单克隆抗体制备的技术
单克隆抗体制备的技术
基因工程小鼠制备全人抗体
全人抗体的基因工程小鼠包括人外周血淋巴细胞-严重联合免疫缺陷小鼠 （hu-PBL-SCID小鼠）、转基因小鼠和转染色体小鼠制备人抗体技术。
Hu-PBL-SCID小鼠是将已产生一定免疫反应的供者或癌症患者的人的外周 血淋巴细胞移植于严重联合免疫缺陷小鼠(SCID)，经抗原免疫后可获得人 源抗体。
单克隆抗体制备的技 术
基本概念
抗原决定镞（抗原表位） 细胞克隆 多克隆抗体 单克隆抗体
Antigenic determinant
是指抗原分子中决定抗原特异性的 特殊化学基团，又称表位(epitope).
细胞克隆： 由一个细胞增殖而成的细胞集团
Polyclonal antibody,PcAb：针对多种抗 原决定簇的混合抗体
可溶性抗原免疫原性弱，一般要加佐剂
目前，用于可溶性抗原(特别是一些弱抗原)的 免疫方案也不断有所更新，如①将可溶性抗原 颗粒化或固相化，一方面增强了抗原的免疫原 性，另一方面可降低抗原的使用量。②改变抗 原注入的途径，基础免疫可直接采用脾内注射。 ③使用细胞因子作为佐剂，提高机体的免疫应 答水平，促进免疫细胞对抗原反应性。
抗体的人源化技术进展:
• 单克隆抗体在世界生物工程制药业的支柱产品之一。 • 单抗将发展成为一大类独立医药产品。 • 鼠源性单克隆抗体将逐渐被人源化抗体所替代: 原因：1.鼠源性单克隆抗体与人补体成分结合能力低，
简述单克隆抗体产生的技术原理。
简述单克隆抗体产生的技术原理。
单克隆抗体产生的技术原理是通过克隆一种特定的抗体，使其能够针对特定的抗原。主要步骤包括：
1. 免疫原的选择：选择适当的免疫原，例如蛋白质、多肽、多糖等。
2. 免疫动物的选择：选择适当的免疫动物，如小鼠、兔子等，并注射免疫原，激发免疫反应。
3. 细胞融合：从免疫动物体内获得免疫细胞，如淋巴细胞，并与无限增殖的癌细胞（如骨髓瘤细胞）融合，形成杂交瘤细胞。
4. 杂交瘤筛选：将杂交瘤细胞分离并培养在选择性培养基中，筛选出能够产生特异性抗体的单个杂交瘤细胞。
5. 单克隆抗体的生产：将筛选出的单个杂交瘤细胞进行扩增，并收集其分泌的单克隆抗体。
6. 验证和纯化：验证所获得的单克隆抗体对特定抗原的特异性，并进行纯化，得到纯净的单克隆抗体。
单克隆抗体产生的技术原理可以通过细胞融合和杂交瘤筛选的
方法，从免疫动物中选择出能够产生特异性抗体的单个杂交瘤细胞，并通过扩增和纯化得到纯净的单克隆抗体。这种方法可以获得高度特异性和稳定性的抗体，用于研究、诊断和治疗等领域。
单克隆抗体制备步骤及注意事项
单克隆抗体制备步骤及注意事项
单克隆抗体（Monoclonal antibody，mAb）是指由单一B细胞克隆分
离得到的抗体，其具有高特异性和高亲和力。制备单克隆抗体的方法主要
有杂交瘤技术和重组DNA技术。以下是单克隆抗体制备的步骤及注意事项。
步骤一：抗原免疫
1.选择合适的抗原：根据需要检测的分子或细胞表面标志物，选择合
适的抗原。
2.免疫动物：常用的动物有小鼠、兔子等。选择适合的动物后，根据
抗原的种类和免疫动物对该抗原的敏感性，设计免疫方案。
3.免疫计划：免疫计划包括免疫剂量、免疫途径和免疫次数等。通常
先进行原位免疫，然后再以单体或混合抗原进行体内免疫。
步骤二：细胞融合
1.收集脾细胞：在最佳时期，解剖免疫动物，取出脾脏。
2.细胞培养：将收集的脾细胞在无菌条件下分散成单个细胞，并在培
养基中培养，以供细胞融合使用。
3.准备骨髓瘤细胞：选择合适的骨髓瘤细胞，例如NS0或SP2/0等。
将其培养至对数生长期。
4.细胞融合：在抗原刺激下，将脾细胞与骨髓瘤细胞以一定比例混合，用聚乙烯醇或其他化合物促进细胞融合。
步骤三：细胞筛选与扩展
1. HT增重培养：用含有hprt缺陷的培养基筛选融合细胞，以选择
杂交瘤细胞。
2. Limited Dilution扩展：以一细胞一孔的方式将杂交瘤细胞进行
有限稀释，使其实现单克隆化。
3.细胞培养：将单克隆细胞株移植到培养瓶中，进行培养和扩增。
步骤四：单克隆抗体鉴定
1.酶联免疫吸附试验（ELISA）：用ELISA方法筛选单克隆细胞株，
检测其抗原特异性。
2.免疫组织化学检测：将单克隆抗体应用于细胞和组织切片，检测其
单克隆抗体的制备(详细材料)
单克隆抗体的研制
一、单克隆抗体的概念
抗体是机体在抗原刺激下产生的能与该抗原特异性结合的免疫球蛋白。常规的抗体制备是通过动物免疫并采集抗血清的方法产生的，因而抗血清通常含有针对其他无关抗原的抗体和血清中其他蛋白质成分。一般的抗原分子大多含有多个不同的抗原决定簇,所以常规抗体也是针对多个不同抗原决定簇抗体的混合物。即使是针对同一抗原决定簇的常规血清抗体，仍是由不同B细胞克隆产生的异质的抗体组成。因而，常规血清抗体又称多克隆抗体（polyclonal antibody)，简称多抗。由于常规抗体的多克隆性质，加之不同批次的抗体制剂质量差异很大，使它在免疫化学试验等使用中带来许多麻烦.因此,制备针对预定抗原的特异性均质的且能保证无限量供应的抗体是免疫化学家长期梦寐以求的目标.随着杂交瘤技术的诞生,这一目标得以实现.
