畜禽肉中土霉素,四环素,金霉素的测定

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高效液相色谱法测定猪肉中土霉素、四环素和金霉素

高效液相色谱法测定猪肉中土霉素、四环素和金霉素范露，靖涵之（武汉设计工程学院食品与生物科技学院，武汉 430205）摘要：对高效液相色谱法测定猪肉中土霉素、四环素和金霉素残留方法进行了优化，样品经0.1 mol/L Na2EDTA-Mcllvaine缓冲溶液（pH=3.5）提取，选用ZORBAX Eclipse XDB-C18色谱柱，以乙腈+0.01 mol/L NaH2PO4作为流动相梯度洗脱，流速1.0 mL/min，柱温30℃，检测波长365 nm，进样量10 μL，外标法定量。

三种抗生素在0.01 mg/mL～1 mg/mL范围内线性关系良好，土霉素和四环素检出限为0.125 mg/kg，金霉素检出限为0.4 mg/kg，相对标准偏差在5%以内，三种抗生素加标回收率在72.1%～101.5%之间。

该方法操作简便，能够较好地满足四环素类抗生素残留现行检测标准要求。

关键词：高效液相色谱法；猪肉；土霉素；四环素；金霉素；测定中图分类号：O657.72/TS251.5+1文献标识码：A 文章编号：1006-2513（2019）03-0162-07 Determination of oxytetracycline，tetracycline and aureomycin in pork by high performance liquid chromatographyFAN Lu，JING Han-zhi（College of Food & Biology Science and Technology，Wuhan institute of design and sciences，430205）Abstract：The method for determination of oxytetracycline，tetracycline and aureomycin in pork by high performance liquid chromatography was optimized. The sample was extracted with 0.1 mol/L Na2EDTA-Mcllvaine buffer solution （pH=3.5），the ZORBAX Eclipse XDB-C18 column was used to separate three antibiotics，and mobile phase was gradient eluted with acetonitrile+0.01 mol/L NaH2PO4，the ﬂow rate was 1.0 mL/min and the column temperature was 30℃，detection wavelength was 365 nm，injection volume was 10 μL，external standard method was selected to quantitative analysis. The linearity of three antibiotics was good in the range of 0.01 mg/mL～1 mg/mL，the detection limit of oxytetracycline and tetracycline was 0.125 mg/kg，the detection limit of aureomycin was 0.4 mg/kg，and relative standard deviation was within 5%，the recoveries of three antibiotics were between 72.1% and 101.5%. The method is simple and convenient，and meets the requirements of current detection standards for tetracycline antibiotic residues.Key words：high performance liquid chromatography；pork；oxytetracycline；tetracycline；aureomycin；determination收稿日期：2018-11-26作者简介：范露（1982-），女，副教授，研究方向：食品加工与安全。

猪、牛、鱼组织中四环素类药物残留的测定

（ｈｎｎｔｕｅｒａｙＤｕｏｔｌｅｎ１０８；Ｃｉ）ＣｉａＩｓｔｔｏＶｔｉｒｒｇＣｎｒ，Ｂｌｇ００１ｈｎｉｅｆｅｎｏｉｔａ
ＡｂｔａｔＡｎＥＩＡｔｏｓｄｖｌｐｄｆｒｔｅｄｔｒｎｔｎｏｔｃｃｉｅｈｏｔｔｃｃｉｅ，ｘｔｔａｙｌｅｓｒｃ：ＬＳｍｅｈｄｗａｅｅｏｅｅｅｍｉａｉｆｅｒｙｌ，ｃｌｒｒｙｌｏｈｏｔａｎｅａｎｏｙｅｒｃｃｉｎａｄｄｏｙｙｌｅｒｓｄｅｉｗｉｅａｔｎｓｓｕｓａｅｎｔｅｍｕｔｒｓｕｅｔｉｆｒｅｒｃｃｉｅｄｎｅｘｃｃｉｅｉｕｓｎ，ｃｔｅａｄｆｈｔｓｅｓｄｏｈｌ —ｅｉｅｔｓｋｔｏｔｙｌｓｍａｅｎｎｌｉｉｂｉｄｔａｎｉｕａｏａｏｙｈｍｉｏｅｅｔｎｗａｏｒａ３ｎｏｒｌｂｒｔｒ．Ｔｅｌｔｆｔｃｉｓｎｔｉｄｏｍｏｅｔｎ１ｈｋ．Ｒｃｖｒｓｒｎｅｒｍ７５ｔ１．％ｇｅｏｅｉａｇｄｆｅｏ４．％ｏ１９４
ｍｅｔｗｅｅ４２，３７，５１，１４．ｎ４．１ａｒ９．１８．２．２４ａｄ４ｋｅｐｃｉｅｙｇｒｓｅｔｃｌｒｔｃｃｉｅｘｔｔａｙｌｅｅｘｃｃｉｅｅｉｕ；ｔｓｋｔｙｗｏｄ：ｔｔｙｌａｎｈ０ｔｒｙｌ；ｏｙｅｒｃｃｉ；ｄｏｙｙｌ；ｒｓｄｅｅｔｉｅａｎｎｎ

高效液相色谱法对畜禽肉中土霉素、四环素、金霉素的残留检测研究

恒温振荡 20 min，再超声 5 min，最后在 25 ℃、7 000 r/min
离心 5 min。重复 1 次后，合并上清液于鸡心瓶中，用旋转
蒸发器蒸发至近干，然后准确加入 2.00 mL 乙腈溶解后转移
到 2 mL 离心管中高速离心，上清液经过 0.45 μm 滤膜，滤
液供液相色谱测定，本方法色谱图见图 1。
（2）提取液。将磷酸盐缓冲液与乙腈按照 2 ∶ 1 的比例混合（pH=2.5）。
所有玻璃器皿包括样品瓶均用 10% 的硝酸浸泡（长时间较好），之后放置在马弗炉中于 250 ℃条件下烧 2 h。
表 1 目标抗生素结构式及主要性质
结构式
中英文简称
主要性质
OH O
OHOHO
O NH2
OH HO CH3 H N(CH3)2
1.4 质量控制
定性依据：相对于标样，保留时间差别在 2% 以内；定
量方法：外标法定量；方法检出限（MDLs）：将实际环境
样品不断稀释进样（S/N ≥ 3）。
作者简介：吕振娥（1987—），女，河南南阳人，硕士，农艺师。研究方向：农产品质量安全。
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四环素 TC
1. 四环素 pKa 约为 3.32，在有氧、光照、强酸碱条件下会降解产生多种代谢产物，一定条件下代谢产物会转化为母体。
2. 溶于甲醇且易溶于水
OH O
OHOHO
O NH2
OH HO CH3OHH N(CH3)2
土霉素 OTC
1. 土霉素母体易溶于甲醇， pKa 值为 3.22；
2. 土霉素很容易降解为差向土霉素，且差向土霉素对动物的

