转基因鱼

转基因鱼一、体态特征转基因鲤鱼F1代是由黄河鲤和草鱼生长激素基因组成的转“全鱼”基因鱼，它150天可长至1200克，最大可达2000克；两年可达5000克。

它的生长速度比普通鲤鱼快140%以上。

吉鲤是由转基因两倍体鲤鱼与转基因四倍体鱼（两套鲤鱼染色体，两套鲫鱼染色体）结合而培育出无生育能力的吉鲤。

吉鲤具有草鱼的生长快优点，又具有鲫鱼的味道。

由于它不能生育，因而在推广过程中不存在与其它鱼类杂交引起生态危机之忧。

转基因鱼的生物安全性包括食品安全性、生态和遗传安全性。

普通公认的转基因食品安全性评价原则是1993年欧洲经济发展合作组织（OECD）提出的“实质等同性”原则，即转基因食品及食品成份是否与市场上销售的传统食品具实质等同性。

转“全鱼”基因黄河鲤所转植的外源基因为一个与鲤鱼内源生长激素基因十分相似的草鱼生长激素基因。

将草鱼生长激素基因转移到鲤鱼身上，对鲤鱼来说是安全的；与传统养殖的鲤鱼相比，转“全鱼”基因黄河鲤携带有草鱼生长激素基因，体内含有非常微量的草鱼生长激素。

草鱼生长激素和鲤鱼生长激素一样，为鱼体内本来就存在的一种极不稳定的多肽，经过加热等物理处理后被分解为氨基酸，失去其激素的生理功能，和非转基因鲤鱼一样具有食用安全性。

转“全鱼”基因鱼商品化养殖后，是否会对鱼类种质资源和水生态环境产生影响？我们不妨把“全鱼”基因转移视为一种“杂交”，即一个基因与一个物种基因组的杂交。

鱼类的基因组大约有10万个基因。

转“全鱼”基因黄河鲤的形成机制可简单地比作一个草鱼基因与10万个鲤鱼基因的杂合。

物种的杂合程度仅为草鱼与鲤鱼杂交的十万分之一。

从这一点分析，转基因鱼比起任何杂交鱼要安全得多，再则，转基因鱼的繁殖能力和对环境的适应性均不占优势，即使让它进入大自然，它也不可能形成优势种群，抑制其它鱼类生长，对生态系统造成威胁。

而且，转基因鱼带有的草鱼基因仅是草鱼的十万个基因片断之一，即使它能与其它鱼类进行杂交，所造成的基因混乱的可能性也很小。

鱼类是研究转基因动物的良好材料，由于1尾雌鱼能提供成千上万个卵，卵的体积也很大，且它们在体外受精和体外发育，胚胎操作较哺乳类简单。

因此，继朱作言等获得第一批转基因鱼以来，世界上已有几十个实验室先后开展了这方面的研究，并取得了相当大的成就。

转基因鱼是国内外获得的最成功的转基因动物之一。

二、转基因方法1.显微注射法显微注射法是广泛使用、效果较好的一种鱼类基因导人方法，其主要程序如下：(1)人工催情，分别收集鱼的卵子和精液，体外人工受精；(2)受精后3～5min，用0．25%的胰蛋白酶消耗以去除卵壳，将裸卵移入盛有Holtfreter氏培养液的平面皿中；(3)将溶于ST(88mMNaCl、10mMTris—HCl，pH7．5)溶液中的外源基因装人玻璃微针，在第一次卵裂前实施外源基因的显微注射手术。

每卵注射1—2nL的DNA溶液，约含1×106拷贝的外源基因；(4)显微注射后，受体卵在Holffreter氏溶液中培养发育。

胚胎发育至原肠期后，将培养液逐渐用暴气的冷开水稀释；发育至心跳期后，将胚胎转移到暴气的冷开水中直至形成鱼苗。

在胚胎发育过程中，需精心管理，及时去除死胚胎。

上述方法主要适用于一些卵壳易被胰蛋白酶消化的淡水鲤科鱼类。

对于一些冷水性的鲑鳟鱼类来说，胰蛋白酶消化难以去除卵壳。

因此发展了3种变通的显微注射方法。

一是从受精孔将DNA溶液注入卵中，简称MP法；二是在虹鳟受精卵刚受精后卵壳尚未变硬时直接注射，简称EL法；三是先用硬金属针在卵壳上打一个孔，再进行显微注射，简称LI法。

