蛋白质的两性性质及等电点的测定
蛋白质两性解离和等电点的测定实验报告结果
蛋白质两性解离和等电点的测定实验报告结果
在等电点附近，蛋白质溶液开始变浑浊，离心可见沉淀。
远离等电点，蛋白质溶液开始变澄清，离心未见沉淀。
当蛋白质溶液处于某一pH时，蛋白质解离成正、负离子的趋势相等，即成为兼性离子，净电荷为零，此时溶液的pH称为蛋白质的等电点。在等电点时蛋白质的溶解度最小，在电场中不移动。
在pI时，蛋白质失去了胶体的稳定条件，即没有相同电荷相互排斥的作用。所以不稳定，溶解度最小，易沉淀。
蛋白质的两性反应和等电点测定
蛋白质的两性反应和等电点测定
一、实验目的
1.熟悉蛋白质的沉淀反应、颜色反应和两性反应及其机理。
2.掌握蛋白质等电点的测定方法及其原理。
3.掌握蛋白质电荷的测定方法及其机理。
二、实验原理
(一)蛋白质的沉淀反应原理
蛋白质的水溶液是一种比较稳定的亲水胶体，这是因为蛋白质颗粒表面带有很多极性基团，如—NH3+，—COO-，—SH，—CONH2等和水有高度亲和性，当蛋白质与水相遇时，就很容易被蛋白质吸住，在蛋白质颗粒外面形成一层水膜(又称水化层)。水膜的存在使蛋白颗粒相互隔开，颗粒之间不会碰撞而聚成大颗粒。因此蛋白质在溶液中比较稳定而不会沉淀。蛋白质能形成较稳定的亲水胶体的另一个原因，是因为蛋白质颗粒在非等电状态时带有相同电荷，使蛋白质颗粒之间相互排斥，保持一定距离，不致相互凝集沉淀。
蛋白质由于带有电荷和水膜，因此在水溶液中形成稳定的胶体。当某些物理化学因素破坏了蛋白质的水膜或中和了蛋白质的电荷，则蛋白质胶体溶液就不稳定而出现沉淀现象。蛋白质可因加入下列试剂而产生沉淀：
1.加盐类如硫酸铵、硫酸钠、氯化钠等可以破坏蛋白质胶体周围的水膜，同时又中和了蛋白质分子的电荷，因此使蛋白质产生沉淀，这种加盐使蛋白质沉淀析出的现象称盐析。盐析法是分离制备蛋白质的常用方法，不同蛋白质盐析时所需的盐浓度不同，因此调节盐浓度，可使混合蛋白质溶液中的几种蛋白质分段析出，这种方法叫做分段盐析。但中性盐并不破坏蛋白质的分子结构和性质，因此，若除去或降低盐的浓度，蛋白质就会重新溶解。
2.加有机溶剂如酒精、丙酮等可使蛋白质产生沉淀，这是由于这些有机溶剂和水有较强的作用，破坏了蛋白质分子周围的水膜，因此发生沉淀作用。若及时将蛋白质沉淀与丙酮或乙醇分离，蛋白质沉淀则可重新溶解于水中。
实验一蛋白质的两性反应及等电点的测定2
实验一蛋白质的两性反应及等电点的测定2
一、实验目的
1、学习蛋白质的两性反应；
二、实验仪器
pH计、电泳槽、电源、紫外分光光度计、比色皿、恒温水浴箱等。
三、实验原理
蛋白质分子中含有大量的离子基团，它们可以接受或释放H+离子，从而表现出两性反应的特征。根据pH的变化，蛋白质分子的电荷状态和溶解性都会发生改变。不同蛋白质的两性反应的pH区间有所不同，但都表现出了一定的规律性。一般来说，蛋白质的等电点（pI）即蛋白质分子带的净电荷等于零时的pH值。在这个pH值附近，蛋白质分子的溶解
度最低。
2、等电聚焦电泳
等电聚焦电泳（isoelectric focusing, IEF）是基于蛋白质分子的等电点原理，运用电场作用于溶液中的蛋白质使其向等电点运动，到达等电点时就不再运动，电场作用力为零，从而使蛋白质在等电点处聚焦。该技术可以高效地将蛋白质分子分离开，并且不产生
