蛋白质的两性性质及等电点的测定
实验一蛋白质的两性反应及等电点的测定2
实验一蛋白质的两性反应及等电点的测定2一、实验目的1、学习蛋白质的两性反应；二、实验仪器pH计、电泳槽、电源、紫外分光光度计、比色皿、恒温水浴箱等。
三、实验原理蛋白质分子中含有大量的离子基团，它们可以接受或释放H+离子，从而表现出两性反应的特征。
根据pH的变化，蛋白质分子的电荷状态和溶解性都会发生改变。
不同蛋白质的两性反应的pH区间有所不同，但都表现出了一定的规律性。
一般来说，蛋白质的等电点（pI）即蛋白质分子带的净电荷等于零时的pH值。
在这个pH值附近，蛋白质分子的溶解度最低。
2、等电聚焦电泳等电聚焦电泳（isoelectric focusing, IEF）是基于蛋白质分子的等电点原理，运用电场作用于溶液中的蛋白质使其向等电点运动，到达等电点时就不再运动，电场作用力为零，从而使蛋白质在等电点处聚焦。
该技术可以高效地将蛋白质分子分离开，并且不产生电荷的副反应。
IEF的缺点是需要高纯度的蛋白质样品和复杂的设备。
四、实验操作1、示范两性反应的现象制备两个100mL的肉汤。
其中一个加入适量的氢氧化钠溶液，并记录溶液的pH值。
将两个溶液放在一起，观察两溶液之间的相互作用。
2、测定牛血清白蛋白（BSA）的pI值将0.1g的BSA溶解于100mL的蒸馏水中，并调整pH至2.0。
加入适量的氢氧化钠溶液，逐渐增加溶液的pH值。
每次变化pH值0.5时，用pH计测定一次溶液的pH值，并记录BSA 对应的电泳距离。
将记录的数据制成曲线图。
由BSA的等电点的定义，等电点的pH值应该是曲线的最低点。
3、等电聚焦电泳测定蛋白质的等电点（1）样品的制备制备10mL的蛋白质样品，如卵清蛋白（ovalbumin）、BSA、牛血浆血清白蛋白（BSC）、胰岛素等。
将蛋白质样品以蒸馏水稀释至10μg/μL。
（2）样品的前处理a. 加入10μL的pH 3-10缓冲液、10μL的非离子型洗涤剂和80μL的样品。
b. 活化酶处理：在样品中加入基质，辅助样品中蛋白酶的活化。
蛋白质的两性反应和等电点测定
蛋白质的两性反应和等电点测定一、实验目的1.熟悉蛋白质的沉淀反应、颜色反应和两性反应及其机理。
2.掌握蛋白质等电点的测定方法及其原理。
3.掌握蛋白质电荷的测定方法及其机理。
二、实验原理(一)蛋白质的沉淀反应原理蛋白质的水溶液是一种比较稳定的亲水胶体，这是因为蛋白质颗粒表面带有很多极性基团，如—NH3+，—COO-，—SH，—CONH2等和水有高度亲和性，当蛋白质与水相遇时，就很容易被蛋白质吸住，在蛋白质颗粒外面形成一层水膜(又称水化层)。
水膜的存在使蛋白颗粒相互隔开，颗粒之间不会碰撞而聚成大颗粒。
因此蛋白质在溶液中比较稳定而不会沉淀。
蛋白质能形成较稳定的亲水胶体的另一个原因，是因为蛋白质颗粒在非等电状态时带有相同电荷，使蛋白质颗粒之间相互排斥，保持一定距离，不致相互凝集沉淀。
蛋白质由于带有电荷和水膜，因此在水溶液中形成稳定的胶体。
当某些物理化学因素破坏了蛋白质的水膜或中和了蛋白质的电荷，则蛋白质胶体溶液就不稳定而出现沉淀现象。
蛋白质可因加入下列试剂而产生沉淀：1.加盐类如硫酸铵、硫酸钠、氯化钠等可以破坏蛋白质胶体周围的水膜，同时又中和了蛋白质分子的电荷，因此使蛋白质产生沉淀，这种加盐使蛋白质沉淀析出的现象称盐析。
盐析法是分离制备蛋白质的常用方法，不同蛋白质盐析时所需的盐浓度不同，因此调节盐浓度，可使混合蛋白质溶液中的几种蛋白质分段析出，这种方法叫做分段盐析。
但中性盐并不破坏蛋白质的分子结构和性质，因此，若除去或降低盐的浓度，蛋白质就会重新溶解。
2.加有机溶剂如酒精、丙酮等可使蛋白质产生沉淀，这是由于这些有机溶剂和水有较强的作用，破坏了蛋白质分子周围的水膜，因此发生沉淀作用。
若及时将蛋白质沉淀与丙酮或乙醇分离，蛋白质沉淀则可重新溶解于水中。
3.重金属盐如氯化汞、硝酸银、醋酸铅及三氯化铁等。
这是因为蛋白质在碱性溶液中带负离子，可与这些重金属的正离子作用而生成不易溶解的盐而沉淀。
4.某些酸类如苦味酸、单宁酸、三氯乙酸等能和蛋白质化合成不溶解的蛋白质盐而沉淀。
蛋白质等电点测定
蛋白质等电点测定及性质实验一、目的：了解等电点的意义及其与蛋白质分子聚沉能力的关系。
初步学会测定蛋白质等电点的基本方法，了解蛋白质的性质。
二、原理：固体颗粒在液体中为什么能够带电？当固体与液体接触时，固体可以从溶液中选择性吸附某种离子，也可以是固体分子本身发生电离作用而使离子进入溶液，以致使固液两相分别带有不同符号的电荷，由于电中性的要求，带电外表附近的液体中必有与固体外表电荷数量相等但符号相反的多余的反离子。
在界面上带电外表和反离子形成了双电层的结构。