土霉素、金霉素和四环素的检测方法

土霉素、金霉素和四环素的检测方法1、分析目标化合物:土霉素,金霉素,四环素2、仪器设备:带荧光检测器的高效液相色谱仪,3、试剂:除下列试剂外,使用附录2所列试剂,咪唑:特级咪唑缓冲溶液:将68.08g咪唑、0.37g EDTA 和10.72g乙酸镁溶解在800mL水中,用乙酸调节pH7.2后,加水至1,000mL,含有乙二胺四乙酸的柠檬酸缓冲溶液:第1液:将21.0g柠檬酸溶解在水中至1,000mL,第2液:将71.6g磷酸氢二钠溶解在水中至1,000mL,在1.86g乙二胺四乙酸中加入307mL第1液和193mL第2液混合的溶液溶解,苯乙烯二乙烯苯共聚物小柱 (265mg):在内径8～9mm 聚乙烯管中填充265mg柱色谱用苯乙烯二乙烯苯共聚物或具有同等分离特性的物质,4、标准品:盐酸土霉素:本品1.000mg 含有土霉素0.850mg以上效价,分解点为190℃～194℃,盐酸金霉素:本品1.000mg含有盐酸金霉素0.900mg以上效价,分解点为210℃以上, 盐酸四环素:本品1.000mg 含有盐酸四环素0.900mg以上效力,分解点为214℃以上,5、试验溶液的制备:A．提取方法:①肌肉、肝脏和肾脏肌肉:尽可能除去脂肪层,搅碎混合均匀后,称取其5.00g,肝脏和肾脏:搅碎混合均匀后,称取其5.00g,加入30mL含有乙二胺四乙酸的柠檬酸缓冲溶液,搅拌1分钟后,以每分钟3000转离心分离10分钟,水层移入100mL分液漏斗中,离心分离管的残留物中加入20mL含有乙二胺四乙酸的柠檬酸缓冲溶液,用振荡器激烈振荡1分钟后,按上述同样条件离心分离,合并水层于上述分液漏斗中,加入20mL正己烷, 用振荡器激烈振荡5分钟后,以每分钟3000转离心分离10分钟,分取水层,②脂肪脂肪:尽可能除去肌肉层,搅碎混合均匀后,称取其20.0g,加入200mL正己烷,搅拌1分钟后,加入40mL含有乙二胺四乙酸的柠檬酸缓冲溶液,再搅拌1分钟后,以每分钟3000转离心分离10分钟,分取水层,正己烷层中加入20mL含有乙二胺四乙酸的柠檬酸缓冲溶液,用振荡器激烈振荡1分钟后,按上述同样条件离心分离,分取水层,合并于先分取的水层中,③奶称取5.00g样品,加入30mL含有乙二胺四乙酸的柠檬酸缓冲溶液和20mL正己烷,用振荡器激烈振荡5分钟后,以每分钟3000转离心分离10分钟,分取水层,④蛋除去蛋壳,充分均匀后,称取其5.00g,加入30mL含有乙二胺四乙酸的柠檬酸缓冲溶液,均匀后,加入100mL正己烷,搅拌1分钟后,以每分钟3000 转离心分离10分钟,水层移入100mL 分液漏斗中,离心管的残留物中加入20mL含有乙二胺四乙酸的柠檬酸缓冲溶液,用振荡器激烈振荡1分钟后,按上述同样条件离心分离,合并水层于分液漏斗中,加入20mL正己烷, 用振荡器振荡5分钟后,以每分钟3000转离心分离10分钟,分取水层,⑤鱼贝类有壳贝类:除去壳,搅碎混合均匀后,称取其5.00g,其它的鱼贝类:搅碎混合均匀后,称取其5.00g,加入30mL含有乙二胺四乙酸的柠檬酸缓冲溶液,搅拌1分钟后,以每分钟3000转离心分离10分钟,水层移入100mL分液漏斗中,离心管的残留物中加入20mL含有乙二胺四乙酸的柠檬酸缓冲溶液,用振荡器激烈振荡1分钟后,按上述同样条件离心分离,合并水层于分液漏斗中,加入20mL正己烷, 用振荡器激烈振荡5分钟后,以每分钟3000转离心分离10分钟,分取水层,B．净化方法:在苯乙烯二乙烯苯共聚物小柱（265mg）中,顺次注入 10mL甲醇、10mL水和5mL饱和EDTA 溶液,弃去流出液,柱中注入a提取方法所得的溶液后,注入10mL水,弃去流出液,注入10mL 甲醇,收集流出液于磨口减压浓缩器中,40℃以下除去甲醇,残留物中加入1.0mL 1.36％磷酸二氢钾溶液溶解,此为试验溶液,6、操作方法:A．定性试验按下列操作条件进行试验,试验结果必须与标准品的一致,操作条件:柱填充剂:十八烷基甲硅烷基化硅胶(粒度5μm),柱:内径4.0～6.0mm,长150mm不锈钢管,柱温: 40℃检测器:激发波长380nm,发射波长520nm,流动相:土霉素和四环素试验时,用咪唑缓冲溶液:甲醇(17:3)的混合溶液,调整流速使土霉素约5分钟流出,金霉素试验时,用咪唑缓冲溶液:甲醇(3:1)的混合溶液,调整流速使金霉素约7分钟流出,B．定量试验根据与A定性试验相同操作条件所得的试验结果,峰高法或峰面积法定量,7、定量限:A．肌肉,肝脏,肾脏,奶,蛋和鱼贝类土霉素:0.02mg/kg金霉素:0.03mg/kg四环素:0.02mg/kgB．脂肪土霉素:0.005 mg/kg8、注意事项:(1)试验溶液的制备:①离心分离温度保持在室温,②抽滤后滤液混浊时,滤液再次进行离心分离,③在苯乙烯/二乙烯苯共聚物柱色谱中,注入试验溶液后,30mL水分数次加入效果较好地洗浄柱中残留的乙二胺四乙酸,(2)标准溶液的配制:①称取相当于10.0mg土霉素的标准品,溶解在甲醇中至10mL,作为土霉素的标准原液（土霉素1,000mg（效价）／L,1,000mg／L）,本标准原液保存在-20℃,1年内稳定,②称取相当于10.0mg金霉素的标准品,溶解在甲醇中至10mL,作为金霉素的标准原液（金霉素1,076mg（效价）／L,1,000mg／L）,本标准原液保存在-20℃,1年内稳定,③称取相当于10.0mg四环素的标准品,溶解在甲醇中至10mL,作为四环素的标准原液（四环素1,082mg（效力）／L,1,000mg／L）,本标准原液保存在-20℃,1年内稳定,④用1.36%磷酸二氢钾溶液将土霉素,金霉素和四环素各标准原液递减稀释,作为制作标准曲线用的标准溶液,(3)其它:①同时进行很多样品试验的筛选试验法提高判断効率时,用「土霉素,金霉素和四环素的筛选法（参照117 页）」判断为陽性的,不妨用本检测方法实施试验,②使用本检测方法检出土霉素,金霉素和四环素时,最好用带质量检测器的高效液相色谱仪确证.。

畜禽肉中土霉素、四环素、金霉素残留量测定方法

畜禽肉中土霉素、四环素、金霉素残留量测定方法1主题内容与适用范围本标准规定了畜禽肉中土霉素、四环素、金霉素残留量的检测方法。

本标准适用于各种畜禽肉中土霉素、四环素、金霉素残留量的测定。

最低检出浓度为:0.15，0.20，0.65mg/kg。

2原理样品经提取，微孔滤膜过滤后直接进样，用反相色谱分别，紫外检测器检测，与标准比较定量，出峰顺序为土霉素、四环素、金霉素。

标准加法定量。

3试剂3.1乙腈(分析纯)。

3.20.01mol/L磷酸二氢钠溶液:称取1.56g(±0.01g)磷酸二氢钠(NaH2PH4·2H2O)溶于蒸馏水中，定容到100mL，经微孔滤膜(0.45μm)过滤，备用。