电荷的副反应。IEF的缺点是需要高纯度的蛋白质样品和复杂的设备。
四、实验操作
1、示范两性反应的现象
制备两个100mL的肉汤。其中一个加入适量的氢氧化钠溶液，并记录溶液的pH值。将两个溶液放在一起，观察两溶液之间的相互作用。
2、测定牛血清白蛋白（BSA）的pI值
将0.1g的BSA溶解于100mL的蒸馏水中，并调整pH至2.0。加入适量的氢氧化钠溶液，逐渐增加溶液的pH值。每次变化pH值0.5时，用pH计测定一次溶液的pH值，并记录BSA 对应的电泳距离。将记录的数据制成曲线图。由BSA的等电点的定义，等电点的pH值应该是曲线的最低点。
3、等电聚焦电泳测定蛋白质的等电点
实验一蛋白质的等电点测定
实验一蛋白质的等电点测定
一.实验目的
１.掌握蛋白质的两性解离性质
２.学习测定蛋白质等电点的方法
二．实验原理
蛋白质是两性电解质，在溶液中存在下列平衡：
pH＞pI pH = pI pH＜pI
蛋白质分子的解离状态和解离程度受溶液酸碱度（ｐH值）的影响。当溶液的pH达到一定数值时，其颗粒上的正负电荷数目相等，在电场中，既不向阴极移动，也不向阳极移动，此时溶液的pH值称为此种蛋白质的等电点。不同蛋白质各有其特异的等电点。在等电点时，蛋白质的理化性质都有变化，如：在等电点条件下，蛋白质的电导性、溶解度最小，粘度最大。可利用此种性质的变化测定各种蛋白质的等电点。最常用的方法是测其溶解度最低时的溶液pH值。
本实验通过观察不同pH溶液中的溶解度来测定酪蛋白的等电点。用醋酸与醋酸钠（醋酸钠混合在酪蛋白溶液中）配制成各种不同pH值的缓冲溶液。向各种不同的缓冲液中加入酪蛋白后。沉淀出现最多的缓冲液的pH值即为酪蛋白的等电点。
三.实验器材：水浴锅、温度计、200ml锥形瓶、100ml容量瓶、吸管、试管等
四.试剂与材料：
１.材料：酪蛋白
2.试剂：
（1）0.4%酪蛋白醋酸钠溶液称取0.4g酪蛋白，加1mol/LNaOH10ml使其完全溶解，加水50ml，再缓慢加1mol/LHAc10ml(边加边搅拌,ＮaOH和 HAc的浓度和体积必须准确，加HAc时一定要慢)，定溶至100 ml。
(2)1.00mol/L醋酸溶液
(3)0.10mol/L醋酸溶液
(4)0.01mol/L醋酸溶液
五.实验步骤：
（1）取同样规格的试管4支并编号，按下表顺序精确加入各试剂并混匀
实验三 蛋白质的两性反应和等电点的测定
实验三蛋白质的两性反应和等电点的测定
一、目的和要求
1.了解蛋白质的两性解离性质。
2.初步学会测定蛋白质等电点的方法。
二、原理
蛋白质由许多氨基酸组成，虽然绝大多数的氨基与羧基成肽键结合，但是总有一定数量自由的氨基与羧基，以及酚基等酸碱基团，因此蛋白质和氨基酸一样时两性电解质。调节溶液的酸碱度达到一定的氢离子浓度时，蛋白质分子所带的正电荷和负电荷相等，以兼性离子状态存在，在电场内该蛋白质分子既不向阴极移动，也不向阳极移动，这时溶液的PH值称为该蛋白质的等电点（PI）。当溶液的PH低于蛋白质等电点时，即在氢离子较多的条件下，蛋白质分子带正电荷成为阳离子；当溶液的PH高于蛋白质等电点时，即在氢氧根离子较多的条件下，蛋白质分子带负电荷成为阴离子。