在两种不同物质的界面上，正负电荷分别排列成的面层。
对于双电层的具体结构，一百多年来不同学者提出了不同的看法。
最早于1879年Helmholz提出平板型模型；1910年Gouy和1913年Chapman修正了平板型模型，提出了扩散双电层模型；后来Stern又提出了Stern模型。
根据O.斯特恩的观点，一部分反离子由于电性吸引或非电性的特性吸引作用〔例如范德华力〕而和外表紧密结合，构成吸附层〔或称紧密层、斯特恩层〕。
其余的离子则扩散地分布在溶液中，构成双电层的扩散层〔或称滑移面〕。
由于带电外表的吸引作用，在扩散层中反离子的浓度远大于同号离子。
离外表越远，过剩的反离子越少，直至在溶液内部反离子的浓度与同号离子相等。
紧密层：溶液中反离子及溶剂分子受到足够大的静电力，范德华力或特性吸附力，而紧密吸附在固体外表上。
其余反离子则构成扩散层。
滑动面：指固液两相发生相对移动的界面，是凹凸不平的曲面。
滑动面至溶液本体间的电势差称为ζ电势。
固体颗粒带电量的大小及测量方式？ζ电势只有在固液两相发生相对移动时才能呈现出来。
ζ电势的大小由Zeta电位表示，其数值的大小反映了胶粒带电的程度，其数值越高说明胶粒带电越多，扩散层越厚。
一般来说，以pH值为横坐标，Zeta电位为纵坐标作图，Zeta电位为零对应的pH值即为等电点。
对于蛋白质分子来说：蛋白质分子的大小在胶粒范围内，约1～100微米。
实验一蛋白质的两性性质和酪蛋白等电点的测定
实验一蛋白质的两性性质和酪蛋白等电点的测定实验一蛋白质的两性性质和酪蛋白等电点的测定一、实验目的与要求1.掌握蛋白质的两性解离性质；2.熟练掌握测定蛋白质等电点的基本方法。
二、实验原理蛋白质是由氨基酸组成的高分子化合物。
虽然大多数的α-氨基和α-羧基成肽键结合，但仍有N末端的氨基和C末端的羧基存在，同时侧链上还有一些可解离基团。
因此，蛋白质和氨基酸一样是两性电解质。
调节蛋白质溶液的pH，可使蛋白质带上正电荷或负电荷；在某一pH时，其分子中所带的正电荷和负电荷相等，此时溶液中蛋白质以兼性离子形式存在。
在外加电场中蛋白质分子既不向正极移动也不向负极移动，此时溶液的pH 称为该蛋白质的等电点，蛋白质的溶解度最小。
不同的蛋白质，因氨基酸的组成不同有不同的等电点。
三、实验材料、试剂与仪器1.材料与试剂NaOH、HCl、乙酸、溴甲酚绿、酪蛋白、精密pH试纸等。
0.5 %酪蛋白溶液：0.5 g酪蛋白，先加入几滴1 mol/L的NaOH使其湿润，用玻璃棒搅拌研磨使成浆糊状，逐滴加入0.01 mol/L的NaOH使其完全溶解后定容到100 mL.酪蛋白—乙酸钠溶液：将0.25 g酪蛋白加5 mL 1 mol/L的NaOH溶解，加20 mL水温热使其完全溶解后，再加入5 mL 1 mol/L的乙酸，混合后转入50 mL的容量瓶内，加水到刻度，混匀备用（pH应为8~8.5）；0.01%的溴甲酚绿溶液：将0.01g溴甲酚绿溶解于100mL含有0.57mL0.1mol/LNaOH的水中。
该指示剂的变色范围是：酸性（pH3.8）为黄色，pH5.4为蓝色；0.02 mol/L的HCl溶液：将0.8 mL浓盐酸用蒸馏水稀释到480 mL即可；0.02 mol/L的NaOH溶液：将0.8 g NaOH溶解于100 mL水中，最终加入到1000 mL；0.1 mol/L的乙酸溶液：将1 mL冰醋酸用水稀释到170 mL；0.01 mol/L的乙酸溶液：将0.1 mL冰醋酸用水稀释到170 mL；1 mol/L的乙酸溶液：1 mL冰醋酸（17 mol/L）加水到17 mL即可。
实验1：蛋白质的两性电离和等电点-文档资料
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【实践操作】1.取洁净大试管1支，按表如下操作
操 作 步 骤
加入5g/L酪蛋白乙酸钠溶液20 滴，BCG指示剂5滴，混匀后， 观察并记录溶液的颜色。 缓慢滴加0.04mol/L盐酸溶液， 边滴边摇，直至产生明显的大量 沉淀，观察并记录沉淀与溶液颜 色的变化。
结
果
结 果 分 析
颜色 滴数 颜色
继续滴入0.04mol/L盐酸溶液， 直至沉淀全部溶解，观察并记录 沉淀与溶液颜色的变化。
【试剂】
1. 5g/L酪蛋白乙酸钠溶液 2. 0.01%溴甲酚绿（BCG）溶液（指示剂， pH3.8—5.4 pH3.8—5.4） 黄 3. 0.04 mol/L盐酸溶液 4. 0.04 mol/L 氢氧化钠溶液 5. 1.0 mol/L乙酸溶液 6. 0.1 mol/L乙酸溶液 7. 0.01mol/L乙酸溶液 【器材】 试管 试管架 毛滴管 记号笔
沉淀结果用“-，+，++，+++”表示并记录于表中。