1975年，Kohler和Milstein建立了淋巴细胞杂交瘤技术，他们把用预定抗原免疫的小鼠脾细胞与能在体外培养中无限制生长的骨髓瘤细胞融合,形成B细胞杂交瘤。这种杂交瘤细胞具有双亲细胞的特征，既像骨髓瘤细胞一样在体外培养中能无限地快速增殖且永生不死，又能像脾淋巴细胞那样合成和分泌特异性抗体。通过克隆化可得到来自单个杂交瘤细胞的单克隆系,即杂交瘤细胞系，它所产
(monoclonal antibody），简称单抗.
与多抗相比，单抗纯度高，专一性强、重复性好、且能持续地无限量供应。单抗技术的问世，不仅带来了免疫学领域里的一次革命，而且它在生物医学科学的各个领域获得极广泛的应用，促进了众多学科的发展。
单克隆抗体制备技术的最新进展及应用前景
优点
库容量大，更容易筛选到目标分子 不需要考虑细胞毒性 避免了体内体外操作的转换，具有建库周 期短，筛选简便
此外，还有RNA-多肽融合技术， 转 此外，还有 基因小鼠制备全人抗体， 嵌合抗体等 单克隆抗体制备技术
6.展望
由于鼠源性单抗的免疫源性导致机体产生 一系列的急性反应，使药物的功效降低， 因此单抗的人源化 单抗的人源化是单抗药物的发展趋向 单抗的人源化
4.单克隆抗体的最新进展
4.1 噬菌体抗体库技术 基本原理：是用基因工程技术克隆人抗体 基本原理 可变区的全套基因，然后将克隆的基因插 入噬菌体编码衣壳蛋白的基因中，建立噬 菌体抗体文库，从而使该异源分子呈现于 噬菌体表面
制备方法： 制备方法：
将抗原包被在固项介质上， 将抗原包被在固项介质上，加入待筛选的噬菌体颗粒与 固定的抗原结合，获取结合的抗体， 固定的抗原结合，获取结合的抗体，将未结合的抗体洗 脱，从噬菌体库中筛选出针对特定抗原的特异性抗体的 可变区
4.2 核糖体展示技术 基本原理： 基本原理：
通过PCR 扩增目的基因的DNA 文库，同时加入启动子、 通过PCR 扩增目的基因的DNA 文库，同时加入启动子、 核糖体结合位点及茎环，并置于具有耦联转录／ 核糖体结合位点及茎环，并置于具有耦联转录／翻译的 无细胞翻译系统中孵育， 无细胞翻译系统中孵育，使目的基因的翻译产物呈现在 核糖体表面，并形成“mRNA-蛋白质-核糖体” 核糖体表面，并形成“mRNA-蛋白质-核糖体”三元复合 体 最后通过常规的免疫学检测方法， 最后通过常规的免疫学检测方法，通过固相化的靶分子 直接从三元复合体中筛选出感兴趣的核糖体复合体， 直接从三元复合体中筛选出感兴趣的核糖体复合体，再 利用RT RT扩增，经过多次循环过程， 利用RT-PCR 扩增，经过多次循环过程，最终筛选出高 亲和力的目标分子
杂交瘤技术的基本原理和单克隆抗体的主要制备步骤
杂交瘤技术的基本原理和单克隆抗体的主要
制备步骤
一、杂交瘤技术的基本原理
杂交瘤技术也称免疫杂交或抗体杂交，是用生物学和化学原理创造出人造抗体，也可以称之为“免疫抗体杂交”。它通过将特定基因段无细胞化学合成抗体与正常正常抗体不同种型的B细胞经免疫球蛋白结合物外溶胶连接起来，从而锁定它们在杂交抗体分子内部而形成杂交细胞，它们同时具有正常抗体结构的灵活性，并将合成的抗体的特异性的目的物结合到杂交抗体分子上，诱导杂交细胞生长，从而获得特异性的抗体。
二、单克隆抗体的主要制备步骤
(1)筛选实验：将目标蛋白质与抗原结合，合成抗原——抗体复合物，获得具有抗原识别能力的抗体解析表型细胞。
(2)定向克隆：在筛选步骤的B细胞中采用定向克隆技术，将抗原识别能力特异的B细胞从其他不特异的B细胞中挑选出来，使它们成为抗体库中的杂交瘤。
(3)表达克隆抗体：将各自的表达株根据特定蛋白质的表达量分类，并从抗体库中培养出单克隆表达株。
(4)纯化抗体：从单个杂交瘤表达抗体株中分离，纯化抗体，获得纯净的单克隆抗体。
3.细胞融合及单克隆抗体的制备
长命 不分泌抗体
骨髓瘤细胞
分泌抗体 长命
杂交瘤细
Köhler和Milstein, 1975 胞
1984年Nobel医学奖
3. 杂交瘤细胞的筛选 ：
脾细胞 (B淋巴细胞)
骨髓瘤细胞
杂交瘤 细胞
B/B
B M/M
M
不能长期存活
筛选出
不能长期存活
HAT培养基筛选
H, 次黄嘌呤; A, 氨基喋呤; T, 胸腺嘧啶
沉淀IgG
PBS溶解
透析
举例
抗HLA-G单克隆抗体的研制 及其初步鉴定
HLA-G：
❖ 属于非经典HLA-I分子
❖ 具有有限的多态性 ❖ 组织分布的局限性
HLA-G的生物学功能：
❖ 抑制NK细胞的杀伤活性
❖ 抑制T细胞增殖
❖ 可能抑制CTL杀伤活性
技术路线
抗原的选择 免疫原制备
SP2/0的准备
免疫动物 细胞融合 选择培养、筛选、克隆化
B淋巴细胞： HGPRT+， TK+
存活
骨髓瘤细胞： HGPRT-， TK-
死亡
单克隆抗体技术操作流程
1.动物免疫：
特定目标抗原
免疫
动物
刺激
脾脏中B淋巴细胞
B淋巴细胞大量增殖
目的： 在细胞融合后获 得尽可能多的分 泌针对于该目标 抗原的特异性抗 体的杂交瘤细胞.
