产顺式-4-羟脯氨酸枯草芽孢杆菌工程菌的构建及发酵优化

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产辅酶Q_(10)菌株选育及发酵过程优化研究

产辅酶Q_(10)菌株选育及发酵过程优化研究辅酶Q10(CoQ10)作为细胞有氧呼吸链中的一个重要递氢体,广泛应用于医药和食品行业。

近年来,CoQ1o作为一种辅助药物,在治疗心脏衰竭方面,使用比例逐年增加,因此对CoQ1o的需求也不断增长。

对产CoQ1o微生物的开发利用也愈发重要。

本文以类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)为出发菌,研究了该菌的诱变选育、培养基优化和补料分批发酵工艺。

1.对比皂化法、超声波破碎法、反复冻融法、酸热法和酸热辅助超声法对CoQ1o提取效果的影响,确定了酸热辅助超声破胞方法的可行性。

并通过单因素实验、正交法实验确定其最佳提取工艺条件。

酸热辅助超声法提取类球红细菌中CoQ1o最优的提取条件是加入300μL的盐酸、80 ℃、400w超声处理20min。

此时,CoQ1o得率为3.738mg/g。

2.以自然筛选获得的R.spl-11为出发菌株,经过紫外-LiCl、NTG结合VK3、NaN3和PHB 复合抗性诱变,获得一株遗传性状良好的CoQ1o高产菌株,其产量为71.23mg/L,比出发菌株提高了132.17%。

通过单因素实验对R.sp3-7菌株发酵条件进行优化,得到最优条件为：32℃、初始pH为7.0、接种量8%及装液量为40mL/250mL, CoQ10产量为82.70mg/L。

3.对R.sp3-7生产CoQ1o的发酵培养基进行优化,首先通过单因素筛选确定了培养基最佳碳源、氮源和需添加的金属离子。

通过Plackett-Burman设计对培养基中的9种成分进行筛选,获得影响发酵的3个重要成分：葡萄糖、玉米浆干粉和硫酸镁,再采用Box-Behnken响应面试验对上述三种成分进行优化,获得最佳浓度：葡萄糖36.9g/L、玉米浆干粉5.3g/L、MgSO4 14.4g/L。

优化后CoQ1o产量达到135.20mg/L,比优化前提高了68.62%。

4.在5L发酵罐中考察了pH、溶氧(DO)水平对CoQ1o合成的影响,结果发现CoQ1o合成的最适pH为6.8。

饲用枯草芽孢杆菌发酵条件的优化

０１大豆粕１淀粉０３３０％浓度的硫酸锰．％、０％、．％、．８
７５７８８，在接种量５，温度３ ℃ ，转速２０．、．、．０％０２
１材料与方法
１１材．料
供试菌种为枯草芽孢杆菌，由湖南
ｒｎ条件下培养２，定其Ｄ鲫值。３转速对／ｍｉ４ｈ测Ｄ（）
生长量的影响：取１０２０２０２０３０ｒｉ选５、０、２、５、０ｍｎ５／
的优化培养基为：葡萄糖Ｏ５淀粉０３豆粕３磷酸氢二钾０３磷酸二氢钾０１％、．％、．％、％、．％、．５硫酸镁００％、．５酵母膏００％、．２氯化铁０１碳酸钙Ｏ０％、．８．％、０．１３０％硫酸锰０２ｍ。最适发酵条件为：．Ｌ发酵温度３ ℃，Ｏ初始ｐ．～．，Ｈ７０７２摇床转速２０ｒｉ，２ｍｎ接种量１％。／０发酵罐放大培养最佳放罐时间２ — ２ｈ获得的菌体数量约为１８亿／。０２，５ｍＬ
７２基础发酵培养基：．；淀粉０１％、．５葡萄糖０５尿．％、素０１磷酸氢二钾０３磷酸二氢钾０１％、．％、．％、．５硫
酸镁００％、母膏００％、化铁００％、酸钙．５酵．２氯．１碳
养２，４ｈ测定其Ｏ鲫值。（）Ｄ４接种量对生长量的影响：选取接种量１、％、％、％、０、５，％３５７１％１％在３ ℃ ，始ｐ．，速２０ｒａｎ条件培养２，Ｏ初Ｈ７２转２／ｉｒ４ｈ