在等电点时蛋白质溶解度最小，容易沉淀析出。
三、试剂和器材
1.试剂
0.5%酪蛋白溶液；酪蛋白醋酸钠溶液；
0.04%溴甲酚绿指示剂；
0.02N盐酸；
0.1N醋酸溶液；
0.01N醋酸溶液；1N醋酸溶液；
0.02N氢氧化钠溶液
2.器材
试管及试管架；滴管；吸量管（
1、5ml）
四、操作方法
1.蛋白质的两性反应
（1）取1支试管，加
0.5%酪蛋白溶液20滴和
0.04%溴甲酚绿指示剂5-7滴，混匀。观察溶液呈观的颜色，并说明原因。
（2）用细滴管缓慢加入
0.02N盐酸溶液，随滴随摇，直至有明显的大量沉淀发生，此时溶液的PH 接近与酪蛋白的等电点。观察溶液颜色的变化。
（3）继续滴入
0.02N盐酸溶液，观察沉淀和溶液颜色的变化，并说明原因。
（4）再滴入
0.02N氢氧化钠溶液进行中和，观察是否出现沉淀，解释其原因。
蛋白质的两性解离与等电点测定
7.4
—
—
1.6
（2）向以上各试管中加酪蛋白醋酸钠溶液 1mL，加一管，摇匀一管，此时1、2、3、 4管的pH值依次为5.9、5.3、4.7、3.5，观 察其混浊度。
5、实验结果
静置10min后，再观察其混浊度，最混浊的 一管的pH即为酪蛋白的等电点。
蛋白质溶液的pH在等电点时，蛋白质的溶解度、粘 度、渗透压、膨胀性及导电能力均最小，胶体溶液 呈最不稳定状态。
凡碱性氨基酸含量较多的蛋白质，等电点往往偏碱， 如组蛋白和精蛋白。反之，含酸性氨基酸较多的蛋 白质如酪蛋白、胃蛋白酶等，其等电点往往偏酸。
不同蛋白质各有其特异的等电点。在等电点时，蛋 白质的理化性质都有变化，可利用此种性质的变化 测定各种蛋白质等电点。最常用的方法是测其溶解 度最低时的溶液pH值。
调节溶液的酸碱度达到一定的氢离子浓度时，蛋白质分子 所带的正电荷和负电荷相等，以兼性离子状态存在，在电 场内该蛋白质分子既不向阴极移动，也不向阳极移动，这 时溶液的pH值，称为该蛋白质的等电点（pI）。当溶液 pH低于蛋白质等电点时，即在H+较多的条件下，蛋白质 分子带正电荷成为阳离子；当溶液pH大于等电点时，即在 OH—较多的条件下，蛋白质分子带负电荷，成为阴离子。
4、操作步骤
（1）取同样规格的试管4支，按下表顺序分别精确地 加入各试剂，然后混匀。（要求各试剂的浓度和加 入量相当准确）
实验三蛋白质的等电点测定和沉淀反应
❖ 操作步骤
❖ 〔一酪蛋白等电点的测定 ❖ 1 取同样规格的试管4支,按下表顺序分别精确地加
入各试剂,然后混匀; ❖ 2 向以上试管中各加酪蛋白的醋酸钠溶液1mL,加一
管,摇匀一管.此时1、2、3、4管的pH依次为5.9、5.5、 4.7、3.5.观察其混浊度.静置10分钟后,再观察其混浊度. 最混浊的一管pH即为酪蛋白的等电点.
❖ 不同蛋白质各有特异的等电点.在等电点时,蛋白 质的理化性质都有变化,可利用此种性质的变化测定各 种蛋白质的等电点.最常用的方法是测其溶解度最低时 的溶液pH值.
本实验通过观察不同pH溶液中的溶解度以 测定酪蛋白的等电点.用醋酸与醋酸钠〔醋酸 钠混合在酪蛋白溶液中配制各种不同pH值的 缓冲液.向诸缓冲溶液中加入酪蛋白后,沉淀出 现最多的缓冲液的pH值即为酪蛋白的等电点.
