期和增殖动力学的研究非常有用。
标记法EdU标记法是一种新兴的细胞增殖检验方法。
与BrdU类似，EdU也是一种DNA合成的标记物，但是与BrdU相比，EdU标记更加简单快速。
EdU可以通过与荧光染料的偶联来进行检测，对于多通道染色非常适用。
1. Annexin V-FITC/PI染色法Annexin V-FITC/PI染色法是一种常用的细胞凋亡检验方法。
Annexin V是一种钙离子依赖性磷脂酰丝氨酸的结合蛋白，在凋亡过程中会在细胞表面表达。
PI是一种DNA染料，用于区分凋亡和坏死细胞。
该方法可以通过流式细胞术或荧光显微镜来评估细胞的凋亡程度。
2. DNA Laddering检测法DNA Laddering检测法是一种检测凋亡的传统方法。
在细胞凋亡过程中，核酸会被酶切为200-300bp的碎片，形成明显的DNA阶梯状图案。
该方法通过DNA琼脂糖凝胶电泳来检测DNA断裂情况。
3.TUNEL法TUNEL法（dUTP尾部标记法）是一种直接检测DNA断裂的方法。
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细胞凋亡试验常用的方法（MTT法、荧光法、DNA琼脂糖凝胶电泳法与流式细胞仪检测法）
（一）药物对肿瘤细胞的抑制效应的MTT法：
用培养基将肿瘤细胞调整至2 X108个/L，在96孔板中每孔加入100ul细胞悬液于37℃、5% CO2下培养过夜。
次日每孔加入不同浓度的药物100mg/L作为试验组，设加完全培养基不加药物的阴性对照，并用功能明确的药物为阳性对照和0.5%的乙醇溶剂对照，每组均设4-6个复孔（平行孔）、37℃、5% CO2继续培养。
培养至12h、24h、48h、实验终止前4-6h加入10ulMTT（5g/L），培养4-6h后，阴性对照孔中已形成明显的蓝紫色颗粒结晶时加100ul/孔SDS-HCl终止反应，于37℃存放过夜。
用酶标仪在A570波长下测吸光度值，按下式计算抑制率
抑制率（%）=（1-试验组平均吸光度值/阴性对照组平均吸光度值）x 100%。
（二）荧光法：
选用上述最佳浓度作用于肿瘤细胞，培养细胞48h后，收货细胞用PBS洗2-3次后用0.4%多聚甲醛室温下固定30min。
弃去固定液，并用PBS洗2次后，用1%Triton X-100作用4min加入适量的0.5mg/L DAPI 荧光染色60min，用PBS冲洗3次，取10ul滴片，干燥后于荧光显微镜下检测断裂的颗粒和片状荧光。
（三）DNA琼脂糖凝胶电泳法：
1、DNA提取：
用大方瓶培养肿瘤细胞，每瓶10ml，细胞浓度为3 x 108个/ml，每隔药物浓度、作用时间均设2瓶，共分3个时间段，4个药物浓度。
共培养26瓶细胞。
分别于细胞中加入不同浓度的药物，于37℃、5% CO2中分别培养12h、24h、48h，收货细胞，用PBS洗2-3次。
于-20℃将细胞冷却处理10min后将细胞收集至离心管中，加1ml细胞裂解液，再加蛋白酶K，轻轻振摇使悬液混匀，成黏糊状，50℃过夜。
冷却后加入等体积的饱和酚溶液，混合后10000r/min离心10min，吸出上层水相，移至另一离心管中，再加入等体积饱和酚溶液重复抽提一次，直到无蛋白为止。
吸上清加入氯仿/异戊醇（24：1）按上述方法再抽提一次。
吸取水相层加入1/10体积的3mol/L的醋酸钠溶液，混匀。
再加入2.5倍体积冷无水乙醇，混合置-20℃处理30min后，10000r/min离心10min，沉淀部分为提供的DNA，弃去无水乙醇后用70%乙醇漂洗2次，将离心管倒扣在吸水纸上，吸干乙醇。
加入200ulTE缓冲液融解DNA，再加入25ul的RNA酶，置37℃作用30min，置4℃冰箱保存。
2、琼脂糖凝胶电泳：
TBE缓冲液配制1.8%琼脂糖凝胶。
在微波炉内煮沸至琼脂糖融解，待冷却至60℃时，加入溴化乙锭，使其终浓度为0.5mg/ml，混匀后灌胶。
待凝胶固定后放入含TBE电泳液的电泳槽内，使TBE电泳液盖过凝胶。
取10-15ul提取的各组DNA样品液与上样缓冲液按4：1比例混匀后点样。
60V电泳1h，用紫外透射仪观察梯形条带。
（四）透射电镜形态学观察法：
收集药物作用后最佳凋亡时期的凋亡肿瘤细胞，细胞总量大于10^6个，用PBS洗2遍后用3%戊二醛固定1h，PBS洗2次，再用1%锇酸固定1h，丙酮酸梯度脱水。
细胞用树脂包埋，并进行超薄切片，用醋酸钠-枸橼酸铅染色，透射电镜下观察凋亡的细胞形态，可见有染色质浓集，不均匀分布，考核周边形成有核膜包裹的断裂核碎片，呈新月形凋亡小体，并选择典型切片图像摄影。
（五）流式细胞仪检测法：
1、原理：
处于增殖周期中的细胞，根据其所处不同周期时相其DNA含量分布在2n-4n之间，发生凋亡的细胞内与核内DNA裂解成许多小片断，用细胞膜通透法可使小分子量的DNA片断穿过薄膜而丢失，仅剩下大分子量DNA片断，这些失去部分DNA的细胞可形成一个DNA 含量小于2n的分布区，称“亚G1峰”，即AO峰（凋亡峰）。
2.特点：
经济简便，仅需单一染色。
可判断凋亡细胞发生于哪一周期。
可定量测定凋亡率，结果客观可信。
用同样本可同时进行“亚G1峰”测定及DNA凝胶电泳。
3、方法步骤：
收货不同剂量药物作用于各不同时期的肿瘤细胞，细胞总数应大于10^6个，用PBS洗2次，加入70%酒精固定，4℃存放。
染色前用PBS离心沉淀去除固定液，并用PBS洗1-2次，加入200ulRNA酶，37℃水浴30min。
每毫升细胞悬液中加入碘化丙锭（PI）染液100ul混匀，置4℃避光30min，用流式细胞仪进行细胞周期分析，低于G1期DNA含量的细胞为凋亡细胞。
测定“亚G1峰”值和细胞凋亡率。
除上述常用的方法外，还可采用
ELISA法。
其凋亡的断裂核可与抗组蛋白抗体及抗DNA抗体混合物反应后形成双抗体“夹心”结构，再经酶显色也可判断。
末端转移的酶标记技术，利用核裂解碎片含有3/-OH的末端，在末端转移酶作用下加入已标记的核苷酸，在3/-OH末端上合成一段含标记的尾巴，再经酶显色或用荧光抗体显示出来。