【注意事项】 冒用他人结果，两人成绩全部取消，并加倍扣分。
1.沉淀符号，“－”表示无沉淀，“＋”表示浑浊无明显沉淀，“＋＋” 有明显沉淀，有小颗粒；“＋＋＋”表示大块沉淀。 2.四人共用一组试剂，在本座位，依次轮流添加，不可四处走动。 3.每组派一名代表到前面取一小试管蒸馏水，本组共用。 4.添加各种试剂注意用相应的毛滴管，不可混用！！ 5.注意混匀试管，实验1中添加盐酸和氢氧化钠时注意边添加边震荡试管， 接近PI时逐滴添加，沉淀消失后停止添加试剂，在结果一栏记入添加试剂 的滴数。
6.实验1出现明显沉淀，请老师检查后在实验报告上并签字确认 （应两次出现沉淀）。
7.实验2出现结果后请老师检查确认后给予实验成绩。
实验报告等电点聚焦测蛋白质等电点
等电点聚焦测蛋白质等电点一．实验目的1.了解蛋白质的两性解离性质和等电点聚焦的原理；2. 学习测定蛋白质等电点的方法并掌握圆盘电泳技术。
二．实验原理等电点聚焦（IEF）是在电场中分离蛋白质技术的一个重要发展，IEF实质就是在稳定的pH梯度中按等电点的不同分离两性大分子的平衡电泳方法。
在电场中充有两性载体和抗对流介质，当加上电场后，由于两性载体移动的结果，在两极之间逐步建立起稳定的pH梯度，当蛋白质分子或其它两性分子存在于这样的pH梯度中时，这种分子便会由于其表面电荷在此电场中运动，并最终到达一个使其表面静电荷为0的区带，这时的pH则是这种分子的pI。
聚焦在等电点的分子也会不断地扩散。
一旦偏离其等电点后，由于pH环境的改变，分子又立即得到正电荷或负电荷，从而又向pI迁移。
因此，这些分子总是处于不断地扩散和抗扩散的平衡之中，在pI处得以“聚焦”。
三．实验步骤1.凝胶制备按表1的比例配制4ml工作胶液，在真空干燥器中抽气10min。
每组4管，每管加胶液1.8ml。
混匀后立即注入到已准备好的凝胶管中，胶液加至离管顶部1cm 处，在胶面上再覆盖3mm厚的水层，应注意不要让水破坏胶的表面，室温下放置20～30min即可聚合。
表1 凝胶工作液配比凝胶母液（丙烯酰胺30%：甲叉双丙烯1ml酰胺0.8%）10%过硫酸铵0.02ml水 2.68ml载体两性电解液0.15ml蛋白样品液0.1ml,0.05mlTEMED 0.02ml2.电泳吸去凝胶柱表面上的水层，将凝胶管垂直固定于圆盘电泳槽中。
于电泳槽下槽加入0.2％的500ml硫酸作正极；上槽加入0.5％的800ml乙醇胺作负极打开电源，将电压恒定为300V，因为聚焦过程是电阻不断加大的过程，故聚焦电泳过程中，电流将不断下降，降至稳定时，即表明聚焦已完成，继续电泳约30min后，停止电泳，全程约需3h。
3.剥胶电泳结束后，取下凝胶管，用水洗去胶管两端的电极液，按照柱状电泳剥胶的方法取出胶条，以胶条的正极为“头”，负极为“尾”，正极端呈酸性，负极端呈碱性。
实验一 蛋白质的两性电离和等电点的测定
实验一 蛋白质的两性电离和等电点的测定【目的】验证蛋白质的两性电离与等电点性质。
【原理】蛋白质由氨基酸组成。
蛋白质分子除两端游离的氨基和羧基可解离外，其侧链上的某些酸性基团或碱性基团，在一定的溶液pH 条件下，都可解离成带负电荷或带正电荷的基团。
因此，蛋白质具有两性解离性质。
当蛋白质溶液处于某一pH 时，蛋白质解离成阳离子和阴离子的趋势相等，既净电荷为零，成为兼性离子，此时溶液的pH 称为蛋白质的等电点（isoelectric point,pI ）。
蛋白质在等电点状态时溶解度最低，容易沉淀析出。
蛋白质在大于其等电点的pH 值溶液中带负电荷；在小于其等电点的pH 值溶液中则带正电荷。
蛋白质在等点电以外的pH 值溶液中，因分子带有同种电荷而相互排斥，不易沉淀。
本实验通过观察酪蛋白在不同pH 溶液中的溶解度来测定其等电点。
＞pI （pH ）pI （pH ）=pI ＜（pH ）PrNH 3+COO -PrNH 3+COOHPrNH 2COO -蛋白质解离成阳离子 蛋白质成兼性离子 蛋白质解离成阴离子【操作】1. 蛋白质的两性电离取试管1支，按以下步骤加入各种试剂，观察现象变化并记录。
.；. 2. 酪蛋白等电点的测定取试管5支，编号后按下表的顺序准确地加入各种试剂并混匀。
静置室温20分钟后观察各管沉淀出现情况，并以－，＋，＋＋，＋＋＋，＋＋＋＋符号记录沉淀的多少。
【思考题】1．为什么说蛋白质是两性电离电解质，何谓蛋白质的等电点？2. 在等电点状态下，为什么蛋白质容易发生沉淀？3. 本实验中酪蛋白处于等电点时则从溶液中沉淀析出，由此得出蛋白质在等电点时必然沉淀，此结论对吗，为什么？。
蛋白质的理化性质
蛋白质的理化性质（一）蛋白质的两性解离及等电点1.蛋白质的等电点（pI）：当蛋白质溶液处于某一pH时，蛋白质上可解离基团解离成正、负离子的趋势相等，净电荷为零时溶液的pH。