3.3土霉素(OTC)标准溶液:称取土每素0.0100g(±0.0001g)，用0.1mol/L盐酸溶液每毫升含土霉素1mg。

3.4四环素(TC)标准溶液:称取四环素0.0100g(±0.001g)，用0.01mol/l盐酸溶液溶解并定容10.00mL，此溶液每毫升含四环素1mg。

3.5金霉素(CTC)标准溶液:称取金霉素0.0100g(±0.0001g)，溶于蒸馏水并定容成10.00mL，此溶液每毫升含金霉素1mg。

以上标准品均按1000单位/mg折算。

3.3～3.5溶液应于4℃以下保存，可使用1周。

3.6混合标准溶液:取3.3、3.4标准溶液各1.00mL，取3.5标准溶液2.00mL，置于10mL 容量瓶中，加蒸馏水至刻度。

此溶液每毫升含土霉素、四环素各0.1mg，金霉素0.2mg，临时现配。

3.75%高氯酸溶液。

4仪器4.1高效液相色谱仪(HPLC):具紫外检测器。

5色谱条件5.1柱:ODS-C18(45μm)6.2mm×15cm。

5.2检测波长:355nm。

5.3灵敏度:0.002AUFS。

5.4柱温:室温。

5.5流速:1.0mL/min。

5.6进样量:10μL。

畜、禽肉中土霉素、四环素、金霉素测定HPLC检测原始记录

畜、禽肉中土霉素、四环素、金霉素测定HPLC检测原始记录检验编号样品名称检验项目检验依据GB/T 5009.116-2003 电子天平流动相乙腈+0.01mol/L磷酸氢二钠=（35+65）高效液相色谱仪色谱柱检测器UV 流速 1.0mL/min 进样量(μL) 10 柱温室温温度(T/℃) 湿度(RH/%)检测波长355nm 检测日期年月日对照品名称生产厂家（批号、含量%）重量(mg)定容体积(mL)储备液浓度(μg/mL)配制日期土霉素（OTC）四环素(TC)金霉素（CTC）标准工作液配制：标准对照液配制：添加对照样品：称取 5.00g空白样品，精密量取四环素类工作液(约µg/mL) µL，于空白样品中，使之成为约µg/ kg的添加样品。

残留量iX=MAVACSS回收率＝%100⨯XX注：计算添加样品的残留量时，添加样品峰面积必须扣除空白样品的峰面积。

项目项目名称OTC TC CTC 空白样品(g)添加样品(g)定容体积V(ml)对照溶液浓度Cs(μg/L)添加量X0(μg/kg)空白样品峰面积A空白样品添加样品峰面积A添加样品对照溶液峰面积(A S)残留量X(μg/kg)回收率(%)畜、禽肉中土霉素、四环素、金霉素测定HPLC 检测原始记录样品名称检验依据 GB/T 5009.116-2003 检验项目检测日期年月日样品编号上机编号取样量 m(g) 定容体积V （mL ）检测结果（ µg/kg ）OTCTCCTC残留总量 1平均值/相对偏差2平均值/相对偏差3平均值/相对偏差4平均值/相对偏差5平均值/相对偏差计算公式i X =MA VA C S S ⅹ1000 备注OTC ：土霉素；TC 四环素；CTC ：金霉素。

X i ：供试组织中单个四环素类药物的残留量（µg/kg ）；C s ：对照溶液中相应四环素类药物的浓度（µg/mL ）；A ：试样溶液中相应四环素类药物的峰面积；A s ：对照溶液中相应四环素类药物的峰面积；V ：洗脱液总体积（mL ）；M ：供试试料的质量(g)。

土霉素金霉素和四环素的检测方法

土霉素、金霉素和四环素的检测方法1. 分析目标化合物土霉素，金霉素，四环素2. 仪器设备带荧光检测器的高效液相色谱仪。

3．试剂除下列试剂外，使用附录2所列试剂。

咪唑：特级咪唑缓冲溶液：将68.08g咪唑、0.37g EDTA 和10.72g乙酸镁溶解在800mL水中，用乙酸调节pH7.2后，加水至1,000mL。

含有乙二胺四乙酸的柠檬酸缓冲溶液：第1液：将21.0g柠檬酸溶解在水中至1,000mL。

第2液：将71.6g磷酸氢二钠溶解在水中至1,000mL。

在1.86g乙二胺四乙酸中加入307mL第1液和193mL第2液混合的溶液溶解。

苯乙烯二乙烯苯共聚物小柱 (265mg)：在内径8～9mm 聚乙烯管中填充265mg柱色谱用苯乙烯二乙烯苯共聚物或具有同等分离特性的物质。

4．标准品盐酸土霉素：本品1.000mg 含有土霉素0.850mg以上效价，分解点为190℃～194℃。

盐酸金霉素：本品1.000mg含有盐酸金霉素0.900mg以上效价，分解点为210℃以上。

盐酸四环素：本品1.000mg 含有盐酸四环素0.900mg以上效力，分解点为214℃以上。

5．试验溶液的制备a 提取方法①肌肉、肝脏和肾脏肌肉：尽可能除去脂肪层，搅碎混合均匀后，称取其5.00g。

肝脏和肾脏：搅碎混合均匀后，称取其5.00g。

加入30mL含有乙二胺四乙酸的柠檬酸缓冲溶液，搅拌1分钟后，以每分钟3000转离心分离10分钟，水层移入100mL分液漏斗中。

离心分离管的残留物中加入20mL 含有乙二胺四乙酸的柠檬酸缓冲溶液，用振荡器激烈振荡1分钟后，按上述同样条件离心分离，合并水层于上述分液漏斗中。

加入20mL正己烷, 用振荡器激烈振荡5分钟后，以每分钟3000转离心分离10分钟，分取水层。

① 脂肪脂肪：尽可能除去肌肉层，搅碎混合均匀后，称取其20.0g。

加入200mL正己烷，搅拌1分钟后，加入40mL含有乙二胺四乙酸的柠檬酸缓冲溶液，再搅拌1分钟后，以每分钟3000转离心分离10分钟，分取水层。

HPLC法测定牛羊肉中土霉素、四环素、金霉素残留量

２０１３年８月第３４卷第１６期ＤＯＩ：１０．３９６９０．ｉｓｓｎ．１００５－６５２１．２０１３．１６．０２７
ＦｏｏｄＲｅｓｅａｒｃｈＡｎｄ１）ｅｖｅｌｏｐｍｅｌｉｔ
ＧＡＯＧｕａｎｇ－ｈｕｉ，ＬＩＹａｎｇ，ＳＵＮＸｉａｏ－ｊｕａｎ，ＷＡＮＧＸｉａｏ－ｌｉ
（１．ＬｉａｏｎｉｎｇＰｒｏｖｉｎｃｉａｌＩｎｓｔｉｔｕｔｅｆｏｒＦｏｏｄａｎｄＤｒｕｇＣｏｎｔｒｏｌ，Ｓｈｅｎｙａｎｇ１１００２３，Ｌｉａｏｎｉｎｇ，Ｃｈｉｎａ；２．ＳｈｅｎｙａＬＣ法测定牛羊肉中土霉素、四环素、金霉素残留量
高广慧，李阳，孙晓娟，王晓黎（１．辽宁省食品药品检验所，辽宁沈阳１１００２３；２．沈阳市产品质量监督检验食品所，辽宁沈阳１１００２３）
ＰｒｏｄｕｃｔＱｕａｌｉｔｙＳｕｐｅｒｖｉｓｉｏｎａｎｄＩｎｓｐｅｃｔｉｏｎＩｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｓｈｅｎｙａｎｇ１１００２３，Ｌｉａｏｎｉｎｇ，Ｃｈｉｎａ）
ＤｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆＯｘｙｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ，ＴｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅａｎｄＣｈｌｏｒｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅＲｅｓｉｄｕｅｓｉｎＢｅｅｆａｎｄＭｕｔｔｏｎｂｙＨＰＬＣ

动物性食品中土霉素、金霉素和四环素检测方法研究进展

动物性食品中土霉素、金霉素和四环素检测方法研究进展杨琳【摘要】Tetracycline is a kind of broad-spectrum antibiotic. It has a good bactericidal effect which often used as a feed additive in animal husbandry and aquaculture. The common tetracyclines areOxytetracycline,Chlortetracycline,and Tetracycline. In recent years, some lawless persons abuse these kinds of drugs for economic benefit resulting in large residual of oxytetracycline,chlortetracycline, tetracycline in animal foods,which impact on public health seriously. The detection methods of oxytetracycline,Chlortetracycline,and Tetracycline in animal foods are mainly high performance liquid chromatography,capillary electrophoresis method,immunology and microbiology methods,and the high performance liquid chromatography is the most widely used.% 四环素类药物是一类广谱抗菌素，有良好的杀菌抑菌作用，经常作为饲料添加剂用于畜牧及水产养殖中，常见的四环素类药物包括土霉素、金霉素、四环素。

四环素类药物检测(高效液相色谱法).