〔2不可逆沉淀反应 此时蛋白质分子内部结构发生 重大改变,蛋白质常变性而沉淀,不再溶于原来溶剂 中.加热引起的蛋白质沉淀与凝固.蛋白质与重金属 离子或某些有机酸的反应都属于此类.
蛋白质变性后,有时由于维持溶液稳定的条件仍然 存在〔如电荷,并不析出.因此变性蛋白质并不一定 都表现为沉淀,而沉淀的蛋白质也未必都已变性.
ml 5%三氯乙酸溶液,振荡试管,观察沉淀的 生成.放 置片刻倾出清液,向沉淀中加入少量 水,观察沉淀是否溶解.
〔五有机溶剂沉淀蛋白质 取1支试管,加入2mL蛋白质溶液, 再加入2
实验一、蛋白质的等电点测定
四、实验步骤与结果
1、观察蛋白质的两性反应
步骤 1
操作
取试管1，加20滴0.5%酪蛋白溶液 和5-7滴0.01%溴甲酚绿指示剂， 混匀
2
缓慢滴加0.1mol/L盐酸溶液，随 滴随摇，直至大量沉淀发生
现象
观察溶液颜色和 沉淀
观察溶液颜色和 沉淀
解释结论
结合思考1， 解释
结合思考2， 解释
3
继续滴加0.1mol/L盐酸溶液
指顶住吸量管上端。 Ø 调刻度：吸量管与地面保持垂直，下口与试剂瓶接触，并成一角度；
用食指控制液体下降至最上一刻度处；液体凹面、刻度和视线应在一 水平面上。 Ø 放液：吸量管移入准备接受溶液的容器中，使其出口尖端接触器壁， 并成一角度，吸量管仍保持垂直。放开食指，使液体自动流出。吸量 管应最后靠壁15秒。
Baidu Nhomakorabea 五、实验结果与分析
实验结果： Ø 按照实验报告要求计算实验结果。
分析： 通过操作本次实验，探讨影响本实验结果的主要影响 因素。 分析实验成功或失败的主要原因。
六、实验结论 酪蛋白的等电点接近多少？
七、思考题
1、书上p202，三道思考题？ 2、蛋白质沉淀测定常用的方法有哪些？
谢谢观赏！
观察溶液颜色和 结合思考1，
沉淀
解释
4
滴加0.1mol/L氢氧化钠溶液进行 观察溶液颜色和 结合思考2，
生物化学实验讲义——生工10
实验一 蛋白质的两性性质及等电点的测定
一 实验目的
通过实验了解蛋白质的两性性质和等电点的意义及与蛋白质分子聚沉的关系。
二 实验原理
蛋白质是由许多氨基酸组成的，故也是两性电解质。蛋白质分子中可以解离的基团除末端a －氨基与羧基外，还有肽链上氨基酸残基的侧链基团，如非a －羧基及氨基、胍基、咪唑基等基团，它们都能解离成带电基团。因此，蛋白质分子与氨基酸一样，在酸性溶液中作碱性解离，成为带正电荷的阳离子，在碱性溶液中作酸性解离，成为带负电荷的阴离子。
R
N
H 3+
R
COO
N
H 3+
R
COO H 2N
OH
OH
在一定氢离子浓度时，蛋白质分子的酸性解离与碱性解离相等，成为中性颗粒，所带正负电荷相等，净电荷为零，此时溶液的pH 值称为蛋白质的等电点（pI ）。在等电点时蛋白质分子在电场中既不向阴极移动，也不向阳极移动。而且分子间因碰撞而引起聚沉的倾向增加。所以此时蛋白质溶解度最小，若再加入乙醇、丙酮等试剂与蛋白质分子争夺水分子，减低了蛋白质分子外水化膜的厚度，而使浑浊度增加，蛋白质等电点与所含氨基酸种类和数量有关。若蛋白质含酸性氨基酸多，则等电点多略酸性，如胃蛋白酶的等电点为pH1左右，也有一些蛋白质含碱性氨基酸多，则等电点偏碱性。如鱼精蛋白等电点为pH12.0-12.4，含酸性和碱性氨基酸残基数目相近的蛋白质，其等电点为中性偏酸约5左右。本实验采用酪蛋白在不同pH 溶液中形成的混浊度来确定其等电点，即混浊度最大的溶液pH 值为该种蛋白质的等电点。