单克隆抗体的制备及特点
单克隆抗体的制备及特点
第一篇：单克隆抗体的制备及特点
单克隆抗体
一、单克性抗体的制备
1、免疫动物是用目的抗原免疫小鼠，使小鼠产生效应B淋巴细胞的过程。
2、将准备好的骨髓瘤细胞与效应B淋巴细胞按一定比例混合，并加入促融合剂聚乙二醇或灭活的病毒。在聚乙二醇或灭活的病毒作用下，各种效应B淋巴细胞可与骨髓瘤细胞发生融合，形成杂交瘤细胞。
3、选择性培养选择性培养的目的是筛杂交瘤细胞。在选择性培养基上未融合的骨髓瘤细胞、未融合的淋巴细胞，但其本身不能在体外长期存活也逐渐死亡。只有融合的杂交瘤细胞才能在选择性培养基存活，杂交瘤细胞既能无限增殖，又能分泌特异性抗体
4、杂交瘤细胞的克隆化培养和抗体阳性检测。选择性培养基中生长的杂交瘤细胞，只有少数是分泌预定特异性单克隆抗体的细胞，因此，必须进行筛选和克隆化，筛选出能产生所需单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞。
5、单克隆抗体的大量制备单克隆抗体的大量制备重要采用动物体内培养法和体外培养法。
(1)体内培养法；用注射器抽取腹水，从中可获得大量单克隆抗体。
(2)体外培养法将杂交瘤细胞置于培养瓶中进行培养。从培养液中获取所需要的单克隆抗体。
二、单克性抗体的特点
特异性强、灵敏度高、能大量制备
三、杂交瘤细胞的特点
杂交瘤细胞既能无限增殖，又能分泌特异性抗体
四、单克隆抗体制备过程中有三个筛选过程
1、从脾脏中筛选出多种效应B细胞。
2、在特定的培养基中筛选杂交瘤细胞
3、进行克隆化培养和抗体阳性检测，筛选出能产生特定抗体并能无限增殖的杂交瘤细胞。
五、单克隆抗体应用的基本原理是：抗原——抗体的的特异性结合。
单克隆抗体技术路线
单克隆抗体技术路线
引言：
单克隆抗体技术是一种重要的生物医学研究方法，也是生物制药领域的重要工具。本文将介绍单克隆抗体技术的基本原理、制备步骤以及应用领域，以帮助读者更好地了解和应用这一技术。
一、单克隆抗体技术的基本原理
单克隆抗体技术是一种通过克隆单个抗体细胞，制备具有相同抗原结合特异性的抗体的方法。其主要原理是将抗原注射到实验动物体内，激发机体产生免疫应答，然后采集动物体内的B细胞，融合B 细胞与骨髓瘤细胞，形成杂交瘤细胞，最后通过筛选获得特异性抗原结合能力的单克隆抗体。
二、单克隆抗体制备步骤
1. 免疫原选择：选择合适的免疫原，通常为纯化的蛋白质或多肽。
2. 免疫程序：将免疫原注射到实验动物体内，激发免疫应答。
3. B细胞采集：从免疫动物体内采集脾细胞或淋巴结细胞，富集含有目标抗体的B细胞。
4. 杂交瘤细胞制备：将采集到的B细胞与骨髓瘤细胞融合，形成杂交瘤细胞。
5. 杂交瘤细胞筛选：通过限制性稀释法或酶标记法等方法，筛选出分泌特异性抗原结合能力的杂交瘤细胞。
6. 单克隆抗体生产：将筛选出的杂交瘤细胞进行扩增培养，收集培养上清液，纯化得到单克隆抗体。
三、单克隆抗体技术的应用领域
1. 生物学研究：单克隆抗体可用于特定分子或细胞的定位和鉴定，帮助研究者了解生物体内的生物过程和机制。
2. 临床诊断：单克隆抗体可用于检测和诊断疾病，如癌症、感染性疾病和自身免疫性疾病等。
3. 治疗应用：单克隆抗体可用于治疗某些疾病，如肿瘤、免疫性疾病和传染病等，具有较高的治疗效果和较低的副作用。
4. 生物制药：单克隆抗体作为生物制药领域的重要工具，可用于药物研发、质量控制和生产等方面。
单克隆抗体制备流程
单克隆抗体制备流程
首先，在单克隆抗体制备之前，需要选择一个适当的抗原。抗原可以
是蛋白质、多肽、糖类或其他小分子。选取抗原时，需要考虑抗原的表达
水平、抗原的免疫原性以及抗原的稳定性等因素。
接下来，选择一个合适的实验动物进行免疫。常用的实验动物有兔子
和小鼠。在免疫之前，需要先给实验动物注射适量的佐剂，以增强免疫效果。通常，实验动物会被多次免疫，每次免疫之间有一段时间的间隔。
在实验动物免疫一段时间后，可以进行细胞融合以产生混杂瘤细胞。
混杂瘤细胞通常是由B细胞和骨髓瘤细胞融合而成，对于小鼠骨髓瘤细胞，常用的有SP2/0和NS0细胞系。融合的方法主要有两种：一种是将免疫细
胞和骨髓瘤细胞混合，然后使用聚乙二醇（PEG）进行融合；另一种是使
用电击脉冲进行细胞融合。融合细胞会经过适当的培养条件进行筛选和扩增。
在融合细胞扩增过程中，会进行筛选以保证融合细胞是产生单克隆抗