➢等电点时溶解度最小可使蛋白质沉淀。
➢蛋白质pI要用等电聚焦等方法测定。
（二）蛋白质的胶体性质1.胶体溶液的三个条件：①大小在1-100nm范围内：蛋白质分子量很大，属胶体颗粒范围。
②同种电荷互相排斥：相同蛋白质颗粒带有同性电荷，与周围的反离子构成稳定的双电层。
③质点外围有水化层：多肽链上的极性基团极易吸附水分子，使蛋白质颗粒外围形成一层水化膜。
蛋白质可以形成稳定的胶体溶液。
2.利用胶体溶液性质，可用透析法将蛋白质中小分子杂质除去。
（三）蛋白质的沉淀1.定义：蛋白质在溶液中的稳定性是有条件的、相对的。
如果加入适当的试剂使蛋白质分子处于等电点状态或破坏其水化层和双电层，蛋白质胶体溶液因不再稳定而产生沉淀。
此现象即为蛋白质的沉淀作用。
2.类型：分可逆沉淀与不可逆沉淀。
➢可逆沉淀▁非变性沉淀定义：在温和条件下，改变溶液的pH或电荷状况，蛋白质结构和功能没有发生变化。
如等电点沉淀法、盐析法和有机溶剂沉淀法等。
是分离和纯化的基本方法。
a.等电点沉淀法：用弱酸或弱碱调节蛋白质溶液的pH等于pI，破坏蛋白质表面净电荷使蛋白质沉淀。
b.盐析沉淀法：1.盐析：通过加入大量高浓度中性盐如硫酸铵、氯化钠等，破坏蛋白质分子表面的水化层，中和它们的电荷，而使蛋白质沉淀析出的现象。
2.各种蛋白质亲水性及荷电均有差别，因此通过调节中性盐浓度，可使混合蛋白质溶液中的不同蛋白分别沉淀析出，这种方法称为分段盐析。
3.盐溶：加入低浓度盐导致蛋白质溶解度增加的现象。
c.有机溶剂沉淀法定义：加入能与水互溶的有机溶剂如乙醇、丙酮等，破坏蛋白质的水化膜使蛋白质产生沉淀。
注意：通常在低温条件下进行，否则有机溶剂与水互溶产生的溶解热会使蛋白质发生变性。
➢不可逆沉淀▁变性沉淀定义：沉淀条件剧烈，破坏了蛋白质胶体溶液稳定性，同时也破坏了蛋白质结构和功能。
蛋白质两性性质及等电点的测定
蛋白质两性性质及等电点的测定蛋白质是生物体中极其重要的有机化合物，是构成生物体的基本组成部分之一。
蛋白质具有很多种类和功能，不同的蛋白质在生物体内发挥着不同的作用。
蛋白质的性质也因其结构而异，其中包括两性性质和等电点。
本文将介绍蛋白质的两性性质及等电点的测定。
一、蛋白质的两性性质蛋白质是由多肽链组成的，其分子中含有氨基酸残基。
这些氨基酸残基中的羧基（-COOH）和氨基（-NH2）可以参与酸碱反应，所以蛋白质具有两性性质，能够在不同的pH值下呈现不同的电离状态。
1. 在低pH值下，蛋白质中的羧基处于质子化状态，成为正电荷，而氨基则不受质子化，保持中性。
因此，在低pH值时，蛋白质呈正电荷状态，称为阳离子。
2. 在高pH值下，蛋白质中的氨基受到氢离子的质子化，成为正电荷，而羧基则不受质子化，保持中性。
因此，在高pH值时，蛋白质呈负电荷状态，称为阴离子。
3. 在等电点附近，蛋白质的质子化和去质子化同时发生，羧基和氨基的质子化程度相等，呈中性状态。
此时，蛋白质没有净电荷，称为等电点。
由于蛋白质的两性性质，可以影响其溶解性、折叠构象和相互作用等特性，对其功能和生物学作用具有重要影响。
二、蛋白质等电点的测定等电点是蛋白质具有中性状态的pH值。
测定蛋白质的等电点可以帮助我们了解其溶解性、电动力学性质和酸碱加工过程中的变化。
常用的测定等电点的方法有以下几种：1. pH梯度电泳法：这是一种常用且广泛应用的测定等电点的方法。
在一个pH梯度上进行电泳，当蛋白质离子迁移速率和电场力相等时，达到等电点。
可以通过在梯度上观察蛋白质带的形成和移动情况来确定等电点。
2. 等电聚焦电泳法：这是一种利用电场作用下蛋白质在凝胶上垂直移动的方法，根据蛋白质在凝胶中的移动速率和电场力相等时的pH值来测定等电点。
3. 等电点电位计法：该方法利用等电点时蛋白质没有净电荷的特性，使用电位计测量蛋白质在不同pH值下的电位变化，找出没有净电荷时的pH值，即为等电点。
蛋白质两性性质及等电点的测定
注意事项
在测定等电点的实验中，要求各种试剂的浓
度和加入量相当准确。
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阳离子两性离子阴离子
pH<pIpH=pIpHpI 电场中：移向阴极不移动移向阳极调节溶液 的 pH 使蛋白质分子的酸性解离与碱性解离相等， 即所带正负电荷相等，净电荷为零，此时溶液的 pH 值称为蛋白质的等电点。在等电点时，蛋白质 溶解度最小，溶液的混浊度最大，配制不同 pH 的缓冲液，观察蛋白质在这些缓冲液中的溶解情
实验十三蛋白质的两性性质及等电点的测定
实验十三蛋白质的两性性质及等电点的测定一、目的通过实验了解蛋白质的两性性质及等电点与蛋白质分子聚沉的关系。