三 实验设备
(1) 试管架 1个
(2) 吸管 1mL 2支 ；2mL 1支 ；5mL 1支；10mL 1支 (3) 试管 1.5×15mL 10支 (4) 滴管 2支
实验一 蛋白质的两性性质和酪蛋白等电点的测定
实验一蛋白质的两性性质和酪蛋白等电点的测定
一、实验目的与要求
1. 掌握蛋白质的两性解离性质；
2. 熟练掌握测定蛋白质等电点的基本方法。
二、实验原理
蛋白质是由氨基酸组成的高分子化合物。虽然大多数的α-氨基和α-羧基成肽键结合，但仍有N末端的氨基和C末端的羧基存在，同时侧链上还有一些可解离基团。因此，蛋白质和氨基酸一样是两性电解质。调节蛋白质溶液的pH，可使蛋白质带上正电荷或负电荷；在某一pH时，其分子中所带的正电荷和负电荷相等，此时溶液中蛋白质以兼性离子形式存在。在外加电场中蛋白质分子既不向正极移动也不向负极移动，此时溶液的pH称为该蛋白质的等电点，蛋白质的溶解度最小。不同的蛋白质，因氨基酸的组成不同有不同的等电点。
三、实验材料、试剂与仪器
1. 材料与试剂
NaOH、HCl、乙酸、溴甲酚绿、酪蛋白、精密pH试纸等。
0.5 %酪蛋白溶液：0.5 g酪蛋白，先加入几滴1 mol/L的NaOH使其湿润，用玻璃棒搅拌研磨使成浆糊状，逐滴加入0.01 mol/L的NaOH使其完全溶解后定容到100 mL.
酪蛋白—乙酸钠溶液：将0.25 g酪蛋白加5 mL 1 mol/L的NaOH溶解，加20 mL 水温热使其完全溶解后，再加入5 mL 1 mol/L 的乙酸，混合后转入50 mL的容量瓶内，加水到刻度，混匀备用（pH 应为8~8.5）；
0.01 %的溴甲酚绿溶液：将0.01 g溴甲酚绿溶解于100 mL 含有0.57 mL 0.1 mol/L NaOH的水中。该指示剂的变色范围是：酸性（pH 3.8）为黄色，pH 5.4为蓝色；
蛋白质两性性质及等电点的测定
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加水至 50mL。 0.2mol/LNaOH：称取 NaOH2.000g，加水至
50mL ， 配 成 1mol/LNaOH 。 然 后 量 取 1mol/LNaOH10mL ， 加 水 至 50mL, 配 成 0.2mol/LNaOH。
0.2mol/LHCl：吸取 37.2%HCl4.17mL，加水 至 50mL ， 配 成 1mol/LHCl 。 然 后 吸 取
那是给天生一对的人的，自己，怎么会拥有像袁慕野那样的美好的人儿呢？木
1mol/LHCl10mL，加水至 50mL，配成 0.2mol/LHCl。
0.01%溴甲酚绿指示 剂：称取溴 甲酚绿
实验二.蛋白质的两性反应与等电点测定
wk.baidu.com
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实验二蛋白质的两性反应与等电点测定
生物化学与分子生物学实验
结论 1：
蛋白质是两性电解质 pH= pI时，蛋白质溶解度最小
酪蛋白的等电点在pH3.8-5.4之间
生物化学与分子生物学实验
酪蛋白等电点的测定
取7支同样规格的干燥试管，精确加入各试剂
试管号码 蒸馏水 1.00M醋酸 0.1M醋酸 0.01M醋酸 pH 1 2 3 4 5 6 7 2.4 3.2 — 3.0 1.5 2.75 3.38 — — 1.6 0.8 — — — — — 4.0 1.0 — — — — — — — 2.5 1.25 0.62 3.5 3.8 4.1 4.7 5.3 5.6 5.9
