临床分子生物学检验总

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四个阶段:

一、以导致遗传病的基因突变位点为靶标,以DNA分子杂交为核心

二、以PCF技术为核心

三、以生物芯片为核心

四、以DN做H序技术为核心

广义:分子标志物包括基因组DNA各种RNA蛋白质和各种代谢物

临床分子生物学检验靶标主要以核酸(DNA和RNA为主

基因组DNA是临床分子生物学检验中最常用的分子靶标

病原生物基因1.菌种鉴定:PCR测寸序和PCR-DNA^针杂交;缩短检测时间

2. 确定病毒感染和病毒载量:明确感染源,判断病情,监测疗效

3. 病毒分析:基因型变异产生不同临床症状

4. 细菌耐药监测和分子流行病学调查:随机扩增多态性DNA指导选择

治疗方案,控制病原菌的感染传播

基因变异 1 .致病基因的分子缺陷 2. 线粒体基因突 3. 肿瘤相关基因

单基因病 1. 致病基因结构发生了改变,影响了编码产物量和质的改变,如血红蛋白

病、血友病、Duchenne 肌营养不良等。

2. 致病基因中核苷酸三联体重复序列发生高度扩展,如脆性X综合征、亨廷顿

病、强直性肌营养不良等。

基因多态性用于: 1.基因定位和疾病相关性分析 2.疾病诊断和遗传咨询 3.多基因病的研究 4. 器官移植配型和个体识别

循环游离核酸检测(包括游离DNA和游离RNA用于:产前诊断、恶性肿瘤早期诊断、病例检测

临床分子生物学检验技术以分子杂交技术、PCR技术和DNA测序技术、芯片技术、双向电泳技术、生物信息学技术为主要技术

分子生物学检验技术可用于微生物感染的确诊、感染性病原体的分型、耐药监测。分子生物学检验技术有利于临床上对遗传性疾病的早期预防、早期诊断、早期治疗。重要国际生物信息中心:1.美国国立生物技术信息中心(NCBI) 2.欧洲生物信息学研究所(EBI) 3.日本国立遗传研究所(DDBJ

一级核酸数据库有GenBank EMBI和DDBJ

蛋白质序列数据库有SWISS-PRO T PIR、UNIPRO等。蛋白质X射线晶体三维结构数据库有PDB等。

蛋白质数据库常用的有SWISS-PRO、T PIR 、PDB 数据库

二级数据库非常多,如人类基因组图谱库GDB转录因子和结合位点库TRANSFAC蛋

白质结构家族库SCOP等o

**乙型肝炎病毒核酸的检测常用技术: 1.普通PCF技术2.荧光定量PCF技术3.支链

DNA技术4.核酸杂交技术5.杂交捕获系统6.基因芯片技术

**HBV 基因分型的方法:1,PCR-RFLP 2.PCR-RBD 3.ELISA 4. 基因芯片

人乳头瘤病毒基因组结构:HPV DNA为一双链闭环分子,基因组可分三个区段:早

期区(E)、晚期区(L)、长控制区或上游调节区或非编码区。

***HPV DNA检测及基因分型:

1. 核酸杂交技术(主要包括核酸印迹、原位杂交、杂交捕获等技术。目前常采用HCII

技术、核酸分子杂交与PC財目结合的方法。具有较强的特异性,并可分型)

2. PCR技术**

(采用型特异性引物进行HPV快速分型,现已成为HPV感染最常用的检测方法之一。目前常用通用引物-PCR( GP-PCR和实时定量PCR 1. GP-PCR,依据不同HPV亚型有共同保守序列的特点来设计通用引物,可广谱扩增HPV DNA具有较高的敏感性,可检

测出10-400拷贝的HPV病毒含量。在GP-PCR勺基础上,建立了巢式PCR和巢式多重PCR 佥测HPVDNA提高了检测敏感性和多重感染率。 2.实时定量PCR法,该法可实现

HPV DNA定量和快速检测。现在市售产品可以检测E6和E7的mRN;进行HPV16

18、31、33与45 分型。检测灵敏度高,但设备昂贵,操作繁琐,不适于宫颈癌的大规模筛查。)

3. 基因芯片技术(基因芯片可对HPV进行分型和多重感染诊断,适于高通量HPV筛

查) 4. 流式荧光液芯技术

5. 飞行时间质谱技术

临床意义:(一)宫颈疾病风险预测(二)疗效评估及术后跟踪(三)预防控制和疫苗研发

**HIV-1基因组中,gag、pol、env为结构基因,编码病毒核心蛋白(gag)、多聚酶(pol)、和外膜蛋白(env)o vpr、rev 、vif 、tat 、vpu/vpx、nef 等 6 个基因为调控基因,编码调控蛋白和辅助蛋白。

核酸序列依赖扩增(NASBA是一种等温扩增RNA勺技术,能直接扩增单链RNA特异序列,通过合成cDNA在等温条件下进行体外序列特异性核酸扩增。

NASBA需要AMV逆转录酶、核糖核酸酶H、噬菌体T7RNA聚合酶共同作用完成。NASBA 分非循环相(模板RNA与引物I互补)和循环相(转录的反义RNA与引物I互补)两个阶段