掌握通过聚沉测定蛋白质等电点的方法。
二、原理蛋白质是两性电解质。
蛋白质分子中可以解离的基团除N-端α-氨基与C-端α-羧基外，还有肽链上某些氨基酸残基的侧链基团，如酚基、巯基、胍基、咪唑基等基团，它们都能解离为带电基团。
因此，在蛋白质溶液中存在着下列平衡：调节溶液的pH使蛋白质分子的酸性解离与碱性解离相等，即所带正负电荷相等，净电荷为零，此时溶液的pH值称为蛋白质的等电点。
在等电点时，蛋白质溶解度最小，溶液的混浊度最大，配制不同pH的缓冲液，观察蛋白质在这些缓冲液中的溶解情况即可确定蛋白质的等电点。
三、仪器和试剂1．仪器（1）试管架（2）试管：15ml ×6（3）刻度吸管：lml×4，2mI×4，10ml×2（4）胶头吸管×22. 试剂（1）1 mol／L乙酸（2）0.1 mol／L乙酸（3）0.01 mol／L乙酸（4）0.2 mol／L NaOH（5）0.2 mol／L盐酸（6）0.01％溴甲酚兰绿指示剂（7）0.5％酪蛋白四、操作步骤（1）取一支试管，加0.5％酪蛋白1ml，再加溴甲酚兰绿指示剂4滴，摇匀。
此时溶液呈蓝色，无沉淀形成。
（2）用胶头滴管慢慢加入0.2 mol／L盐酸，边加便边摇直到有大量的沉淀生成。
此时溶液是pH值接近酪蛋白的等电点。
观察溶液颜色的变化。
（3）继续滴加0.2 mol／L盐酸，沉淀会逐渐减少以至消失。
观察此时溶液的颜色变化。
（4）滴加0.2 mol／L NaOH进行中和，沉淀又出现。
继续滴加沉淀又逐渐消失。
观察此时溶液的颜色变化。
2. 酪蛋白等电点的测定（2）充分摇匀，然后向以上各试管依次加入0.5％酪蛋白l ml，边加边摇，摇匀后静置5min，观察各管的混浊度。
五、结果处理用一、＋、＋＋、＋＋＋等符号表示各管的混浊度。
蛋白质等电点的测定
3．剥胶
电泳结束后，取下凝胶管，用蒸馏水洗净两端电极液，在 凝胶条旳正极端作上标识。用灌满水旳注射器长针头插入凝胶 与玻管管壁之间，边压水边慢慢转动玻管，推针迈进，同步注 入水，靠水流压力和润滑力将玻璃管内壁与凝胶分开，凝胶条 即可流出。
4 .固定染色
取出凝胶条放在一块洁净旳玻板上，用尺量出固定前旳凝 胶条长度。放入带盖试管中加入固定液。固定20min2后，倒 掉固定液后用脱色液漂洗2次，再染色1h，用蒸馏水漂洗多次 后用脱色液脱色，直至蛋白质区带清楚，量出蛋白带距正极端 旳距离。
试管号
1 2 3 4
蒸馏水 （ml）
8.4
8.7
8.0
7.4
0.01M醋酸 （ml） 0.6
—
—
—
0.1M醋酸 （ml）
—
0.3
1.0
—
1M醋酸 （ml）
—
—
—
1.6
(2) 向以上试管中各加酪蛋白旳醋酸钠溶液1毫 升，加一管，摇句一管。此时1、2、3、4管旳 pH值依次为5.9、5.3、4.7、3.5。观察其混浊 度。静置10分钟后，再观察其混浊度。最混浊 旳一管旳pH即为酪蛋白旳等电点。
10 min
（3）将配好旳凝胶溶液用细长头滴管加到预先准备好旳玻管 中，至离上端1 cm处，再用注射器缓缓加水3-5 mm高。
（4）待凝胶聚合
2. 电泳
将装有胶旳玻管固定到电泳槽上槽旳洞中（安装时要确 保凝胶管垂直且橡胶塞孔密封不漏）在上槽中装入0.1mol/L 氢氧化钠溶液，在下槽中加入0.1mol/L磷酸缓冲液。连接到 电泳仪，接通电源，调电压至160 V，聚焦过夜，至电流降 为200毫升锥形瓶、100毫升容
量瓶、吸管、试管、试管架、乳钵 试剂： (1)0.4％酪蛋白醋酸钠溶液 (2)1.00摩尔／升醋酸溶液 (3)0.10摩尔／升醋酸溶液 (4)0.01摩尔／升醋酸溶液
蛋白质性质实验
实验六蛋白质的性质（二）蛋白质的等电点测定和沉淀反应一、蛋白质等电点的测定（一）目的1、了解蛋白质的两性解离性质。
2、学习测定蛋白质等电点的一种方法。
（二）原理蛋白质是两性电解质，在溶液中存在下列平衡：蛋白质分子的解离状态和解离程度受溶液的酸碱度影响。
当溶掖的pH达到一定数值时，蛋白质颗粒上正负电荷的数目相等，在电场中，蛋白质既不向阴极移动，也不向阳极移动，此时溶液的PH值称为此蛋白质的等电点(p1)。
不同的蛋白质有其各自的等电点。
在等电点时，蛋白质的理化性质都有变化，可利用此种性质来测定各种蛋白质的等电点。
最常用的方法是利用物质在达到等电点时溶解度最小的性质，测定蛋白质溶液的溶解度呈现最低时的溶液pH值，此时的pH倍即为该蛋白质的等电点。
本实验通过观察酪蛋白在不同pH溶液中的溶解度，来测定酪蛋白的等电点。
用醋酸与醋酸钠配制成各种不同PH值的缓冲液．然后向各缓冲溶液中加入酪蛋白，观察沉淀出现并测定酪蛋白的等电点。
（三）实验器材1、水浴锅。