表3
分离七种四环素类药物的液相色谱流动相的洗脱体积
时间/min
甲醇/%
乙腈/%
10mmom/L 三氟乙酸/%
0
1
4
95
5
6
24
70
9
7
28
65
12
0
35
65
15
0
35
65
测定步骤
C）流速：1.5mL/min。 D）柱温：30℃。 E）进样量：100uL。 F）检测波长：350mm。
测定步骤
高效液相色谱测定：根据样液中被测四环素类兽药残留的含量情况，选定峰高相近的标准工作溶液。标准工作溶液和样液中四环素类兽药残留的响应值均应在仪器的检测线性范围内。对标准工作溶液和样液等体积参插进样测定，在上述色谱条件下，二甲胺四环素、土霉素、四环素、去甲基金霉素、金霉素、甲烯土霉素、强力霉素的参考保留时间分别约为6.3min、7.5min、7.9min、8.7min、9.8min、10.4min、10.8min标准
测定步骤
C）定量离子、定性离子及子离子丰度比每种化合物的质谱定性离子必须出现，至少应包括一个母离子和两个子离子，而且同一检测批次对同一化合物，样品中目标化合物的两个子离子的相对丰度比与浓度相当的标准溶液相比，其允许偏差不超过表5.22 规定的范围。
表2
定性时相对离子丰度的最大允许偏差
相对离子丰度
样品制备与贮存
制样过程中应防止样品受到污染或残留物含量发生变化。 1. 动物肌肉、肝脏、肾脏和水产品从所取全部样品中取出约500g，用组织捣碎机充分捣碎均匀，装入洁净容器中，密封，并标明标记，于-18℃以下冷冻存放。
2. 牛奶样品
从所取全部样品中取出约500g，充分混匀，装入洁净容器中，密封，并标明标记，于-18℃以下冷冻存放。

鸡肉组织中四环素类药物残留检测与分析

鸡肉组织中四环素类药物残留检测与分析四环素类药物被广泛应用于畜禽养殖中的预防和治疗，但过多的使用会导致药物残留在畜禽肌肉组织中。

这些残留物会被穿过食物链传递给人类，对人体健康造成潜在威胁。

因此，检测和控制食品中四环素残留成为食品安全的重要问题。

本文将讨论如何对鸡肉组织中的四环素类药物残留进行检测和分析。

四环素类药物的种类繁多，常见的有土霉素、金霉素、强力霉素等。

在肌肉组织中，四环素类药物残留的检测方法包括高效液相色谱法（HPLC）、气相色谱法（GC）、液相色谱质谱法（LC-MS/MS）等。

其中，HPLC是目前应用最为广泛的方法。

HPLC法是一种通过分离、检测药物分子的手段，使用高速流动的溶液来满足有效分离各成分的需求。

在检测鸡肉组织中四环素药物残留时，可根据药物的分子结构、化学性质和质量特征进行选择。

例如，强力霉素的化学结构具有羰基、羟基、胺基及吡啶烷基等特征，因此常采用反向高效液相色谱法（RP-HPLC）进行检测。

此方法提供了一种简单、快速、灵敏的测定药物和基质中的成分的方法。

同时，光谱扫描型液相色谱法（PDA-HPLC）也是一种有效的方法，它能够同时测定几个四环素类药物的残留。

除了HPLC法，GC法同样可以用于检测肌肉组织中四环素类药物的残留。

由于四环素类药物的挥发性较小，所以在前处理上需要进行萃取和衍生化。

例如，金霉素的乙酸丁酯衍生物通常是在硫酸脱水糖苷(被称为三氯化磷)的作用下制备，并使用氮气气相色谱法进行检测。

此方法具有样品准备时间短、样品有效加工过程的性质。

但是，GC检测方法需要药物在样品中的含量高于HPLC检测方法，并且有一些残留物不能通过GC法来进行检测。

液相色谱质谱法（LC-MS/MS）是四环素类药物残留检测中的新兴技术，它可以确定药物的分子结构和初步扫描出残留物的种类和数量。

此外，由于其具有高分辨能力、灵敏度和可靠性，LC-MS/MS技术已成为目前国际通用的药物残留检测方法之一。

高效液相色谱法测定鸡肉中土霉素、四环素、金霉素和强力霉素残留量的方法优化探讨

图1　土霉素标准曲线图
图2　四环素标准曲线图
XIANDAISHIPIN109
/
图3　金霉素标准曲线图
图4　强力霉素标准曲线图
图5　100 ng/mL的标准品色谱图
1.3.3　样品测定
在1.3.1的色谱条件下对净化后的滤液进样测定，外标法定量。

空白样品色谱图参见图6，样品加标色谱图见图7。

图6　空白样品色谱图
图7　样品加标色谱图
2　结果与分析
2.1　标准曲线的线性分析
在1.3.1的色谱条件下，分别对混合标准系列溶液进行分析，得到符合分析要求的线性，线性回归方程、相关系数和线性范围参见表1。

表1　标准曲线的线性回归方程、相关系数和线性范围表标准品线性回归方程相关系数
线性范围
/（ng/mL）土霉素A=0.17525385C-0.17364250.999775～200
四环素A=0.21667536C-0.06731530.999975～200
金霉素A=0.10064399C+0.01572880.999375～200
强力霉素A=0.14079752C+0.02589150.999475～200
XIANDAISHIPIN 110/。