体的。最常用的筛选方法是酶联免疫吸附测定（ELISA）。抗原会被固定
在微孔板上，然后将培养液中的细胞涂覆在孔中。如果其中一孔中有抗体
分泌，则抗原会被结合，并且可以通过添加辣根过氧化物酶（HRP）标记
的二抗和基质来检测抗体的存在。
经过筛选和鉴定后，选择一个或多个产生单克隆抗体的细胞进行单克
隆扩增。单克隆扩增时，可以通过细胞有限稀释法以及酵母酶聚合酶链式
反应（YAC-PCR）等方法进行。
最后，可以通过收集上述单克隆细胞的上清液或细胞提取物来得到单克隆抗体。上清液或细胞提取物中的抗体可以通过纯化方法，如蛋白A/G 亲和层析或蛋白L亲和层析等，得到纯化的单克隆抗体。
单克隆抗体制备的基本原理与过程？有什么意义？
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哈哈~我们刚考到这题
原理：
B淋巴细胞在抗原的刺激下,能够分化、增殖形成具有针对这种抗原分泌特异性抗体的能力.B细胞的这种能力和量是有限的,不可能持续分化增殖下去,因此产生免疫球蛋白的能力也是极其微小的.将这种B细胞与非分泌型的骨髓瘤细胞融合形成杂交瘤细胞,再进一步克隆化,这种克隆化的杂交瘤细胞是既具有瘤的无限生长的能力,又具有产生特异性抗体的B淋巴细胞的能力,将这种克隆化的杂交瘤细胞进行培养或注入小鼠体内即可获得大量的高效价、单一的特异性抗体.这种技术即称为单克隆抗体技术.
1）免疫脾细胞的制备制备单克隆抗体的动物多采用纯系Balb/c 小鼠.免疫的方法取决于所用抗原的性质.免疫方法同一般血清的制备,也可采用脾内直接免疫法.
2）骨髓瘤细胞的培养与筛选在融合前,骨髓瘤细胞应经过含8-AG 的培养基筛选,防止细胞发生突变恢复HGPRT的活性（恢复HGPRT的活性的细胞不能在含8-AG的培养基中存活）.骨髓瘤细胞用10%小牛血清的培养液在细胞培养瓶中培养,融合前24h换液一次,使骨髓瘤细胞处于对数生长期.
3）细胞融合的关键:
1技术上的误差常常导致融合的失败.例如,供者淋巴细胞没有查到免疫应答.这必然要失败的.
2融合试验最大的失败原因是污染,融合成功的关键是提供一个干净的环境,以及适宜的无菌操作技术.
4）阳性克隆的筛选应尽早进行.通常在融合后10天作第一次检测,过早容易出现假阳性.检测方法应灵敏、准确、而且简便快速.具体应用的方法应根据抗原的性质,以及所需单克隆抗体的功能进行选择.常用的方法有 RIA法、 ELISA法和免疫荧光法等.其中ELISA法最简便,RIA法最准确.阳性克隆的筛选应进行多次,均阳性时才确定为阳性克隆进行扩
单克隆抗体的制备
单克隆抗体的制备
一、单克隆抗体技术的原理
B淋巴细胞在抗原的刺激下，能够分化、增殖形成具有针对这种抗原分泌特异性抗体的能力。B细胞的这种能力和量是有限的，不可能持续分化增殖下去，因此产生免疫球蛋白的能力也是极其微小的。将这种B细胞与非分泌型的骨髓瘤细胞融合形成杂交瘤细胞，再进一步克隆化，这种克隆化的杂交瘤细胞是既具有瘤的无限生长的能力，又具有产生特异性抗体的B淋巴细胞的能力，将这种克隆化的杂交瘤细胞进行培养或注入小鼠体内即可获得大量的高效价、单一的特异性抗体。这种技术即称为单克隆抗体技术。
制备单克隆抗体的方法是用缺乏次黄嘌呤磷酸核糖转化酶或胸腺嘧啶核苷酸酶的瘤细胞变异株与脾脏的B细胞融合。采用HAT选择性培养基（培养基中加次黄嘌呤HyPoxanthine H，氨基喋呤Aminoopterin A及胸腺嘧啶核苷Thymidine T），在这种选择性培养基中，由于变异的瘤细胞不具有次黄嘌呤磷酸核糖转化酶或胸腺嘧啶核苷激酶，所以不能利用培养基中的次黄嘌呤或胸腺嘧啶核苷而合成DNA。而只能利用谷酰胺与尿核苷酸单磷酸合成DNA，这一途径又被氨基喋呤所阻断，所以未融合的瘤细胞不可避免也要死亡。融合的杂交瘤细胞由于脾淋巴细胞具有次黄嘌呤磷酸核糖转化酶，可以通过次黄嘌呤合成DNA，克服氨基喋呤的阻断，因此杂交瘤细胞大量繁殖而被筛选出来。B淋巴细胞在一般培养基中不能长期生长，一般于二周内均死亡。
单克隆抗体与常规抗体相比有如下优点：①单一特异性，与一个抗原决定簇反应；②可重复性，能够提供完全一样的抗体制剂；③一经制出，可无限量地供应；④生产单克隆抗体，不一定需要纯的抗原；⑤能查出混合物中存在的用常规方法查不出的少量成分。
简述单克隆抗体的制备过程
简述单克隆抗体的制备过程