2、温度计。
3、200mL锥形瓶。
4、100mL容量瓶。
5、移液管。
6、试管。
7、试管架。
8、研钵。
（四）材料与试剂1、0.5％酪蛋白醋酸钠溶液：取0.5g酪蛋白．加少量水在研钵中仔细地研磨，将所得的蛋白质液移入200 mL锥形瓶内，并用少量40～50℃的温水洗涤研钵，将洗涤液也移入锥形瓶内。
加入10 mLlmol/L醋酸钠溶液。
把锥形瓶放入50℃水浴中，并小心地旋转锥形瓶，直到酪蛋白完全溶解为止。
将锥形瓶内的溶液全部移至100 mL容量瓶内，加水至到度，塞紧玻璃塞，混匀。
2、1mo1/L醋酸溶液。
3、0.1mo1/L醋酸溶液。
4、0.01mo1/L醋酸镕液.（五）操作方法2、。
静置20min后，再观察每支试管内溶液的混浊度，以—、＋、＋＋，＋＋＋符号表示沉淀的多少，根据观察结果，指出那一个pH是酪蛋白的等电点。
二、蛋白质的沉淀及变性（一）目的1、加深对蛋白质胶体溶液稳定因素的认识。
蛋白质的两性反应及等电点测定
蛋白质的两性反应及等电点测定I ．蛋白质的两性反应实验原理构成蛋白质的许多氨基酸，虽然绝大多数的氨基酸与羟基成肽键结合，但总有一定数量的氨基与羟基呈游离状态。
因此蛋白质也和氨基酸一样是一种两性电解质，在酸性溶液中作碱性解离，使蛋白质带正电荷；在碱性溶液中作酸性解离，使蛋白质带负电荷。
调节溶液的氢离子浓度，使蛋白质分子所带的正电荷和负电荷的强度相等，蛋白质分子在这样的条件下既不向电场中的阳极移动，也不向阴极移动，这时溶液的pH ，称为蛋白质的等电点（pI ）。
体内各种蛋白质的等电点不同，但大多数接近于pH5.0，所以在人体体液pH7.4的环境下，大多数蛋白质解离成阴离子，带负电。
蛋白质分子在酸性及碱性溶液中，因都分别带有相同的正电荷和负电荷，互相排斥，不容易生成沉淀，但当溶液的酸碱度调节到蛋白质的等电点时，蛋白质颗粒上的净电荷即为零，缺乏同电相斥的因素，因此很容易彼此结合而沉淀。
仪器设备小试管、毛细滴管及试管架试剂1．0.5%酪蛋白液2．0.01%溴甲酚绿指示剂3．0.02N HCl 溶液4．0.02N NaOH 溶液+ H + +OH － NH 2COO － + H 2O CH R COOH NH 2 CH R COOH NH 2 CH R NH 3 + CH R COOH实验操作1．取一小试管，加0.5%的酪蛋白液20滴，加0.01%溴甲酚绿指示剂4滴，混匀。
此时溶液呈何色？说明什么？2．以毛细滴管漫漫加入0.02N HCl溶液，随滴随摇，至有明显的大量的沉淀发生时，此时溶液的pH接近与酪蛋白的等电点，观察溶液的颜色有何变化？3．继续用0.02 N HCl溶液滴入，沉淀为什么会逐渐消失？此时溶液的颜色有何变化：说明什么？4．如再滴加0.02N NaOH溶液至中和，为何又会出现沉淀。
继续再滴碱液，为何沉淀又会溶解？从溶液颜色的变化，说明什么？II、酪蛋白的等电点的测定实验原理酪蛋白的等电点是4.7，利用蛋白质在等电点时溶解度最低的特性，配制不同氢离子浓度的缓冲溶液，以观察蛋白质在此等溶液中的沉淀情况，可确定蛋白质的等电点。
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实验一蛋白质的两性电离和等电点的测定仅供学习与交流，如有侵权请联系网站删除 谢谢2第三章 实验内容实验一 蛋白质的两性电离和等电点的测定【目的】验证蛋白质的两性电离与等电点性质。
【原理】蛋白质由氨基酸组成。
蛋白质分子除两端游离的氨基和羧基可解离外，其侧链上的某些酸性基团或碱性基团，在一定的溶液pH 条件下，都可解离成带负电荷或带正电荷的基团。
因此，蛋白质具有两性解离性质。
当蛋白质溶液处于某一pH 时，蛋白质解离成阳离子和阴离子的趋势相等，既净电荷为零，成为兼性离子，此时溶液的pH 称为蛋白质的等电点（isoelectricpoint,pI ）。
蛋白质在等电点状态时溶解度最低，容易沉淀析出。
蛋白质在大于其等电点的pH 值溶液中带负电荷；在小于其等电点的pH 值溶液中则带正电荷。
蛋白质在等点电以外的PH 值溶液中，因分子带有同种电荷而相互排斥，不易沉淀。
本实验通过观察酪蛋白在不同pH 溶液中的溶解度来测定其等电点。
＞pI （pH ）pI （pH ）=pI ＜（pH ）PrNH 3+COO -PrNH 3+COOHPrNH 2COO -蛋白质解离成阳离子 蛋白质成兼性离子 蛋白质解离成阴离子【器材】试管、试管架、滴管、刻度吸管。
【试剂】1. 5g/L 酪蛋白醋酸钠溶液称取纯酪蛋白0.5g，加蒸馏水40ml及1.00mol/LNaOH溶液10.0ml，振荡使酪蛋白溶解，然后加入1.00mol/L醋酸溶液10ml，混匀后倒入100ml容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度，混匀。