产木聚糖酶枯草芽孢杆菌构建及表达条件优化

而枯草芽孢杆菌W B 600在木聚糖培养基上同步培养
图 1 基因 .t>7iZF-2 的 P C R 扩增注：M : D L 1 0 0 0 D N A M a r k e r ; 1，2: P C R 扩增得到的叮 n Z F - 2 Figure 1 PCR amplification of^jnZF~2 gene Note: M : D L 1 0 0 0 D N A M a r k e r ; 1,2: x yn Z ¥ ~ 2 amplified b y P C R
238 基因组学与应用生物学
也越来越多，更多的木聚糖酶基因在不同的宿主中
M
1
2
得到表达(陈洪洋等，2016)。
10 000 bp 5 000 bp
枯草芽孢杆菌(B a c 山是一种模式生物， 3 000 bp
2 000 bp
其遗传背景清晰，具有很强的分泌能力，能够高效表 1 500 bp
对重组菌进行筛选和酶活力鉴定，再
图 2 pWB980质粒与 w ^Z F -2基因双酶切注：M : D L 1 0 0 0 0 D N A M a r k e r ; 1: 质粒 p W B 9 8 0 ; 2 : 基因巧TiZF-2 Figure 2 Double digestion o f pWB980 vector and ,r>7iZF-2 gene Note: M: D L10000 DNA Marker; 1: Plasmid pWB980; 2: Gene xynZ¥-2
1.2重组工程菌筛选
接种量为 1 % 时，工程菌酶活力达到最大，接种

部分食品专利介绍

一
申请日：２１．．００５８０１
公开日：２１．００００１．２
申请人：浙江大学本发明公开了一种抗菌肽基因工程菌株的制备方法。本发明首先根据抗菌肽ＣｃｐｅｒｉＡ氨基酸序ｏｎ
申请日：２１．．００３１０８
公开日：２１．．００１００６
专利名称：
申请日：００３５２１．．０２
公开日：２１．．００１００６
乳酸茵生存性提高剂及生存性提高方法。及食
品组合物
申请人：江南大学种耐温树枝状慢消化淀粉的生物合成方法，
一
属于非化学改性淀粉技术领域。本发明利用Ｂ一淀
专利名称：
种抗菌肽基因工程菌株的制备方法
专利申请号：Ｃ２１１１６６．Ｎ０００７１９４
公开号：Ｃ０８４７ＡＮ１１６３２
种混合型食用菌提取液保鲜牛肝菌的方法专利申请号：Ｃ２１１１６２．Ｎ０００２９３３公开号：Ｃ１１５５５Ｎ０８ｌ８Ａ
的方法准确、快捷，适于推广应用。
专利名称：
一
专利申请号：Ｃ２０１０９６．Ｎ０９０４６６５公开号：ＣＯ８１９ＡＮ１１７８３申请日：２０．４１０９．０２
公开日：２１．０７００１．２
种外壳带菌蛋的紫外检测方法及其装置
申请人：日本明治乳业株式会社
本发明涉及提高酸奶中所含益生菌等乳酸菌株粉等，以新型水解一转苷淀粉酶协同修饰重组淀粉的生存性。解决方法为含有丙酸菌发酵物的提高乳分子链，从而获得具有慢消化特性的耐温树枝状淀酸菌的生存性的乳酸菌生存性提高剂。上述丙酸菌粉。本发明得到的耐温树枝状慢消化淀粉可作为功是属于丙酸杆菌（ｒｉｉａｔｉｍ属菌。所述属能性原辅料开发低血糖健康食品、能量缓释食品、Ｐｏｏｂｃｒ）ｐｎｅｕ