2.电脉冲法电脉冲进行鱼类受精卵基因转移的前两步与显微注射法相同。

不同的是将胰酶消化后的裸卵与外源DNA溶液一同放人一特制的电脉冲处理槽中，然后施加一定强度的电脉冲。

外源DN在电脉冲处理下进入受精卵。

这一方法的优点是操作比较简单，可同时处理大量的受精卵。

缺点是导人无定向、效率较低，针对不同种鱼需要建立相应的电脉冲条件等。

外源基因在电脉冲处理条件下进入受精卵的机制尚不十分清楚。

在已成功的鱼类电脉冲基因转移报道中，使用的电压都较低(几百伏)。

有人认为，在这样的电压下，不足以使受精卵膜发生变态或产生小孔。

因此，外源基因的进入机制也就不同于培养细胞，推测是在鱼类受精膜上天然存在一些小孔，在低电压下，外源基因就通过这些小孔进入受精卵。

3.精子携带法精子在等渗液中先与外源基因保温，可将外源DNA片段带人精子细胞内，再与卵子受精，可将外源DNA片段带人受精卵内。

该方法简单、方便，依靠生理作用受精，对原核损害较小。

此法已在鲤鱼、泥鳅[5l中试验成功，已有6种鱼的成功报道。

其外源基因的处理方法虽各有不同，但都得到分子杂交或PCR检测的阳性结果，阳性率在5%～38%。

从总的实验结果来看，精子携带基因转移尚存在转基因阳性率低、转移率不稳定现象。

此外，精子携带外源基因的机制尚未明确，推测与精子表面吸附或精子细胞摄取有关。

4.基因枪注射法基因枪注射法是通过把吸附DNA的金属微粒高速打人细胞内，使基因导入细胞内的方法。

有人在泥鳅、斑马鱼、鲑鱼的3日胚上应用此法，结果70%的个体生存，一部分个体导入了外源基因。

此法不容易进行，但有短期可处理多个个体的优点，只是报道太少，有待今后进一步的研究。

5.逆转录病毒感染法此类病毒是RNA病毒的一种，进入宿主后从RNA逆转录成DNA，并结合到宿主细胞的染色体上，这种纳入病毒基因的细胞染色体内就存在了病毒基因。

如果把目的基因组合到病毒染色体上，用改造的病毒侵染宿主细胞就有可能向细胞内导人外源基因17J。

但转基因因病毒有严格的宿主特异性，而且鱼类转基因病毒的分析非常落后，对于鱼类此法暂不太适用。

6.组织注射法有报道外源基因向体组织直接注射时，周围细胞把外源基因纳人，并且发现了那种外源基因。

有人把CAT(链霉素转移酶基因)注射到一些鱼的体侧肌肉上，从肌肉匀浆中检测出CA T活性”。

另一方面，把含有合成黑色素的互补DAN质粒注射到一些鱼的体侧肌肉上，使周围体表合成黑色素，体表黑化。

这种方法能非常容易地把外源基因导人细胞内，所以对检测外源基因启动子非常有效。

7.卵母细胞的基因转移选取、收集、准备发育到一定时期的卵母细胞，显微镜下检查胚泡，若卵可供注射，操纵注射管，扎进胚泡进行显微注射，即将外源基因准确地注入卵母细胞核中，离体培养卵细胞至成熟卵，然后与正常精于受精，使受精卵整合外源基因，发育成转基因鱼。

8.基因打靶法20世纪90年代出现了新的外源基因导入技术，即基因剔除(gene knock out)和基因楔入(geneknockin)技术。

基因剔除是基因打靶的(genetargeting)一种方法，类似于同源重组技术，指外源DNA与受体细胞基因组合，这是一种先进的传染技术，克服了其它传染技术无法消除的盲目性和偶然性，具有整合位点确定、精确、转移基因频率较高等优势，但是基因剔除技术不能产生核苷酸水平上的精确突变，新的挑战使条件性基因剔除(conditional gene knock out)应运而生，这是基因剔除技术的一个飞跃。