2. 0.1g/L溴甲酚绿指示剂该指示剂变色范围为pH 3.8～5.4。
指示剂的酸色型为黄色，碱色型为蓝色。
3. 0.02mol/L HCl溶液4. 0.02mol/L HaOH溶液5. 1.00mol/L 醋酸溶液6. 0.10mol/L 醋酸溶液7. 0.01mol/L 醋酸溶液【操作】1.蛋白质的两性电离(1)取试管1支，加入5g/L酪蛋白醋酸钠溶液1ml，0.1g/L溴甲酚绿指示剂6～7滴，混匀后，观察并记录溶液的颜色。
蛋白质的两性反应和等电点测定
实验二蛋白质的两性反应和等电点测定一、实验目的（1）了解蛋白质的两性解离性质。
（2）学习测定蛋白质等电点的一种方法。
二、实验原理蛋白质是两性电解质。
在蛋白质溶液中存在电离平衡。
蛋白质分子的解离状态和解离程度受溶液的酸碱度影响。
当溶液的pH达到一定数值时，蛋白质颗粒上正负电荷的数目相等，在电场中，蛋白质既不向阴极移动，也不向阳极移动，此时溶液的pH值称为此种蛋白质的等电点。
不同蛋白质各有其特异的等电点。
在等电点时，蛋白质的溶解度最低，容易沉淀析出。
可利用此种性质的变化测定各种蛋白质的等电点。
最常用的方法是测其溶解度最低时的pH值。
本实验借观察在不同pH溶液中的溶解度以测定酪蛋白的等电点。
用醋酸与醋酸钠（醋酸钠混合在酪蛋白溶液中）配制成各种不同pH值的缓冲液。
向诸缓冲液中加入酪蛋白后，沉淀出现最多的缓冲液的pH值即为酪蛋白的等电点。
三、实验材料、器材与试剂1、材料酪蛋白。
2、器材（1）水浴锅；（2）温度计；（3）200mL锥形瓶；（4）100ｍＬ容量瓶；（５）吸管；（６）试管及试管架；（7）乳钵；（8）记号笔。
3、试剂（1）0.4%酪蛋白醋酸钠溶液200mL取0.4g酪蛋白，加入少量水在乳钵中仔细研磨，将所得的蛋白质悬胶液移入200mL锥形瓶内，用少量40～50℃的温水洗涤乳钵，将洗涤液也移入锥形瓶内。
加入10mL1mol/L醋酸钠溶液。
把锥形瓶内的溶液全部移至100mL容量瓶内，加水至刻度，塞紧玻璃塞，混匀。
（2）1.00mol/L醋酸溶液；（3）0.10mol/L醋酸溶液；（4）0.01mol/L醋酸溶液；（5）0.5%酪蛋白溶液（以0.01mol/L NaOH作溶剂）；（6）0.01%溴甲酚绿指示剂；（7）0.02mol/L氢氧化钠溶液；（8）0.02mol/L盐酸溶液。
四、操作方法1、蛋白质的两性反应（1）取一支试管，加入0. 5%酪蛋白溶液20滴和0. 01%溴甲酚绿指示剂5~7滴，混匀。
实验一 蛋白质的两性反应及等电点的测定[2]
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实验一蛋白质的两性反应及等电点的测定[2]一、实验目的2. 掌握测定蛋白质等电点的方法。
二、实验原理1. 蛋白质的两性反应蛋白质是一种复杂的高分子有机化合物，其分子中有许多含酸、含碱基的氨基酸残基。
因此，蛋白质具有两性反应。
当 pH 低于一个特定值时，氨基酸上的氨基质子化，成为带正电荷的离子型，蛋白质带正电；当 pH 高于另一个特定值时，氨基酸上的羧基失去质子，形成带负电荷的离子型，蛋白质带负电。
在这两个特定的 pH 值之间，蛋白质带有等量的正离子和负离子，呈等电点状态。
（1）等电聚焦法等电聚焦法是一种利用直流电场将蛋白质分离的方法。
在等电点时，蛋白质的总电荷为零，不受电场作用，停留在等电点位置，实现蛋白质的分离。
这种方法分辨率高、分离效率好，但设备复杂、操作难度大。
（2）等电点电泳法等电点电泳法是一种利用凝胶电泳原理测定蛋白质等电点的方法。
该方法在凝胶中涂上不同 pH 值的缓冲剂，形成不同 pH 值的电泳区，通过一定时间的电泳分离，观察蛋白质的运动位置，即可确定其等电点。
该方法比较简单、直观，分辨率较低。
三、实验步骤1. 预处理（1）将新鲜鸡蛋清取下，放在常温下静置 30 min，去除蛋清表面的泡沫和浮沫。
（2）采用冷环境离心机，将鸡蛋清离心 10 min，离心后取上清。
（1）将 1 mL 蛋清溶液分别加入 7 个不同 pH 值的缓冲溶液中，分别为 2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0。
（2）观察各实验管中的蛋清溶液的颜色变化。
（1）将 0.2 mL 蛋清溶液加入 4 mL 聚丙烯酰胺凝胶缓冲液中，混合均匀倒入凝胶板中。
（2）试管中加入 3 mL 结晶紫染色溶液（10^-3 M），将凝胶板浸泡在染色溶液中，染色 30 min 后，倒掉染色溶液，用蒸馏水清洗凝胶板几次，至染色液流出凝胶板没有颜色为止。