固相萃取_高效液相色谱法测定畜禽粪便中的土霉素_金霉素和四环素

第29卷第4期2010年 7月环境化学E NV I RONMENTAL C H E M I STRYV o.l 29,N o .4July 20102009年6月29日收稿.*安徽省自然科学基金资助项目(070415213);国家水体污染控制与治理科技重大专项(2008ZX07101 004 001). **通讯作者,Te:l(0551)2904144,E m ai:l hu z henhu @ustc edu固相萃取高效液相色谱法测定畜禽粪便中的土霉素、金霉素和四环素*孙刚1,2袁守军1彭书传2陈凤琴3胡真虎1,4**(1 合肥工业大学土木与水利工程学院,合肥,230009;2 合肥工业大学资源与环境工程学院,合肥,230009;3 安徽医科大学实验动物中心,合肥,230032;4 D epart m ent ofC i vil Engi n eeri ng ,NationalUn i vers i ty of Irel and Gal w ay ,Ireland)摘要固相萃取高效液相色谱法(SPE H PLC)检测猪、鸡和牛等畜禽粪便中土霉素(OTC )、四环素(T C)和金霉素(CTC)等四环素类抗生素.畜禽粪便采用EDTA M cll va i ne 缓冲提取液提取,并用LC 18固相萃取柱富集畜禽粪便样品中的抗生素.结果表明,采用该预处理方法,三种抗生素的加标回收率介于51 3% 93 7%之间.以0 01m o l l -1草酸溶液/乙腈/甲醇(V /V /V =76/16/8,p H =2 5)混合溶液为流动相,在355n m 检测波长条件下,三种抗生素能完全分离,且检测灵敏度较高;土霉素、四环素和金霉素的检出限分别为0 029m g kg -1、0 055m g kg -1和0 073m g kg -1.采用该方法分析安徽省合肥地区的畜禽养殖场的畜禽粪便,除部分牛粪外,均有抗生素检出.关键词土霉素,四环素,金霉素,畜禽粪便,固相萃取高效液相色谱法.自从20世纪50年代以来,抗生素作为动物促生长剂和治疗用药已被广泛应用于动物饲养业.目前,我国允许在生产中使用的抗生素有17种,其中四环素类最为普遍,约占抗生素总用量的57%[1].四环素类抗生素主要包括三种,土霉素(OTC )、四环素(TC)和金霉素(CTC ).抗生素在畜禽体内并不能被完全吸收,大约60% 90%以药物原形或初级代谢产物的形式随动物粪便排出体外[2].因此,大量随畜禽粪便进入环境的残留抗生素,将会对地表水、农田土壤甚至地下水造成污染.抗生素最大的潜在风险是导致耐药性致病菌的产生和扩散,这将导致对人类公共健康的威胁[3].本文用固相萃取高效液相色谱法(SPE H PLC)同时测定畜禽粪便中土霉素、四环素和金霉素,并检测了安徽省合肥市周边地区畜禽养殖场粪便样品中的土霉素、四环素和金霉素的残留.1 实验方法1 1 仪器和试剂岛津SPD 20A 型液相色谱仪和UV 检测器(岛津公司,日本),液相色谱分析柱为SH IM PAC K VP ODS(5 m ,150mm !4 6mm,岛津公司,日本)和K ro m asil C18NC 高效液相色谱柱(5 m ,250!4 6mm,大连中汇达科学仪器有限公司).S UPELCO(V I SI PREP DL)固相萃取装置(色谱科公司,美国),S UPELCLEAN LC 18固相萃取小柱(3m ,l 色谱科公司,美国),超声波清洗器(KQ2200,昆山市超声仪器有限公司),和涡旋混合器(QL 861,海门市其林贝尔仪器制造有限公司).土霉素、四环素和金霉素购自中国兽医药品监察所,甲醇和乙腈为色谱纯,磷酸二氢钠、草酸、乙二胺四乙酸二钠(N a EDTA )为分析纯.1 2 粪便样品采集选取安徽省合肥市周边地区大中型集约化肉鸡养殖场3个,养猪场3个,养牛场2个,在每个养殖场的不同位置采集2 4份新鲜粪便样品,用样品袋密封后于-18∀冷冻保存备用.1 3 粪便样品预处理及加标回收率的测定740环境化学29卷精确称取100 000#0 005m g土霉素、四环素和金霉素等标准物质,分别用甲醇配成100m g l-1的标准储备液,于4∀贮存.取1 00#0 01g新鲜粪样于10m l刻度玻璃试管中,加入3m l EDTA M cllva i n e缓冲提取液(0 05 m o l l-1EDTA+0 06mo l l-1N a2HPO4+0 08m ol l-1柠檬酸,p H=4#0 05)[4],涡旋30s后超声萃取10m i n,并以4000r m i n-1离心20m in,上清液转入另一离心管,再重复提取2次,合并3次提取液,加入10%的三氯乙酸0 5m,l静置4h,再次以4000r m i n-1离心20m i n,上清液转入另一试管中待用.SPE小柱先用3m l甲醇和3m l蒸馏水活化,流速约2m l m in-1,然后将以上提取液过柱,依次用5m l蒸馏水冲洗SPE小柱、3m l0 01mo l l-1的草酸甲醇溶液洗脱抗生素,洗脱液在40∀条件下用高纯氮气吹脱至近干,最后用草酸、乙腈和甲醇混合流动相溶液定容至1m l待测.采用外标法测定该预处理方法对畜禽粪样中抗生素回收率的影响.称取1 00#0 01g粪便样品,每种抗生素标样添加两个水平.土霉素、四环素和金霉素低水平添加量分别为2 g、2 g、4 g(添加土霉素、四环素和金霉素的浓度分别为10m g l-1、10m g l-1和20m g l-1的混合标准溶液0 2m l),高水平添加量为20 g、20 g、40 g(添加土霉素、四环素和金霉素浓度分别为100mg l-1、100 m g l-1和200mg l-1的混合标准溶液0 2m l),每个水平重复三次.按上述预处理方法处理后采用H PLC检测,计算抗生素回收率和相对标准偏差.1 4 色谱条件的筛选与确定对土霉素、四环素和金霉素标准液及其混合标准液进行紫外可见扫描,获取特征波长值;结合特征波长值下的紫外色谱图,确定最适宜检测波长.不同的色谱柱对抗生素的分离性能存在差异,同时对柱停留时间有显著影响.本试验在其它条件相同的情况下对比了SH I M PACK VP ODS色谱柱和Kro m asilC18NC高效液相色谱柱对抗生素的分离性能和柱停留时间的差异,并确定色谱分离柱.样品分析的流动相为0 01m o l l-1草酸溶液、乙腈和甲醇混合液(V/V/V,=76/16/8 (p H=2 5),柱温25∀,流速1m l m i n-1,进样量为25 .l2 结果与讨论2 1 SPE萃取的影响提取液经SPE萃取前,应滴加三氯乙酸后静置4h并离心去除蛋白质等物质,能有效降低萃取过程所需负压.SPE小柱活化时,甲醇可自然流出,蒸馏水流速控制在2m l m i n-1以内.提取液过柱时的负压宜控制在-5kPa以下,SPE小柱经冲洗后,应维持-10KPa的负压0 5m in,以排尽柱中残留水分.试验表明,洗脱液体积为3m l时,洗脱效果良好,再增加洗脱液体积对洗脱效果影响不大,所以取洗脱液体积为3m,l流速为2m l m i n-1.同时,洗脱结束时应维持-10KPa的负压0 5m i n,使洗脱液能全部流出.按上述操作,将抗生素混合液直接经萃取柱富集,在不同添加量条件下萃取柱对抗生素的回收率在55 8% 81 3%之间,满足检测要求.2 2 检测波长的影响土霉素、四环素和金霉素混合液的吸光度波长扫描图表明其在225nm、280nm和355nm附近各存在一个吸收峰.相同浓度的抗生素混合液在上述3个特征波长条件下的色谱图对比显示,相同的抗生素浓度在225nm条件下检测的色谱峰面积最大,即225nm的检测灵敏度最高.然而,225nm波长条件下检测到的杂质峰明显较多,且杂质峰面积也较大.同时,粪便样品提取液在225nm和355n m 波长条件下的色谱图比较表明,225n m波长条件下杂质峰的影响更显著.355nm和280n m条件下的色谱图中杂质峰较少,峰形较好且峰形相近,但355nm相对于280nm波长灵敏度更高.这与动物肉制品中抗生素的国家标准检测方法∃可食动物肌肉中土霉素、四环素、金霉素、强力霉素残留量的测定液相色谱紫外检测法%(GB/T20764 2006)中选择的检测波长为350nm相一致.综合分析,355n m 波长对抗生素的检测灵敏度较高,三种抗生素峰能完全分离,同时杂质峰较少如图1所示.因此,对于畜禽粪便样品,355nm为较适宜的检测波长.4期孙刚等:固相萃取高效液相色谱法测定畜禽粪便中的土霉素、金霉素和四环素7412 3 色谱柱的选择采用草酸、乙腈和甲醇混合流动相,流速为1m l m in-1,对比SH IM PAC K VP ODS色谱柱和K ro m asil C18色谱柱对抗生素的分离性能和柱停留时间的影响.结果表明,上述条件下两种色谱柱均能实现土霉素、四环素和金霉素峰的完全分离,满足分析要求,但抗生素柱停留时间差异显著,尤以金霉素最为显著.金霉素在SH I M P ACK VP ODS色谱柱和K ro m asil C18色谱柱中的柱停留时间分别为17 1m i n和34 8m i n,两者相差约一倍.在大批量检测情况下,柱停留时间的增加将显著降低检测效率,且大幅度增加有机溶剂的使用量,所以本试验选择SH I M PAC K VP ODS色谱柱.图1 土霉素、四环素和金霉素混合标准溶液在355n m波长的HPLC色谱图F i g 1 HPLC graph of OTC,TC and CTC standard m i x t ure at w avelength of355nm2 4 加标回收率猪粪和鸡粪中抗生素的加标回收率如表1所示,三种抗生素的回收率在51 3% 93 7%之间.相对于猪粪,鸡粪中三种抗生素的回收率均最高.另外,相同加标量条件下,粪样中CTC回收率略低于OTC和TC的回收率.相关研究表明,经H LB小柱富集,纯水中抗生素回收率达73% 92%[5],猪肝中土霉素和四环素的回收率在90%以上,金霉素回收率在30 93% 65%[6],而土壤中和底泥中四环素类抗生素的回收率在27% 85%[7].本试验中回收率范围与相关研究结果一致,完全满足检测需求.