【doc】枯草芽孢杆菌发酵培养基优化培养实验

枯草芽孢杆菌发酵培养基优化培养实验枯草芽孢杆菌发酵培养基优化培养实验吴俊罡张秉胜刘吉华秦贵江王梅雪张红霞庚涛(大连翔大生物技术研究中心有限公司)摘要本文从生产实际出发,针对生产用菌种,通过对培养基碳源,氮源等的选择及配比的正交实验,得出最适培养基.关键词:枯草芽孢杆菌芽孢率活菌数培养基前言枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)是我国农业部允许作为饲料添加剂的两种芽孢杆菌之一.其已被越来越多地研制成饲用微生态制剂.因其制剂是无毒,无残留,无污染的"绿色"添加剂,故具有广阔的发展前景,并已在畜牧业,饲料行业广泛应用,显示了巨大的社会效益和生态效益.枯草芽孢杆菌具有很强的蛋白酶,脂肪酶,淀粉酶等活性,能产生抗菌素,在动物肠道内具有较强生物夺氧能力.这些特性对促进动物营养的消化吸收,提高动物的饲料转化率和防病促进生长起到重要作用.现阶段的工业化生产中,常存在着发酵周期长,芽孢形成率低,成本高等问题,对此我们对发酵培养基进行了优化实验,以提高枯草芽孢杆菌的产量并降低生产成本.材料与方法材料菌种枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis),翔大生物技术研究中心有限公司保存.主要试剂牛肉膏,蛋白胨,氯化钠,葡萄糖,淀粉,硫酸锰,葡萄糖等.主要设备P270普通摇床,303AB一3隔水式培养箱,1600倍微生物显微镜,PHS一25G型酸度计,50升高级发酵罐,电热干燥箱等.检测方法活菌计数采用平皿活菌计数法,芽孢率采用芽孢染色后显微镜下计数比较.检测培养基:牛肉膏0.3%,蛋白胨1%,葡萄糖1%,氯化钠0.5%,琼脂2%菌种处理安培管菌种活化:用无菌吸管吸取0.3--0.5毫升无菌水滴入安培管,轻轻震荡使冻干菌体溶解成悬浮状,取0.1--0.2毫升菌悬液涂于上肉汤培养基平皿上,37℃培养36小时.菌种筛选:挑取少许活化后菌落划线于促芽孢形成培养基(土壤浸出液1000毫升,牛肉膏6可克, 蛋白胨5克,琼脂20克,pH7.0～7.2)平皿上,37℃培养20小时左右取出,选大菌落挑到装有4.5毫升无菌水的试管中,震荡均匀后置120oC干燥箱中加热20分钟,再涂布于促芽孢形成培养基的平皿上培养,反复多次.最后选取平皿上的大菌落转接到促芽孢培养基的试管斜面上,37℃培养箱培养l3～15 小时拿出放入4~C冰箱保存备用.筛选前后种子作对比:从冰箱中拿出筛选前后的种子斜面各1支,分别接入装有肉汤培养基的三角瓶中,在37℃,每分钟195转的摇床上振动培养,每3小时涂片观察一次,培养36小时记录活菌数和芽孢率. 此过程重复3次.培养基选择首先选择四种不同培养基进行摇瓶培养比较,观察菌数和芽孢形成情况.培养基的配制:①号培养基:淀粉0.15%+葡萄糖0.5%+尿素0.1%+磷酸氢二钾0.3%+磷酸二氢钾0.15%+硫酸镁0.05%+酵母膏0.02%+氯化铁0.01%+碳酸钙0.01%+大豆粕1%;②号培养基:淀粉0.15%+葡萄糖0.5%+尿素0.1%+磷酸氢二钾0.3%+磷酸二氢钾0.15%+硫酸镁0.05%+酵母膏0.02%+氯化铁0.01%国外畜牧学——猪与禽第23卷第3期2003年5月?31'+碳酸钙0.01%+大豆粕1%+淀粉0.3%+3.08%浓度的硫酸锰溶液0.1%.③号培养基:牛肉膏0.3%+蛋白胨1%+葡萄糖1%+氯化钠0.5%;④号培养基:牛肉膏0.3%+蛋白胨1%+葡萄糖1%+氯化钠0.5%+淀粉0.3%+3.08%浓度的硫酸锰溶液0.1%;以上所有各种培养基的pH均调为7.0～7.2.以上每种培基各做三瓶,装液量100毫升/500毫升三角瓶,用四层纱布和牛皮纸包扎置立式压力蒸汽消毒器中于121℃灭菌20分钟,取出备用.摇瓶种子制备:将在冰箱保存的种子在无菌室内接入肉汤培养基中,在37℃,每分钟195转的摇床上振荡培养12小时.接种和培养:培养好的种子液以10%接种量分别接入四种不同培养基中37℃振荡培养,每隔12小时检测一次,36小时结束培养.