随着生物技术的发展和应用的广泛，单克隆抗体作为一种重要的生物分子工具，在医学诊断、治疗和科学研究领域发挥着重要作用。单克隆抗体是通过体外复制细胞免疫应答过程中产生的单一克隆抗体分子，具有高度特异性和亲和力。下面将简要介绍单克隆抗体的制备过程。
第一步：免疫原的选择
制备单克隆抗体的第一步是选择适当的免疫原。免疫原可以是蛋白质、多肽、糖类、脂类等生物大分子，也可以是一种特定的细胞、细胞表面分子或化合物。免疫原的选择应根据需要检测或研究的目标来确定。
第二步：免疫动物的选择和免疫过程
为了制备单克隆抗体，需要选择适当的免疫动物。常用的免疫动物包括小鼠、兔子、大鼠等。免疫过程分为初次免疫和加强免疫两个阶段。初次免疫是将免疫原注入免疫动物体内，刺激机体产生免疫应答。加强免疫是在初次免疫后再次注入免疫原，以增强机体的免疫应答。
第三步：细胞融合和杂交瘤的建立
细胞融合是制备单克隆抗体的关键步骤。它是将免疫动物体内产生的抗体产生细胞与骨髓瘤细胞融合，形成杂交瘤细胞。常用的骨髓
瘤细胞包括SP2/0和NS0等。融合细胞的选择和优化是确保制备高效单克隆抗体的重要因素。
第四步：筛选和克隆单克隆抗体细胞
融合细胞后，需要进行单克隆抗体细胞的筛选和克隆。常用的筛选方法包括限稀稀释法、酶联免疫吸附试验等。通过这些筛选方法可以筛选出产生目标抗体的单个细胞克隆。
第五步：单克隆抗体的生产和纯化
筛选出单克隆抗体细胞后，需要进行大规模培养和生产。单克隆抗体的生产可以通过体外培养细胞和动物体内生产两种方式进行。体外生产是将单克隆抗体细胞培养在培养基中，利用生物反应器等设备进行大规模培养。动物体内生产是将单克隆抗体细胞移植到合适的动物体内，利用动物自身的机制产生单克隆抗体。之后，通过各种纯化方法，如蛋白A/G亲和层析、离子交换层析、凝胶过滤层析等，从培养物中纯化出单克隆抗体。
单克隆抗体技术的应用和制备
单克隆抗体技术的应用和制备
一、单克隆抗体的应用
抗体是由B淋巴细胞分化形成的浆细胞合成、分泌的。每一个B淋巴细胞在成熟的过程中通过随机重排只产生识别一个抗原的抗原受体基因。动物脾脏有上百万种不同的B淋巴细胞系，重排后具有不同基因不同的B淋巴细胞合成不同的抗体。当机体受抗原刺激时，抗原分子上的许多决定簇分别激活各个具有不同基因的B细胞。被激活的B细胞分裂增殖形成效应B细胞（浆细胞）和记忆B细胞，大量的浆细胞克隆合成和分泌大量的抗体分子分布到血液、体液中。如果能选出一个制造一种专一抗体的浆细胞进行培养，就可得到由单细胞经分裂增殖而形成细胞群，即单克隆。单克隆细胞将合成针对一种抗原决定簇的抗体，称为单克隆抗体。
单克隆抗体药物的技术开发经历了鼠源单克隆抗体、人-鼠嵌合抗体、人源化抗体、全人源抗体。这三种治疗性的单克隆抗体都已经在美国上市，鼠源性单克隆抗体由于副反应大，代谢快，已经逐渐退出市场。不过，由于这一特点，目前放射性元素标记的单克隆抗体药物主要使用鼠源性单克隆抗体。近年来开发的单克隆抗体主要是人源化的单克隆抗体，人源化及全人源单克隆抗体由于副反应小，在体内停留时间长，有利于治疗。
单克隆抗体的主要应用
1、作为诊断试剂：单克隆抗体最广泛的应用就是作为诊断试剂。由于单克隆抗体纯度高、特异强，能准确地识别抗原物质的细微差别，并能与一定抗原特异性结合。
2、用于治疗疾病和运载药物。把抗癌细胞的单克隆抗体放射性同位素、化学药物或细胞毒素结合制成生物导弹。利用抗原——抗体的的特异性结合，借助单克隆抗体的导向作用，能将药物定向带到癌细胞所在部位，在原位杀死癌细胞，不损伤正常细胞、药剂量少、疗效高、毒副作用小。
免疫学技术(单抗的制备)
创立者：
1975年 Kohler
&
Milstein
创立单克隆抗体技术，获得1984年诺贝尔医学和生理 学奖
单抗概况
1975年分子生物学家G.J.F. Kohler和C. Milstein在 细胞杂交技术的基础上，创建立杂交瘤技术，使经绵 羊红细胞(SRBC)免疫的小鼠的脾细胞，与小鼠的骨髓 瘤细胞融合，并由此创建了第一个B细胞杂交瘤细胞 株，获得了抗SRBC的单克隆抗体。这是免疫学乃至 医学史上的一个里程碑。
I.可能在培养液中释放某种生长刺激因子； II.满足新生细胞对细胞密度的依赖性; III.减少聚苯乙烯培养板孔对新生细胞的毒性等
步骤四 细胞融合
方法： 电融合 激光融合 离心融合 灭活的病毒融合 聚乙二醇融合法
SP2/0细胞与脾细胞的比例为1：2～5
步骤五 选择性培养
HAT选择培养基：
H（Hypoxanthine）:次黄嘌呤