表1 畜禽粪便中土霉素、四环素和金霉素的回收率Tab l e1 R ecovery of OTC、TC and CTC i n m anure抗生素加标量(mg l-1)回收量/mg l-1回收率/%相对标准偏差/%,(n=3)牛粪猪粪鸡粪牛粪猪粪鸡粪牛粪猪粪鸡粪土霉素2 01 1#0 21 2#0 11 3#0 154 459 765 912 15 93 6 2015 1#2 013 3#1 618 7#0 875 666 493 711 08 43 2四环素2 01 1#0 31 1#0 11 3#0 157 057 564 517 35 74 8 2012 9#2 512 9#1 416 5#1 564 464 382 711 08 66 7金霉素4 01 4#0 32 1#0 22 0#0 433 951 551 312 16 217 5 4019 1#3 023 0#3 330 3#2 547 957 675 811 910 25 72 5 标准曲线的线性及检出限配制系列浓度混合标准液,其中土霉素和四环素浓度为0 1、0 5、1、5、10、20mg l-1,金霉素浓度为0 2、1、2、10、20、40m g l-1,进样量为25 .l在前述的色谱条件下测定,三种抗生素的响应峰面积(y) 浓度(x)的线性回归方程和相关系数R2如下所示:OTC:y=1987 7+16402 5x R2=0 9996TC:y=1555 5+17898 2x R2=0 9999CTC:y=-78 8+16682 1x R2=0 9993结果表明3种抗生素在该浓度范围内线性关系良好.连续3次测定土霉素,四环素和金霉素浓度分别为1 0mg l-1、1 0m g l-1和2 0m g l-1的混合标准液,通过下式计算检出限[8]:742环境化学29卷L=S!t(n-1,0 99)(1)式中,S为平行测定的标准偏差,n为重复分析的样品数,连续分析3个样品时,在99%的置信区间,t(2,0 99)=6 964.若以提取1g样品,浓缩至1m,l进样25 l分析计算,土霉素,四环素和金霉素的检出限分别是0 029m g kg-1、0 055m g kg-1和0 073m g kg-1.2 6 实际粪便样品中土霉素、四环素和金霉素残留测定预处理后的提取液采用以上建立的色谱条件检测.表2中为该批畜禽粪样中四环素类抗生素残检测结果.结果表明,被采样的养猪场和养鸡场的畜禽粪便中普遍存在土霉素、四环素和金霉素残留,其中鸡粪中土霉素的平均含量高达11 25m g kg-1,猪粪中四环素和金霉素的平均含量达3 84和8 63m g kg-1,但部分牛粪样品中未检测到抗生素残留.该结果也同时表明,采用该检测方法用于畜禽粪便中土霉素、四环素和金霉素残留的测定是可行的.表2 规模化养殖场畜禽粪便中四环素类抗生素残留(mg kg-1,干物质计)Tab le2 R esidue of tetracy li nes i n m anure from l arge sca le an i m al far m s(m g kg-1,dry m atter)粪样土霉素四环素金霉素范围平均范围平均范围平均猪粪(n=3)0 83 4 992 831 69 7 033 841 1 9 448 63牛粪(n=2)Bd l 2 431 21Bd l 6 823 41Bdl 4 842 42鸡粪(n=3)1 33 30 0611 25Bd l 1 450 581 0 2 971 92注:Bdl为未检出.3 结论固相萃取高效液相色谱法(SPE HPLC)检测猪、鸡和牛等畜禽粪便中土霉素、四环素和金霉素等四环素类抗生素.畜禽粪便经EDTA M c llvaine和LC 18固相萃取柱预处理后,三种抗生素的回收率介于51 3% 93 7%之间.以0 01m o l l-1草酸溶液/乙腈/甲醇(V/V/V=76/16/8,p H=2 5)混合溶液为流动相,在355n m检测波长条件下,土霉素、四环素和金霉素的检出限分别为0 029m g kg-1、0 055m g kg-1和0 073m g kg-1.分析了安徽省合肥地区的畜禽养殖场的畜禽粪便,均有抗生素检出,其中鸡粪中土霉素、四环素和金霉素的平均含量分别为11 25m g kg-1、0 58m g kg-1、1 92 m g kg-1,猪粪中的相应含量为2 83m g kg-1、3 84m g kg-1和8 63m g kg-1,牛粪中的相应含量则为1 21m g kg-1、3 41mg kg-1和2 42m g kg-1.参考文献[1] L iR P,Zhang Y,H uang Y P,Deter m inati on of Tetracycli ne An tibiotics i n t h e Environm en t al Sa m p l es[J] P rogress i n Che m istry,2008,20(12)&2075 2082[2] Kumm erer K,An ti b i otics in t h e Aqu ati c Environm en t A Revi e w Part I[J] Che m osphere,2009,75(4)&417 434[3] Sar m ah A K,M eyerM T,B oxallA B A,A G l obalPerspective on theU se,Sales,Exposure Pathw ays,Occu rrence,Fate and E ff ects ofV eteri nary An ti b i oti cs(VA s)i n the Env i ronm ent[J] Che m osphere,2006,65(5)&725 759[4] Jia A,X i ao Y,H u J Y et al ,S i m ultaneous Deter m i n ati on ofT etracycli n es and Their Degradati on Products i n Env i ronm entalW at ers byL i quid Chro m atography E lectros p ray Tande m M ass Spectro m etry[J] Journa l of Chro ma to g raphy A,2009,1216(22)&4655 4662 [5] 刘玉春,徐维海,余莉莉等,固相萃取液相色谱质谱/质谱联用测定河水中大环内酯类抗生素[J] 分析测试学报,2006,25(2)&1 5[6] 陶大勇,焦海宏,张乐云等,高效液相色谱法对猪肝脏中四环素类药物残留量的检测[J] 动物医学进展,2006,27(1)&81 83[7] H a m scher G,Sczesny S,H op erH et a l ,Deter m i nati on of PersistentT etracycli n eResidu es i n So ilFertili zed w it h L i qu i d M anu re byH i ghp erf or m ance L i qu i d C hro m atography w it h E lectros p ray Ion i zation Tande m M ass Spectrom etry[J] A na l y tic a l Ch e m istry,2002,74& 1509 1518[8] 胡冠九,王冰,孙成,高效液相色谱法测定环境水样中5种四环素类抗生素残留[J] 环境化学,2007,26(1)&1 24期孙刚等:固相萃取高效液相色谱法测定畜禽粪便中的土霉素、金霉素和四环素743DETER M INATI ON OF OXYTETRACYCL INE,TETRACYCLINE AND CHLORTETRACYCL INE IN M ANUREBY S PE HPLC M ETHODSU N Gang1,2 YUAN Shou jun1 PE NG Shu chuan2 C HEN F eng qin3 H U Zhen hu1,4(1 S chool ofC i vil Engi n eeri ng,H efeiUn i vers i ty of Techno l ogy,H efe,i230009,Ch i n a;2 S chool of Res ou rces and Environm en tal Eng i neeri ng,H ef e,i230009,Ch i na;3 Experi m entalAn i m al Cen ter,Anhu iM ed icalUn i versity,H efe,i230032,Ch i n a,4 Depart m ent ofC i vil Engineeri ng,Nati onalU nivers it y of Irel and G al w ay,Irel and)ABSTRACTIn this study,a SPE H PLC m et h od w as deve l o ped to analyze oxytetracycline(OTC),tetracycli n e(TC) and ch l o rotetracyc li n e(CTC)i n m anure M anure w as first extracted w ith EDTA M cllvai n e buffer and then the ex traction w as enriched by LC 18SPE co l u m n for tetracycli n es The results sho w ed that the recoveries ofOTC, TC and CTC in m anure w ere bet w een51 3% 93 7% W ith a m obile phase o f0 01m o l l-1oxa lic acid, acetonitrile and m ethano l(V/V/V=76/16/8,p H=2 5)at w avelength355nm,t h e three tetracycli n esw ere co m p l e tely separated and the lo w est detected li m it o f OTC,TC and CTC were0 029m g kg-1,0 055 m g kg-1and0 073m g kg-1,respectively This m ethod w as furt h er app lied to the analysis ofm anures co l lected fro m an i m a l far m s i n A nhui province.OTC,TC and CTC were detected i n all hen m anure,p i g m anure and i n so m e o f the co w m anureK eyw ords:oxyte tracycline,tetracycline,chlortetracyc li n e,m anure,SPE HPLC.。