此过程重复3 次.正交实验:我们将上述摇瓶结果相对较好的②号培养基作为基本培养基,设计了四个因素,三个水平的正交实验,以进一步优化培养基配比(培养36 小时测活菌数).正交实验设计见表1(所用培养基中其它营养成分不变).表1正交实验设计简表发酵罐实验以摇床正交实验得出的最佳培养基进行50升发酵罐培养,并与肉汤培养基进行对比.发酵罐培养的有关条件如下:定容30升,加消泡剂3‰,用NaOH溶液调pH值到7.5～8.0(注:因为灭菌后pH约下降0.5～1.0),培养121'112灭菌20分钟,培养温度37'112,搅拌转速200转/分钟,起始气流量比1:0.5.当芽孢率达到80%以上时,发酵结束.此实验重复两次.结果和讨论菌种处理结果从菌种优化的三次结果看:经优化后在相同的培养时间内(36小时)芽孢形成率由原先的约38% 提高到约96%,活菌数也由17.7亿/毫升提高到28.6亿/毫升.菌种处理结果见图1.处理前芽孢形成率(%)菌种处理结果处理后臼活菌数(亿/毫升)摇床实验的结果摇床实验所确定的四种培养配方依据是:①号培养基为普遍应用于培养细菌的培养基配方,③号培养基为经验配方,②号和④号培养基配方是在①,③号培养基的基础上分别添加0.3%的淀粉和添加30.8ppm浓度的硫酸锰而成.通过本试验证明锰离子,淀粉对芽孢形成有促进作用.②号培养基配比要明显优于其它三种培养基配比,培养到36小时芽孢率可达到95%以上,活菌数可达到27亿/毫升,故我们选择②号培养基作为基本培养基进行正交实验.摇床实验的结果见表2.表2摇床实验的结果培养基和检测项目培养时间(小时)122436培养基①芽孢率(%)活菌数(亿魔升)培养基②芽孢率(%)活菌数(亿魔升)培养基③芽孢率(%)活菌数(亿魔升)培养基④芽孢率(%)活菌数(亿魔升)个别芽孢约40约8026.2518.615.4个别芽孢约50约10027.1528.4526.2个别芽孢约50约8015.7519.112.25个别芽孢个别芽孢约2514.3619.2511.75正交实验结果表3显示了正交实验的结果.由表可见,影响因素为:MnSO4>豆粕>淀粉>葡萄糖;适宜条件为:葡萄糖1.5%,淀粉0.2%,豆粕3%,Mn-SO40.1%,磷酸氢二钾0.3%,磷酸二氢钾0.15%,.32.国外畜牧学——猪与禽第23卷第3期2003年5月∞∞∞∞加0目硫酸镁0.05%,酵母膏0.02%,氯化铁0.01%,碳酸钙0.01%.表3正交实验的结果发酵罐实验结果以摇床正交实验得出的最佳培养基进行50升发酵罐培养,与肉汤培养基培养的两次比较实验,结果基本稳定.采用优化培养基的培养结果比肉汤培养基有很大提高,主要体现在:①发酵周期缩短了24～26小时,在发酵生产中降低了能耗,且可提高年产量;②最终活菌数提高了约54.7%.芽孢形成比率高,菌体死亡率较优化前低24.7%.图2显示了两种培养基两次培养结果的对比.结论适合该菌株发酵的培养基配比为:葡萄糖1.5%,淀粉0.2%,豆粕3%,MnS040.1%,磷酸氢二钾0.3%,磷酸二氢钾0.15%,硫酸镁0.05%,酵母膏0.02%,氯化铁0.01%,碳酸钙0.01%.(参考文献7篇略)一◆l:了||I::||l:||.一-.一一./'一■——一一'———◆..-,一t一▲v..一.一二'.一一一.～.?:::!::,6l014182226303438424648培养时间,时)注:芽孢率1,活茵数1,芽孢率2,活茵数2代表两次肉汤培养基配方发酵培养结果;芽孢率3,活茵数3,芽孢率4,活茵数4代表优化的培养基配方发酵培养结果.图2两种培养基培养结果的对比代邮:257000鲁东营IZl区河滨路东营力大王农畜产公司于勇510000广州天河广汕路高唐科技产业园廖益平我们已将你们买的书寄出,但被邮局退回了,原因是"原写地址不详",希望你们见此通知后速与《国外畜牧学——猪与禽》编辑部联系.谢谢!国外畜牧学——猪与禽第23卷第3期2003年5月?33?∞舳∞∞∞∞加m0晕。