ph3854002mhcl溶液002mnaoh溶液001m醋酸溶液010m醋酸溶液100m醋酸溶液生物化学与分子生物学教研室观察溶液颜色并解释现象取一支干净的试管05酪蛋白液10滴溴甲酚绿指示剂3滴生物化学与分子生物学教研室滴加002mhcl溶液有最大沉淀产生至沉淀消失继续滴加002mhcl溶液观察沉淀颜色变化观察溶液颜色并解释现象继续滴加002mhcl溶液生物化学与分子生物学教研室继续滴加002mnaoh溶液有最大沉淀产生至沉淀消失继续滴加002mnaoh溶液观察沉淀颜色变化观察溶液颜色并解释现象生物化学与分子生物学教研室取7支同样规格的干燥试管精确加入各试剂试管号码蒸馏水24323015275338100m醋酸160801m醋酸4010001m醋酸25125062ph35384147535659注
蛋白质的两性性质及等电点的测定
蛋白质的两性性质及等电点的测定
1 实验目的
1.1 了解蛋白质的两性性质及等电点与蛋白质分子聚沉的关系。
1.2 掌握通过聚沉测定蛋白质等电点的方法。
2 实验原理
蛋白质是两性电解质。蛋白质分子中可以解离的基团除N端α―氨基与C端α―羧基外，还有肽链上某些氨基酸残基的侧链基团，如酚基、巯基、胍基、咪唑基等基团，它们都能解离为带电基团。因此，在蛋白质溶液中存在着下列平衡：
阳离子两性离子阴离子
pH < pI pH = pI pH > pI
电场中：移向阴极不移动移向阳极调节溶液的pH使蛋白质分子的酸性解离与碱性解离相等，即所带正负电荷相等，净电荷为零，此时溶液的pH值称为蛋白质的等电点。在等电点时，蛋白质溶解度最小，溶液的混浊度最大，配制不同pH的缓冲液，观察蛋白质在这些缓冲液中的溶解情况即可确定蛋白质的等电点。
3 主要仪器与试剂
3.1 器材
试管架；试管1.5×15cm（×8）；移液管1mL（×4），2mL（×4），10mL（×2）；胶头滴管（×2）。
3.2 试剂
1mol/L乙酸：吸取99.5%乙酸（比重1.05）2.875mL，加水至50mL。
0.1mol/L乙酸：吸取1mol/L乙酸5mL，加水至50mL。
0.01mol/L乙酸：吸取0.1mol/L乙酸5mL，加水至50mL。
0.2mol/L NaOH：称取NaOH2.000g，加水至50mL，配成1mol/L NaOH。然后量取1mol/L NaOH 10mL，加水至50mL, 配成0.2mol/L NaOH。
0.2mol/L HCl：吸取37.2%（比重1.19）HCl 4.17mL，加水至50mL，配成1mol/L HCl。然后吸取1mol/L HCl 10mL，加水至50mL，配成0.2mol/L HCl。
蛋白质的两性性质及等电点的测定
蛋白质的两性性质及等电点的测定
一实验目的
通过实验了解蛋白质的两性性质和等电点的意义及与蛋白质分子聚沉的关系。
二实验原理
蛋白质是由许多氨基酸组成的，故也是两性电解质。蛋白质分子中可以解离的基团除末端a－氨基与羧基外，还有肽链上氨基酸残基的侧链基团，如非a－羧基及氨基、胍基、咪唑基等基团，它们都能解离成带电基团。因此，蛋白质分子与氨基酸一样，在酸性溶液中作碱性解离，成为带正电荷的阳离子，在碱性溶液中作酸性解离，成为带负电荷的阴离子。
R
COOH N
H3+
R
COO
N
H3+
R
COO
H2N
OH