注意事项
操作中的污染，污染是杂交瘤技术中最常遇到的问 题，它往往可使一个即将建株的细胞毁于一旦。
杂交瘤产生各种免疫球蛋白，但主要是IgG和IgM，
究竟是哪种为主，则决定于抗原的免疫程序。免疫一 次，且3天后就取脾，多为产生IgM的B淋巴细胞。免 疫多次的多为IgG。
单克隆抗体的优缺点
优点 ：
单抗特点
一是特异性，针对特定的单一抗原表位，它具 有高度的特异性，抗肿瘤抗体药物的研究表明，其特 异性主要表现为特异性结合、选择性杀伤靶细胞、体 内靶向性分布以及具有更强的疗效。 二是多样性，主要表现在靶抗原的多样性、抗体 结构的多样性、作用机制的多样性等方面。 三是定向性，抗体药物可以定向制造，就是根据 需要制备具有不同治疗作用的抗体药物。基于这些特 点，我们可以用来制成“生物导弹”运送药物至病害 部位，主要是癌细胞，从而达到治疗效果。
单克隆抗体技术原理
单克隆抗体技术原理
单克隆抗体技术
什么是单克隆抗体技术？
•单克隆抗体技术是一种基于细胞培养和免疫学原理的技术，用于生产单种特定的抗体。
•单克隆抗体由同源的单一免疫细胞分泌，具有高度特异性和亲和力。
单克隆抗体技术的原理
1.抗原注射:
–抗原是引起免疫反应的物质，将特定抗原注射到动物体内，刺激免疫系统产生抗体。
2.巨细胞瘤细胞融合:
–从免疫动物中收集免疫细胞（B细胞），以及标记有癌细胞特异性抗原的肿瘤细胞（如骨髓瘤细胞），两者进行细
胞融合。
3.杂交瘤细胞的筛选:
–将细胞混合物培养在含有抗生素的培养基中，只有细胞融合体（既含有B细胞的DNA，又含有骨髓瘤细胞的特异性
特征）可以存活下来。
4.克隆化:
–将培养基中的细胞单独分离，形成单个细胞的克隆，以确保每个克隆细胞来自同一株杂交瘤细胞。
5.抗体筛选:
–利用特定抗原对克隆细胞进行筛选，筛选出产生特定抗体的克隆细胞。
6.抗体生产:
–将筛选出的克隆细胞进行大规模培养，产生大量单克隆抗体。
单克隆抗体技术的应用
•生物医学研究：
–单克隆抗体可用于研究特定分子的功能、相互作用和调控机制，对药物研发和疾病治疗有重要意义。
•免疫治疗：
–单克隆抗体可用于治疗肿瘤、自身免疫疾病等，通过特异性识别并靶向攻击病理相关分子。
•诊断应用：
–单克隆抗体可用于检测特定分子的存在并进行定量分析，如血液中的肿瘤标志物。
•生物传感器：
–单克隆抗体可用于构建高灵敏的生物传感器，检测环境中的污染物或特定分子。
总结
单克隆抗体技术基于免疫原理，通过抗原注射、细胞融合、筛选、克隆化等步骤，可获得特异性高的单克隆抗体。该技术在生物医学研究、免疫治疗、诊断应用和生物传感器等领域具有广泛的应用前景。
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饲养细胞一般在融合前一天制备
免疫脾细胞：处于免疫状态脾脏中B淋巴 母细胞-浆母细胞。一般取最后一次加强 免疫3天后的脾脏。
融合比例：
骨髓瘤细胞：脾细胞=1：5或1：10
融合剂：40%PEG（分子量1000-2000）
融合24小时后加HAT培养液 2周后 改用HT培养液2周后,改用一般培养液
抗体的人源化技术进展:
• 单克隆抗体在世界生物工程制药业的支柱产品之一。 • 单抗将发展成为一大类独立医药产品。 • 鼠源性单克隆抗体将逐渐被人源化抗体所替代: 原因：1.鼠源性单克隆抗体与人补体成分结合能力低，
2.CDC作用相应较弱，对肿瘤细胞的杀伤能力较弱； 3.与NK等免疫细胞表面Fc受体亲和力弱，介导的ADCC作用较弱； 4.鼠源抗体半衰期短，发挥ADCC与CDC作用的时间较短； 5.鼠单克隆抗体具有免疫原性，宿主易产生抗抗体引起过敏反应。
鼠抗体人源化的构建方法:
嵌合抗体：利用DNA重组技术将鼠单抗的轻、重链可变Hale Waihona Puke Baidu基因插入含有人抗体
恒定区的表达载体中，转化哺乳动物细胞表达出人鼠嵌合抗体，其人源化程度 达到70%左右，完整地保留了异源单抗的可变区，最大限度地保持了其亲和活性 ，降低了免疫原性。但由于人鼠嵌合抗体仍然保留了30%的鼠源性，可诱发人抗 小鼠反应HAMA。
Ab4
Ab3
Ab2
普通抗血清（多克隆抗体） Ab4
骨髓瘤小鼠
脾
取腹水
B 细
骨髓瘤细胞
胞
+ PEG, 融合
杂交瘤细胞
HAT培养， 稀释
Ab1
单克隆A抗b3体 Ab4
杂交瘤技术的理论基础
淋巴细胞产生抗体的克隆选择学说，即 一种克隆只产生一种抗体