它是指在某一特定的细胞类型或细胞发育的特定阶段剔除某一特定基因的技术，常采用打了就走(hit and runstrategy)、标记—交换(tag and exchange strategy)和Cre—10tP重组系统(Cre—Lot P recombina-tion system)等新的转基因策略，这些新策略可对细胞中任一基因进行核苷酸水平上的精确突变。

基因楔入又称基因置转技术(gene replace·menttechnique)，使双链的断裂点发生在同源序列的边缘或同源序列之外，转基因的结果是外源DNA取代内源靶序列，虽然基因楔人技术刚刚起步，但已经展示了它在应用研究方面的广阔前景。

以上介绍的几种基因打靶方法大大提高了外源基因的整合率，但是未能解决外源基因定点整合的问题。

小鼠ES细胞基因打靶技术可以获得对某一位点上基因进行改造的同合子个体。

该技术首先把含有更改好的基因或基因的一部分插入到载体，并引入来自小鼠的ES细胞系，ES细胞能进行组织培养，并能产生任何组织的细胞，细胞增殖一段时间后，筛选出发生同源重组的少数细胞进行克隆并扩增，然后用显微毛细管将细胞注入小鼠早期胚胎，产生嵌合体。

若该嵌合体在生殖细胞携带外源基因，则其后代中1/2为转基因个体，它们相互交配，后代中1/4为携带外源基因的同合子，即为可用于研究的转基因个体。

然而该技术的应用必须依赖于ES细胞，而ES细胞只能在小鼠上获得，故该技术只能局限在小鼠上展开。

如何在大动物上做到外源基因的定点整合是研究人员一直努力的方向。

三、存在问题1.外源基因的分离、定点整合和表达在现有的转基因鱼中，供体基因基本上都是来自哺乳类的BH基因rloI。

根据生物本身的特性，大分子尤其是蛋白质分子在种属上均具有特异性。

因此，在转基因研究中应尽量考虑供体和受体鱼之间的亲缘关系。

加强主要养殖鱼类抗逆、抗病基因的分离工作。

外源基因导人受精卵后，其整合率与基因操作技术有关，而整合率高低决定外源基因能否稳定遗传。

此外，外源墓因能否在受体细胞中高效表达，启动子和增强子起很大的作用，特定基因的启动子其功能具有组织特异性，增强子具有种的特异性。

如果能从鱼类的基因组中分离出合适的启动子，则可能会获得更有效的表达。

2.显微注射法在鱼类基因转移中比其它方法导入的外源基因整合率要高，但工作量非常大，对于季节性产卵的鱼类，注射鱼卵数有限，且很多胚胎夭折，在存活的鱼苗中，相当一部分不能发生整合，为后续的筛选带来诸多不便。

电脉冲法、精子携带法等高效转基因方法，整合率又非常低，更待进一步完善。

检测外源摹因整合率一般均使用斑点杂交和Southern印迹法。

这种方法需要很贵重的生物药品和酶类，且使用放射性同位素标记，代价高，耗时长，且有碍人体健康。

如能凭借鱼苗早期阶段的形态、花色等标记分出转基因鱼，及早淘汰非转基因鱼，将是转基因鱼研究的得力方法。

3.环境问题转基因鱼进人大自然，对生态平衡将会造成不同程度的影响。

许多科学家认为，转基因鱼的表型可能有3个方面改变，即生理节律性、对环境忍受力和行为。

这些表型的改变必定破坏现有的良性生态平衡。

此外，转基因鱼使用的启动子多为mMT，该启动子在许多运动组织中均诱发重金属离子的积累，人若长期食用这种转基因鱼，便会造成重金属中毒，这也必须予以重视。

4.筛选及品系建立转墓因鱼研究的目的是要获得经济价值高的转基因鱼品系供生产应用。

转基因鱼经过DNA水平、蛋白质水平以及宏观生长对比和生物学试验观察确定后，需要有一个快速建立优良品系的方法，通常所用的是单性发育方法。

理论上，经过二代单性发育，优良的遗传性状即能固定下来，形成新品系。