四环素类药物检测(高效液相色谱法).

仪器和设备
1．液相色谱串联四级杆质谱仪或相当者，喷电雾离子源。
2．高效液相色谱仪：配二极管阵列检测器或紫外检测器。
3．分析天平：感量0.1mg，0.01g。 4．漩涡混合器。 5. 低温离心机：最高转速5000r/min，控温范围为-40℃至室温。
仪器和设备
6．吹氮浓缩仪。 7. 固相萃取真空装置。 8. pH计：测量精度±0.02。 9. 组织捣碎机。 10. 超声提取仪。
原理
试样中四环素族抗生素残留用0.1mol/LNa2EDTA-Mcllvaine缓冲液（pH-4.0±0.05）提取，经过滤和离心后，上清液用HLB固相萃取柱净化，高效液相色谱仪或液相色谱喷雾质谱仪测定，外标峰面积法定量。
试剂和材料
除另有说明外，所用试剂均为分析纯，水为GB/T 6682规定的一级水。 1. 甲醇：高效液相色谱纯。
2. 乙腈：高效液相色谱纯。
3. 乙酸乙酯。 4. 乙二胺四乙酸二钠（Na2EDTA·2H2O）。 5. 三氟乙酸。 6. 柠檬酸（C5H8O7·H2O）。
试剂和材料
7. 磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O）
8. 柠檬酸溶液：0.1mol/L。称取21.01g柠檬酸用水溶解，定容至1000ml。
样品制备与贮存
制样过程中应防止样品受到污染或残留物含量发生变化。 1. 动物肌肉、肝脏、肾脏和水产品从所取全部样品中取出约500g，用组织捣碎机充分捣碎均匀，装入洁净容器中，密封，并标明标记，于-18℃以下冷冻存放。
2. 牛奶样品
从所取全部样品中取出约500g，充分混匀，装入洁净容器中，密封，并标明标记，于-18℃以下冷冻存放。
四环素类药物检测方法
高效液相色谱法
兽药残留检测

高效液相色谱法同时测定猪、鸡肉中四环素和金霉素残留

农技服务2018,35(3) :94〜96产业技术高效液相色谱法同时测定猪、鸡肉中四环素和金霉素残留田雪莲，兰承兴，周开拓，李雪林，甘大勇(贵州省福泉市农村工作局，贵州福泉550500)[摘要]为仅有二通道高效液相色谱的质检站检测猪、鸡可食性组织中四环素、金霉素残留提供参考，以《农业部958号公告-2-2007猪鸡可食性组织中四环素类残留检测方法高效液相色谱法》为蓝本，样品采用 McllvaintNa2EDTA缓冲液进行提取，三氯乙酸沉淀样品中的蛋白质，流动相为0.01摩尔/升草酸溶液-乙腈-甲醇溶液进行梯度洗脱，探索同时测定猪、鸡可食性组织中四环素、金霉素残留量的方法。

结果表明：四环素、金霉素在0.1〜2.5微克/毫升范围内线性良好，?*>0. 99,检出限均为20微克/毫升，不同添加水平的加标回收率为71.6%〜94.4%，相对标准偏差（RSD)为1.38%〜8. 32%。

该方法灵敏度高、重复性好，适用于猪、鸡可食性组织中采用二通道高效液相色谱检测四环素、金霉素的残留。

[关键词]四环素；金霉素；高效液相色谱；残留四环素类抗生素（Tetracycline antibiotics，TCs)作为一种革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌都敏感的广谱抗生素，已被广泛应用于可食性动物疾病的治疗和药物添加剂中，常见的TCs包括四环素、金霉素、土霉素、强力霉素，其中，土霉索、金霉素和四环素是我国应用最广、应用时间最长的动物保健性抗生素^3]。

已有研究表明，长期食用含有抗生素的食品会对人的健康造成极大危害，主要损害胃、肠、肝脏等器官，干扰正常生理机能，更严重的是导致耐药性致病菌的产生和扩散，对人类公共健康造成威胁[1<。

近年来，随着畜禽养殖规模不断扩大，滥用抗生素的情况时有发生，其残留问题已引起人们高度关注，因此，掌握猪、鸡可食性组织中四环素类药物残留的检测对发展畜牧业，保障食品安全至关重要。

动物肉中土霉素、四环素、金霉素残留量测定方法的探讨

212 准确度与精密度试验各取同一肉样 7 份 ,分别添加混合标准溶液 ,进行回收率及精密度试验 ,结果见表 1 。
表 1 回收率及精密度试验
标准加入量
抗生素
(μg)
平均回收率 ( %)
RSD ( %)
土霉素
10
85. 2
4. 3
40
87. 1
3. 8
100
90. 3
4. 5
四环素
10
86. 6
730
中国卫生检验杂志 2001 年 12 月第 11 卷第 6 期 Chinese Journal of Health Laboratory Technology 20011December1111No16
【方法探讨】
〔文章编号〕1004 —8685 (2001) 06 —0730 —02
动物肉中土霉素、四环素、金霉素残留量测定方法的探讨
中国卫生检验杂志 2001 年 12 月第 11 卷第 6 期 Chinese Journal of Health Laboratory Technology 20011December1111No16
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10. 5 %降低到 3. 7 % ,从而提高了方法的精密度。其原因是四环素类抗生素分子中含有酚羟基和烯醇基 ,易于二价金属结合 ,因而造成重现性差 ,流动相中加入适量的 EDTA 二钠可以改善这种现象。 3 小结
表 1 不同方法处理标本后检测 HBsAg 的结果
标本处理
室温自然凝固凝固后作 3000rpm5’离心
阳性数阴性数合计
106 1375 1481 73 1408 1481
阳性率 %
7. 16 % 4. 93 %

高效液相色谱法测定鸭肉中土霉素、四环素、金霉素及强力霉素残留量的研究

分析检测高效液相色谱法测定鸭肉中土霉素、四环素、金霉素及强力霉素残留量的研究闲少玲（肇庆市食品检验所，广东肇庆 526000）摘　要：本文采用高效液相色谱法，检测鸭肉中土霉素、四环素、金霉素和强力霉素残留量，选用Shim-pack GIST C18色谱柱，样品经过Mcllvaine缓冲溶液（pH=3.5）提取，HLB固相萃取柱净化，流动相梯度洗脱，检测波长为365 nm，采用外标法定量。