在一定氢离子浓度时，蛋白质分子的酸性解离与碱性解离相等，成为中性颗粒，所带正负电荷相等，净电荷为零，此时溶液的pH值称为蛋白质的等电点（pI）。在等电点时蛋白质分子在电场中既不向阴极移动，也不向阳极移动。而且分子间因碰撞而引起聚沉的倾向增加。所以此时蛋白质溶解度最小，若再加入乙醇、丙酮等试剂与蛋白质分子争夺水分子，减低了蛋白质分子外水化膜的厚度，而使浑浊度增加，蛋白质等电点与所含氨基酸种类和数量有关。若蛋白质含酸性氨基酸多，则等电点多略酸性，如胃蛋白酶的等电点为pH1左右，也有一些蛋白质含碱性氨基酸多，则等电点偏碱性。如鱼精蛋白等电点为pH12.0-12.4，含酸性和碱性氨基酸残基数目相近的蛋白质，其等电点为中性偏酸约5左右。本实验采用酪蛋白在不同pH溶液中形成的混浊度来确定其等电点，即混浊度最大的溶液pH值为该种蛋白质的等电点。
三实验设备
(1) 试管架 1个
(2) 吸管 1mL 2支；2mL 1支；5mL 1支；10mL 1支
蛋白质的两性反应和等电点测定
实验二蛋白质的两性反应和等电点测定
一、实验目的
（1）了解蛋白质的两性解离性质。
（2）学习测定蛋白质等电点的一种方法。
二、实验原理
蛋白质是两性电解质。在蛋白质溶液中存在电离平衡。
蛋白质分子的解离状态和解离程度受溶液的酸碱度影响。当溶液的pH达到一定数值时，蛋白质颗粒上正负电荷的数目相等，在电场中，蛋白质既不向阴极移动，也不向阳极移动，此时溶液的pH值称为此种蛋白质的等电点。不同蛋白质各有其特异的等电点。在等电点时，蛋白质的溶解度最低，容易沉淀析出。可利用此种性质的变化测定各种蛋白质的等电点。最常用的方法是测其溶解度最低时的pH值。
本实验借观察在不同pH溶液中的溶解度以测定酪蛋白的等电点。用醋酸与醋酸钠（醋酸钠混合在酪蛋白溶液中）配制成各种不同pH值的缓冲液。向诸缓冲液中加入酪蛋白后，沉淀出现最多的缓冲液的pH值即为酪蛋白的等电点。
三、实验材料、器材与试剂
1、材料
酪蛋白。
2、器材
（1）水浴锅；
（2）温度计；
（3）200mL锥形瓶；
（4）100ｍＬ容量瓶；
（５）吸管；
（６）试管及试管架；
（7）乳钵；
（8）记号笔。
3、试剂
（1）0.4%酪蛋白醋酸钠溶液200mL
取0.4g酪蛋白，加入少量水在乳钵中仔细研磨，将所得的蛋白质悬胶液移入200mL锥形瓶内，用少量40～50℃的温水洗涤乳钵，将洗涤液也移入锥形瓶内。加入10mL1mol/L醋酸钠溶液。把锥形瓶内的溶液全部移至100mL容量瓶内，加水至刻度，塞紧玻璃塞，混匀。
（2）1.00mol/L醋酸溶液；
（3）0.10mol/L醋酸溶液；
（4）0.01mol/L醋酸溶液；
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蛋白质的两性性质及等电点的测定
一 实验目的
通过实验了解蛋白质的两性性质和等电点的意义及与蛋白质分子聚沉的关系。
二 实验原理
蛋白质是由许多氨基酸组成的，故也是两性电解质。蛋白质分子中可以解离的基团除末端a －氨基与羧基外，还有肽链上氨基酸残基的侧链基团，如非a －羧基及氨基、胍基、咪唑基等基团，它们都能解离成带电基团。因此，蛋白质分子与氨基酸一样，在酸性溶液中作碱性解离，成为带正电荷的阳离子，在碱性溶液中作酸性解离，成为带负电荷的阴离子。
H
R
COOH
N
H 3+
H
R
COO
N
H 3+
H
R
COO H 2N
OH