（3）取出凝胶板，用透明胶带覆盖红色刻度线，用间隔开的两条直线将凝胶板对折，压平，用剪刀从中央向两侧剪开，取下其中一块凝胶，放入测定盒中，插上电极进行电泳。
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蛋白质的两性性质及等电点的测定
一 实验目的
通过实验了解蛋白质的两性性质和等电点的意义及与蛋白质分子聚沉的关系。
二 实验原理
蛋白质是由许多氨基酸组成的，故也是两性电解质。
蛋白质分子中可以解离的基团除末端a －氨基与羧基外，还有肽链上氨基酸残基的侧链基团，如非a －羧基及氨基、胍基、咪唑基等基团，它们都能解离成带电基团。
因此，蛋白质分子与氨基酸一样，在酸性溶液中作碱性解离，成为带正电荷的阳离子，在碱性溶液中作酸性解离，成为带负电荷的阴离子。
H
R
COOH
N
H 3+
H
R
COO
N
H 3+
H
R
COO H 2N
OH
在一定氢离子浓度时，蛋白质分子的酸性解离与碱性解离相等，成为中性颗粒，所带正负电荷相等，净电荷为零，此时溶液的pH 值称为蛋白质的等电点（pI ）。
在等电点时蛋白质分子在电场中既不向阴极移动，也不向阳极移动。
而且分子间因碰撞而引起聚沉的倾向增加。
所以此时蛋白质溶解度最小，若再加入乙醇、丙酮等试剂与蛋白质分子争夺水分子，减低了蛋白质分子外水化膜的厚度，而使浑浊度增加，蛋白质等电点与所含氨基酸种类和数量有关。
若蛋白质含酸性氨基酸多，则等电点多略酸性，如胃蛋白酶的等电点为pH1左右，也有一些蛋白质含碱性氨基酸多，则等电点偏碱性。
如鱼精蛋白等电点为pH12.0-12.4，含酸性和碱性氨基酸残基数目相近的蛋白质，其等电点为中性偏酸约5左右。
本实验采用酪蛋白在不同pH 溶液中形成的混浊度来确定其等电点，即混浊度最大的溶液pH 值为该种蛋白质的等电点。
三 实验设备
(1) 试管架 1个
(2) 吸管 1mL 2支 ；2mL 1支 ；5mL 1支；10mL 1支 (3) 试管 1.5×15mL 10支 (4) 滴管 2支
四 实验试剂
（1）1mol/L 醋酸溶液：
量取99.5%醋酸(比重1.05)2.875 mL ，加水至50 mL 。
（2）0.1mol/L 醋酸溶液：
量取1mol/L 醋酸5 mL ，加水至50 mL 。
（3）0.01mol/L 醋酸溶液：
量取0.1mol/L醋酸5 mL，加水至50 mL。
（4）0.2mol/L氢氧化钠溶液：
先称取氢氧化钠（分析纯）2g，加水至50 mL，配成1mol/L氢氧化钠。
然后量取1mol/L氢氧化钠10 mL，加水至50 mL，配制成0.2mol/L氢氧化钠。
（5）0.2mol/L盐酸溶液：
先量取37.2%盐酸（比重1.19）4.17 mL，加水至50 mL，配成1mol/L盐酸。
然后量取1mol/L的盐酸10 mL，加水至50 mL，配成0.2mol/L盐酸。
（6）0.01%溴甲酚绿指示剂：
称取溴甲酚绿0.005g、加0.29 mL 1mol/L氢氧化钠，然后加水至50 mL。
（7）0.5%酪蛋白溶液：
称取纯净酪蛋白0.25g放入50 mL容量瓶内，加水约20 mL，再准确加入1mol/L氢氧化钠5 mL，当酪蛋白溶解后，准确加入1mol/L醋酸5 mL，最后加水稀释至50 mL，充分摇匀。
注：氢氧化钠和醋酸溶液的浓度要标定。
五操作步骤
1、蛋白质的两性反应
（1）取两支试管，加0.5%酪蛋白2 mL，再加溴甲酚绿指示剂4-5滴，摇匀。
此时溶液呈兰色，无沉淀生成，说明了什么？
（2）用滴管慢慢加入0.2mol/L盐酸，随加随摇直至有明显大量的沉淀生成，此时溶液的pH值接近酪蛋白的等电点，观察溶液颜色有何变化？
（3）继续滴加0.2mol/L盐酸，沉淀会逐渐减少消失。
观察此时溶液的颜色有何变化，说明什么？
（4）滴加0.2mol/L氢氧化钠进行中和，沉淀又出现。
继续滴加0.2mol/L氢氧化钠液，沉淀又逐渐消失，从溶液的颜色变化说明什么？
注：溴甲酚绿的变化范围pH3.8-5.4。
2、蛋白质等电点的测定
取5支试管依次标号，按下列表格添加试剂，立即摇匀，观察混浊度。
各管混浊度以-、±、+、++、+++表示。
指出酪蛋白的等电点。
1 2 3 4 5
0.5%酪蛋白（mL）
蒸馏水（mL）
0.01mol/L醋酸（mL）0.1mol/L醋酸（mL）1.00
8.38
0.62
—
1.00
8.75
—
0.25
1.00
8.00
—
1.00
1.00
5.00
—
4.00
1.00
7.40
—
—
编
号试
剂
六实验结果
1、解释上述实验反应的现象
2、指出酪蛋白的等电点。