细胞融合技术产生的杂交瘤细胞可以保 持双方亲代细胞的特性
克隆化方法：有限稀释法、软琼脂平板法、显 微克隆法
阳性杂交瘤细胞应及时冻存，防染色体丢失、 变异及污染
单抗生产的方法：
动物体内诱生法：小鼠腹腔注射降植丸 或液体石蜡，1周后腹腔注射杂交瘤细胞， 7-10天后出现腹水，无菌采集。
单抗纯化方法：
盐析 凝胶过滤 离子交换层析 亲和层析法 辛酸沉淀法
脾-脾杂交细胞
未融合的脾细胞
骨髓瘤-骨髓瘤杂交细胞
免疫动物
培养骨髓瘤细胞
收集致敏的B淋巴细胞 收集骨髓瘤细胞
细胞融合
HAT选择培养基筛选杂交瘤细胞
检测筛选阳性细胞
克隆化培养（反复3-5次）
获得稳定分泌McAb的杂交瘤细胞株
McAb的制备（杂交瘤培养上清或诱生腹水）
McAb 纯化及鉴定
制备单克隆抗体的基本技术
单克隆抗体特性
理化性状高度均一，生物活性专一，只 与一种抗原表位发生反应，特异性强， 纯度高，易于实验标准化和大量制备
单克隆抗体在医学中的应用
检验医学诊断试剂 （1）病原微生物抗原抗体的检测 （2）肿瘤抗原的检测 （3）免疫细胞及其亚群的检测 （4）激素测定 （5）细胞因子的测定 蛋白质的提纯 肿瘤的导向治疗和放射免疫显像技术
一般在杂交瘤细胞布满孔底1/10时，开 始检测特异性抗体，筛选出所需杂交瘤 细胞系。
可靠的筛选方法须在融合前建立，避免 由于方法不当贻误筛选时机。
克隆化：指将抗体阳性孔进行克隆化。目的是 将抗体分泌细胞、抗体非分泌细胞、特异性抗 体分泌细胞和无关抗体分泌细胞分开。
克隆化的原则：尽早进行，反复4-5次
1 抗原提纯与动物免疫 2 骨髓瘤细胞及饲养细胞的制备 3 细胞融合 4 抗体检测 5 杂交瘤的克隆化和冻存 6 McAB的制备 7 单克隆抗体的纯化
免疫成功的标志是在融合时脾脏能够提 供处于增殖状态的特异性B细胞，此时血 清中抗体效价不一定最高。
可溶性抗原10-15ug/100ul+等量弗氏完 全佐剂注射小鼠腹腔2-4周后加强免疫 （量减半，改用不完全佐剂，可反复多 次)冲击免疫（融合前3天进行）
转基因小鼠：将人抗体生产基因转入小鼠，以替换小鼠的抗体生成基
因。转基因小鼠制备人抗体的优点是，其功效优于其它生产抗人体蛋白单 抗技术。不足之处：(1)转基因通常有体细胞突变和其它独特的序列，导 致不十分完全的人序列；(2)由于抗体是在小鼠体内装配，因而产生的单 抗具有鼠糖基化模式，所以这些单抗最终并不是全人的；(3)转基因小鼠 表达的人Ig多样性较少，而且在同一小鼠中不能够产生IgG各亚类。
2.主要途径：
氨基 酸
鸟嘌呤核苷酸
谷 氨 酰 胺 （A-）
尿核苷单磷酸
胸腺嘧啶核苷酸
TK
3.次要途径：胸腺嘧啶核苷（T）
HAT选择培养基的原理
HAT选择培养基组分 次黄嘌呤（hypoxanthine,H) 氨甲喋呤（aminopterin,A):叶酸拮抗剂 胸腺嘧啶核苷（thymidine,T)
转染色体牛:
产生人Ig 转染色体牛的构建过程仍旧利用MMCT法，将构建的含有人Ig 轻重链基因片段的人人工染色体(HAC)，导入牛胚胎成纤维细胞，进一步 发育成转染色体牛。
产生人Ig 转染色体牛的构建特点在于：
(1)由于牛胚胎干细胞不能成功建系， 因此将人人工染色体导入牛胚胎成 纤维细胞；
(2)转染色体牛用核移植的方法来建立；
基因工程小鼠制备全人抗体
全人抗体的基因工程小鼠包括人外周血淋巴细胞-严重联合免疫缺陷小鼠 （hu-PBL-SCID小鼠）、转基因小鼠和转染色体小鼠制备人抗体技术。
Hu-PBL-SCID小鼠是将已产生一定免疫反应的供者或癌症患者的人的外周 血淋巴细胞移植于严重联合免疫缺陷小鼠(SCID)，经抗原免疫后可获得人 源抗体。
(3)由于牛胚胎成纤维细胞仅能够存活35代，含有人HAC 的微细胞与牛胚 胎成纤维细胞融合后，牛胎儿成纤维细胞只能再存活7d，因此必须经过2 次筛选，确保HAC在转染色体牛体内的高存留率。转染色体牛生产人多 抗，可以在短时间内大量获得，所以，转染色体牛获得的人多抗可以在一 定程度上弥补转染色体小鼠的不足，应付突发事件的发生。
单克隆抗体制备平台建立
尹芝南 美国耶鲁大学医学院副教授 南开大学生命科学学院院长
基本概念
抗原决定镞（抗原表位） 细胞克隆 多克隆抗体 单克隆抗体
Antigenic determinant
是指抗原分子中决定抗原特异性的 特殊化学基团，又称表位(epitope).