流行性感冒病毒核酸检测:主要有RT-PCR实时荧光定量RT-PCR基因芯片、逆转录

-环介导等温扩增(RT-LAMP等。

结核分枝杆菌核酸的检测: 1.PCF 2.Feal-time PCF 3. PCF-FFLP 4. 线性探针杂交法(LPA)5. 链替代扩增技术(SDA)6. 扩增结核分枝杆菌直接试验(AMTDT 7. 基因芯片技术

8.GeneXpert 全自动结合检测平台

结核分枝杆菌的耐药性检测:(1)DNA S序(2)PCR-SSCP (3)PCR-RFLP (4)PCR-RDB (5)基因芯片技术

淋病奈瑟菌核酸的检测: 1.PCR 2. 实时荧光定量PCR 技术 3. 连接酶链反应 4. 连替代扩增技术(SDA)

淋病奈瑟菌的主要耐药基因:(1)gyrA和parC基因(2)pen A、ponA基因(3)porB 基因(4)Mtr 系统调控基因(5)erm 基因

淋病奈瑟菌耐药检测的分子生物学技术:(1)DNA测序(2)PCR-SSCP( 3)PCR-

RFLP (4)基因芯片技术

*医院细菌感染的常用分子生物学检验技术:1.脉冲场凝胶电泳(PFGE被认为是菌

株分子分型的“金标准” 2. PCR-RFLP 3. 扩增限制性片段长度多态性分析(AFLP)

4. 重复序列PCR

5.随机扩增多态性DNA技术

6.多位点测序分型

白假丝酵母菌的分子生物学检验: 1.PCR普通PCR实时PCR巢式PCR和多重PCR

等2. PCR-斑点杂交 3. DNA 指纹技术,包括RFLR随即扩增多态性分析

(RADP)、电泳核型分析等4. AP-PCR 5.DNA 序列分析 6. 基因芯片技术

新型隐球菌的分子生物学检验: 1.PCR 2. 斑点杂交 3. PCR-RFLP

沙眼衣原体的分子生物学检验: 1.PCR 2. 连接酶链反应 3. DNA 序列分析

肺炎衣原体的分子生物学检验:PCR实时荧光定量PCR技术、巢式PCR和竞争性PCR

肺炎支原体的分子生物学检验: 1.P CR 2.核酸杂交,探针有特异性DNA片段探针、

人工合成的寡核苷酸探针、全DNA探针。常用斑点杂交。3. PCR-RFLP

梅毒螺旋体的分子生物学检验: 1.PCR 2. 核酸杂交 3. PCR-RFLP 分子生物学检验可早期诊断患者的梅毒感染,及时治疗,防止病情恶化与蔓延。另外是耐药基因分析和流行病学研究的首选方法。

弓形虫DNA主要有三种形式:染色体DNA线粒体DNA和胞质DNA

利用分子生物学技术已检出弓形虫的主要基因有B1基因、P22基因(SAG2、P30基

因(SAG1、P43(SAG3和棒状体蛋白1(ROP1等。

分生检测:1.PCR主要侧重检测B1基因和P30基因。2.斑点杂交

a珠蛋白合成障碍性贫血的分子生物学检验 1.PCR 2.Southern 印迹杂交3.AS-PCR

4. SSCP

5.gap-PCR

卩珠蛋白生成障碍性贫血的分子生物学检验:PCR-RDB PCR-RFLP基因芯片、PCR-ASO、AS-PCR

血友病 B 的分子生物学检验:

直接检测法有Southern印迹杂交、DNA M序、基因芯片和毛细管电泳;间接检测方法有RFLP SSCP变性梯度凝胶电泳(DGGE)、双脱氧指纹图谱、变性高效液相色谱(DHPLC)。

脆性X综合征的分子生物学检验:

(一)Southern 印迹杂交(二)PCR (三)微卫星序列分析

通过分子诊断FMR-1基因突变开展患者判定、携带者筛查、产前诊断和群体筛查等。

肿瘤相关的基因:原癌基因、抑癌基因、细胞周期调节基因、细胞凋亡基因以及维持细胞基因组稳定性基因等。

细胞周期调节基因:周期蛋白(cyclins )、周期蛋白依赖性激酶(CDKS、CDK抑制因子(CKIs)及细胞周期检查点等其他蛋白

细胞凋亡相关基因可分三类:促细胞凋亡基因、抑制细胞凋亡基因、细胞凋亡过程中表达的基

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