在一定氢离子浓度时，蛋白质分子的酸性解离与碱性解离相等，成为中性颗粒，所带正负电荷相等，净电荷为零，此时溶液的pH 值称为蛋白质的等电点（pI ）。在等电点时蛋白质分子在电场中既不向阴极移动，也不向阳极移动。而且分子间因碰撞而引起聚沉的倾向增加。所以此时蛋白质溶解度最小，若再加入乙醇、丙酮等试剂与蛋白质分子争夺水分子，减低了蛋白质分子外水化膜的厚度，而使浑浊度增加，蛋白质等电点与所含氨基酸种类和数量有关。若蛋白质含酸性氨基酸多，则等电点多略酸性，如胃蛋白酶的等电点为pH1左右，也有一些蛋白质含碱性氨基酸多，则等电点偏碱性。如鱼精蛋白等电点为pH12.0-12.4，含酸性和碱性氨基酸残基数目相近的蛋白质，其等电点为中性偏酸约5左右。本实验采用酪蛋白在不同pH 溶液中形成的混浊度来确定其等电点，即混浊度最大的溶液pH 值为该种蛋白质的等电点。
三 实验设备
(1) 试管架 1个
(2) 吸管 1mL 2支 ；2mL 1支 ；5mL 1支；10mL 1支 (3) 试管 1.5×15mL 10支 (4) 滴管 2支
四 实验试剂
（1）1mol/L 醋酸溶液：
量取99.5%醋酸(比重1.05)2.875 mL ，加水至50 mL 。 （2）0.1mol/L 醋酸溶液：
量取1mol/L 醋酸5 mL ，加水至50 mL 。 （3）0.01mol/L 醋酸溶液：
量取0.1mol/L醋酸5 mL，加水至50 mL。
（4）0.2mol/L氢氧化钠溶液：
先称取氢氧化钠（分析纯）2g，加水至50 mL，配成1mol/L氢氧化钠。然后量取1mol/L氢氧化钠10 mL，加水至50 mL，配制成0.2mol/L氢氧化钠。
（5）0.2mol/L盐酸溶液：
先量取37.2%盐酸（比重1.19）4.17 mL，加水至50 mL，配成1mol/L盐酸。然后量取1mol/L的盐酸10 mL，加水至50 mL，配成0.2mol/L盐酸。
（6）0.01%溴甲酚绿指示剂：
称取溴甲酚绿0.005g、加0.29 mL 1mol/L氢氧化钠，然后加水至50 mL。
（7）0.5%酪蛋白溶液：
称取纯净酪蛋白0.25g放入50 mL容量瓶内，加水约20 mL，再准确加入1mol/L氢氧化钠5 mL，当酪蛋白溶解后，准确加入1mol/L醋酸5 mL，最后加水稀释至50 mL，充分摇匀。
注：氢氧化钠和醋酸溶液的浓度要标定。
五操作步骤
1、蛋白质的两性反应
（1）取两支试管，加0.5%酪蛋白2 mL，再加溴甲酚绿指示剂4-5滴，摇匀。此时溶液呈兰色，无沉淀生成，说明了什么？
（2）用滴管慢慢加入0.2mol/L盐酸，随加随摇直至有明显大量的沉淀生成，此时溶液的pH值接近酪蛋白的等电点，观察溶液颜色有何变化？
（3）继续滴加0.2mol/L盐酸，沉淀会逐渐减少消失。观察此时溶液的颜色有何变化，说明什么？
（4）滴加0.2mol/L氢氧化钠进行中和，沉淀又出现。继续滴加0.2mol/L氢氧化钠液，沉淀又逐渐消失，从溶液的颜色变化说明什么？
注：溴甲酚绿的变化范围pH3.8-5.4。
2、蛋白质等电点的测定
取5支试管依次标号，按下列表格添加试剂，立即摇匀，观察混浊度。各管混浊度以-、±、+、++、+++表示。
指出酪蛋白的等电点。
1 2 3 4 5
0.5%酪蛋白（mL）
蒸馏水（mL）
0.01mol/L醋酸（mL）0.1mol/L醋酸（mL）1.00
8.38
0.62
—
1.00
8.75
—
0.25
1.00
8.00
—
1.00
1.00
5.00
—
4.00
1.00
7.40
—
—
编
号试
剂
六实验结果
1、解释上述实验反应的现象
2、指出酪蛋白的等电点