细胞克隆： 由一个细胞增殖而成的细胞集团
基因工程抗体与抗体库技术
单抗体内应用和疗效受限原因： 1.鼠源性单抗对人体有较强的免疫原性 2.注入人体的单抗在肿瘤部位的摄取量
甚少 3.生产成本高,难于普及应用
人杂交瘤技术未获真正突破原因:
融合率低、建株难、不稳定、产量低、人体不 能随意免疫
基因工程抗体：用基因工程技术改造现有优良 的鼠单抗基因，着眼点在于尽量减少抗体中的 鼠源成分，但又尽量保留原有的抗体特异性。
利用代谢缺陷补救机理筛选杂交瘤细胞， 并克隆化，制备McAb
当两个细胞紧密接触时，细胞膜可能融 合在一起。融合细胞含有两个不同的细 胞核，称为异核体，产生具有原来两个 细胞基因信息的单个核细胞，称为杂交 细胞（hybrid cell）。
细胞DNA合成途经
1.替代途径：次黄嘌呤（H）
HGPRT
Polyclonal antibody,PcAb：针对多种抗 原决定簇的混合抗体
Monoclonal antibody,McAb:由单个B细胞 克隆产生的针对单一抗原决定簇的同源 抗体
单 克 隆 抗 体 和 多 克 隆 抗 体 产 生 区 别Ab1 示 意 图
抗原
Ab1
Ab2 Ab3
抗血清
选用6-12周龄Balb/c小鼠
颗粒性抗原免疫性较强，不加佐剂就可获得很 好的免疫效果
可溶性抗原免疫原性弱，一般要加佐剂
目前，用于可溶性抗原(特别是一些弱抗原)的 免疫方案也不断有所更新，如①将可溶性抗原 颗粒化或固相化，一方面增强了抗原的免疫原 性，另一方面可降低抗原的使用量。②改变抗 原注入的途径，基础免疫可直接采用脾内注射。 ③使用细胞因子作为佐剂，提高机体的免疫应 答水平，促进免疫细胞对抗原反应性。
全人源化抗体
完全人抗体的形成始于二十世纪九十年代，目前获得全人源化抗体方法有抗体库 筛选技术、基因工程小鼠制备全人抗体、转染色体牛。
2.1 抗体库筛选技术:
抗体库筛选技术主要包括噬菌体抗体库和核糖体展示技术。
噬菌体抗体库技术：从免疫或未被免疫的B细胞中分离抗体可变区基
因；PCR 扩增抗体全套基因片段(如VH、VL)，将体外扩增的VH、VL 基因片段随机克隆入相应载体，形成组合文库；将基因组合文库插入噬 菌体编码膜蛋白的基因Ⅲ(g3) 或基因Ⅷ(g8) 的先导系列的紧靠下游，使 外源基因表达的多肽以融合蛋白的形式展示在外壳蛋白gp Ⅲ或gp Ⅷ的N 端。用固相化抗原经“亲和结合—洗脱—扩增”数个循环直接、方便、 简捷、高效地筛选出表达特异性好、亲和力强的抗体噬菌体库。
表面重塑抗体：对鼠抗体表面氨基酸残基进行人源化改造。该方法的原则是仅
替换与人抗体SAR差别明显的区域，在维持抗体活性并兼顾减少异源性基础上选 用与人抗体表面残基相似的氨基酸替换:互补决定区（CDR）构象的残基尽量不 替换。
重构抗体：由异源抗体中与抗原结合相关的残基与人抗体重新拼接构建的，包
括CDR区移植，部分CDR移植和特定决定区（SDR）转移。
脾
抗原免疫的脾细胞(B细胞) 小鼠骨髓瘤细胞(B细胞恶性肿瘤)
1.抗体分秘(IgG+)
1.具永生性
2.HGPRT+在HAT生长
2. 8AG筛选出HGPTP-株
PEG 融合 HAT筛选
脾-骨髓瘤细胞（杂交瘤细胞）
（HGPRT+、Ig+）
融合的结果及命运
未融合的骨髓瘤细胞
杂交瘤细胞
抗体库技术：用细菌克隆取代B细胞克隆表达 抗体，不经细胞融合，甚至不经免疫，制备针 对任何抗原的单克隆抗体。
单克隆抗体药物概况
单克隆抗体（MAB）是近年来复合年增长率最大的
一蛋白类药物，2001年全球销售额增长了57.3%，接 近30亿美元。在这类产品中开发主要集中在癌症治疗 药物方面。预计到2010年用于癌症治疗的单克隆抗体 将占其销售总额的54.7%。据预测，单克隆抗体将会 以复合年增长率16.3%的速度增长，到2010年达到 121.39亿美元的市场规模。其中，治疗癌症的单克隆 抗体市场规模将达66.36亿美元。
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Dec.5.2007
摄于新疆喀纳斯湖2005.8.18
转染色体小鼠：通过微细胞介导法（MMCT方法）将人14号染 色体上产生IgH 的胚系片段和2号染色体上5～50 Mb 的κ轻 链片段转染到ES细胞，获得小鼠经人血清白蛋白免疫之后， 可产生抗人血清白蛋白的人Ig，再次免疫后IgM产生。由转染 色体技术得到的小鼠，表达的人IgG各亚类的量与人血清中表 达的IgG各亚类类同，且可同时在一个转基因小鼠内表达；但 是，转染色体小鼠导入的人Ig 片断虽然比较大，但其表达的 人Ig量却比较低。
骨髓瘤细胞系选择要点：
稳定易培养、自身不分泌Ig、融合率高、 HGPRT缺陷株
常用骨髓瘤细胞系：NS1、SP2／0、X63 等。 保存：防止突变、定期筛选（8-氮鸟嘌呤）
防止支原体污染（胎牛血清）
融合时保证骨髓瘤细胞处于对数生长期，良好 的形态，活细胞计数高于95％
融合比例 脾细胞：骨髓瘤细胞=3：1许多环 节需要加饲养细胞，如：在杂交瘤细胞筛选、 克隆化和扩大培养过程中