结果表明4种抗生素的线性关系良好，加标回收率为83.2%～97.5%。

证实了高效液相色谱法应用优势，能够满足土霉素、四环素、金霉素及强力霉素残留量检测要求。

关键词：高效液相色谱法；鸭肉；霉素残留Determination of Oxytetracycline, Tetracycline, Chlortetracycline and Doxycycline Residues in Duck Meat by High Performance Liquid ChromatographyXIAN Shaoling(Zhaoqing Food Inspection Institute, Zhaoqing 526000, China)Abstract: High performance liquid chromatography was used to detect the residues of oxytetracycline, tetracycline, chlortetracycline and doxycycline in duck meat. Shim-pack GIST C18 chromatography was used. The samples were extracted with Mcllvaine buﬀer solution (pH=3.5), HLB Solid-phase extraction column purification, mobile phase gradient elution, detection wavelength of 365 nm, using external standard method for quantification. The results showed that the linear relationship of the four antibiotics was good, and the spiked recoveries ranged from 83.2% to 97.5%. The application advantages of high performance liquid chromatography are confirmed, and it can meet the detection requirements of oxytetracycline, tetracycline, chlortetracycline and doxycycline residues.Keywords: high performance liquid chromatography; duck meat; penicomycin residue四环素类抗生素是一种由放线菌产生的广谱性抗生素，有良好的杀菌抑菌作用[1]。

可食动物肌肉中土霉素、四环素、金霉素、强力霉素残留的测定液相色谱-紫外检测法

作业指导书O P E R A T I N G I N S T R U C T I O N S可食动物肌肉中土霉素、四环素、金霉素、强力霉素残留量的测定液相色谱-紫外检测法编号：XZJY077-00-2019版本：第一版第0次修改编制：审核：批准：实施日期：2019.01.01一、编制目的为规范可食动物肌肉中土霉素、四环素、金霉素、强力霉素残留量的检验方法，编制本指导书。

二、适用范围本指导书适用于可食动物肌肉中土霉素、四环素、金霉素、强力霉素残留量的测定。

三、编制依据GB/T 20764-2006《可食动物肌肉中土霉素、四环素、金霉素、强力霉素残留量的测定液相色谱-紫外检测法》四、实验原理用0.1mol/L Na2EDTA-Mcllvaine（pH-4.0±0.05）缓冲液提取可食动物肌肉中四环素族抗生素残留，提取液离心后，上清液用Oasis HLB或相当的固相萃取柱和羧酸型离子交换柱净化，液相色谱-紫外检测器测定，外标法定量。

五、试剂和材料除另有规定外,所用试剂均为分析纯,水为 GB/T6682规定的一级水。

5.1 试剂5.1.1 甲醇：高效液相色谱纯。

5.1.2 乙腈：高效液相色谱纯。

5.1.3 乙酸乙酯：色谱纯。

5.1.4 乙二胺四乙酸二钠（Na2EDTA·2H2O）。

5.1.5 草酸。

5.1.6 柠檬酸（C5H8O7˙2H2O）。

5.1.7 碳酸氢二钠（Na2HPO4˙12H2O）。

5.2 试剂配制5.2.1 柠檬酸溶液：0.1mol/L。

称取21.01g柠檬酸，用水溶解，定容至1000ml。

5.2.2 碳酸氢二钠溶液：0.2mol/L。

称取28.41g碳酸氢二钠，用水溶解，定容至1000ml。

5.2.3 Mcllvaine缓冲液：将1000ml 0.1mol/L柠檬酸溶液与625ml 0.2mol/L碳酸氢二钠溶液混合，必要时用氢氧化钠或盐酸调节pH=4.0±0.05。

液相色谱仪检测土霉素、四环素、金霉素

应对中华人民共和国国务院令第609号《饲料和饲料添加剂管理条例》液相色谱仪检测举例用LC-5500液相色谱仪检测土霉素、四环素、金霉素1.1.1仪器LC5500高效液相色谱仪；溶剂过滤器；回旋振荡器；离心机。

1.1仪器条件检测器：紫外可见检测器；检测波长：355nm；色谱柱：C18柱 4.6mm*250mm；流动相：乙腈＋0.01mol/L磷酸二氢钠溶液（用30％硝酸调节pH值为2.5）=25＋75；流速：1mL/min；柱温：室温；进样量：20μL。

根据GB/T5009.116-2003畜、禽肉中土霉素、四环素、金霉素残留量的测定（高效液相色谱法）的要求，色谱柱应为ODS-C18（5μm）6.2mm*150mm，流动相乙腈＋0.01mol/L磷酸二氢钠溶液（用30％硝酸调节pH值为2.5）＝35＋65，由于我们试验所用色谱柱为4.6mm*250mm，所以经过试验得出最好用乙腈＋0.01mol/L磷酸二氢钠溶液（用30％硝酸调节pH值为2.5）＝25＋75的流动相，这样既可以在较短的时间内完成一次检测，又可以得到很好的分离，如图1所示。

图1混合标样色谱图高效液相色谱法检测饲料中的氨基酸1.1仪器及试剂1.1.1试剂及试剂的配制1.1.1.1乙腈（色谱纯）；1.1.1.2水（超纯水）；1.1.1.3醋酸钠（分析纯）；1.1.1.4冰乙酸（分析纯）；1.1.1.5叠氮化钠（分析纯）；1.1.1.6N，N-二甲基甲酰胺（分析纯）；1.1.1.7碳酸氢钠（优级纯）；1.1.1.8磷酸二氢钾（优级纯）；1.1.1.9氢氧化钠（优级纯）；1.1.1.10色氨酸标样（中国标准物质中心）；1.1.1.1117种氨基酸混合标样（中国标准物质中心，混合标样中17种氨基酸的浓度见表一）；表一十七种氨基酸标样中各氨基酸浓度中文名称简称分子量浓度（μmol/mL）浓度（mg/100mL）天冬氨酸Asp133.1226.62谷氨酸Glu147.1229.42丝氨酸Ser105.1221.02精氨酸Arg174.2234.84甘氨酸Gly75.1215.01苏氨酸Thr119.1223.82脯氨酸Pro115.1446.05丙氨酸Ala89.1217.82缬氨酸Val117.1223.44蛋氨酸Met149.2229.84半胱氨酸Cys121.2224.24异亮氨酸Ile131.2226.24亮氨酸Leu131.2226.24苯丙氨酸Phe165.2233.04组氨酸His155.2231.04赖氨酸Lys146.2229.24酪氨酸Tyr181.2236.241.1.1.12饲料参比（中国标准物质中心，饲料参比的百分含量见表二）；表二饲料参比的百分含量序号中文名称简称百分含量（%）1天冬氨酸Asp 1.562谷氨酸Glu 3.243丝氨酸Ser0.944精氨酸Arg 1.255甘氨酸Gly 1.286苏氨酸Thr0.747脯氨酸Pro 1.408丙氨酸Ala 1.189缬氨酸Val0.9210蛋氨酸Met0.5411半胱氨酸Cys0.3412异亮氨酸Ile0.7613亮氨酸Leu 1.6814苯丙氨酸Phe 1.0015组氨酸His0.5016赖氨酸Lys 1.0817酪氨酸Tyr0.65合计19.061.1.1.13色氨酸标样配制：称取适量色氨酸标准品，用氢氧化钠溶液溶解配制成浓度为2μmol/mL溶液，即20.42mg/100mL；1.1.1.146mol/L盐酸配制：用浓盐酸和水1：1配置即可；1.1.1.155mol/L氢氧化钠的配制：称取200g氢氧化钠配成1L水溶液；1.1.1.160.1mol/L氢氧化钠溶液：称取0.4g氢氧化钠配成100mL水溶液；1.1.1.17衍生缓冲液：4%碳酸氢钠水溶液；1.1.1.18衍生试剂：适量衍生试剂用乙腈定容为100mL；1.1.1.19平衡缓冲液：0.68%磷酸二氢钾水溶液。