PHA生产菌株的选育及其混合发酵条件的优化

PHA生产菌株的选育及其混合发酵条件的优化摘要：PHA（Polyhydroxyalkanoates）是一种天然合成的生物塑料，具有可生物降解性和可降解性的特点，对于解决塑料污染问题具有重要意义。

本文研究，以提高PHA产量和降低生产成本。

1. 引言塑料污染已成为全球环境问题的焦点之一。

作为可生物降解的新型塑料，PHA被广泛认为是替代传统塑料的理想选择。

PHA 的生产主要依赖于微生物，因此针对研究和优化PHA生产菌株的选育和混合发酵条件具有重要意义。

2. PHA生产菌株的选育2.1 菌株筛选通过对不同环境样品的采集与筛选，可获得具有PHA生产潜力的菌株。

评价指标主要包括PHA累积量以及菌株的生长速度和生物量。

经过多次筛选，可筛选出优良的具有高PHA产量的菌株。

2.2 菌株鉴定通过分子生物学和生理生化方法，对菌株进行鉴定。

通过16S rDNA的测序和系统发育树的构建，确定菌株的亲缘关系和分类位置。

2.3 菌株改良通过遗传工程或育种方法，改良菌株的PHB合酶基因和相关代谢途径，以提高菌株对底物的利用率和PHA的积累效率。

通过菌株的突变和选择，获得具有较高PHA产量的菌株。

3. 混合发酵条件的优化混合发酵是指利用多种菌株进行PHA的生产，其中不同菌株完成不同代谢途径，以提高PHA的产量和质量。

混合发酵条件的优化对于改善PHA生产效率至关重要。

3.1 菌株的选择和比例混合发酵中选择的菌株应具备互补代谢途径和相对稳定的协同关系。

根据各菌株的PHA合成能力和相对比例，确定各菌株的输入量和协同发酵比例。

3.2 底物浓度和发酵条件菌株对底物的利用效率与底物浓度和发酵条件密切相关。

通过优化底物浓度、发酵温度、初始pH值等条件，提高PHA的生产效率。

3.3 混合发酵的改良通过改变菌株的比例和发酵条件，优化混合发酵过程中PHA产量的分布和规模。

通过调节保持菌株数量平衡、提高PHA产量和提高菌体质量，进而提高PHA生产效率。

酿酒酵母工程菌株的构建与发酵优化措施

酿酒酵母工程菌株的构建与发酵优化措施摘要：啤酒酵母是一种与人类生活息息相关的微生物，也被称为“发酵酵母”或“发酵酵母”。

它是一种重要的啤酒发酵菌种；它是葡萄酒质量的灵魂，对葡萄酒的色泽、香味和口感有很大的影响。

酿酒酵母是一种安全、快速繁殖和快速代谢的酵母菌；它的生产过程可以很好地控制，并且可以很方便地进行大规模的培养，而且它的来源非常广泛，可以被广泛地应用到酿造、医药、饲料工业等多个领域。

通过对发酵培养条件进行优化，可以让酵母细胞密度得到提升，从而可以提升生产效率，降低生产成本。

这为以后的大规模培养，使它能够更好地发挥出它在食品发酵工业中的作用，提供了理论依据，奠定了实践基础。

关键词：酿酒酵母；酵母工程；菌株构建；发酵优化引言酿酒酵母由于其生长速度快，对糖的转化效率高，因此，它是发酵生产燃料乙醇的最重要的微生物。

然而，由于酿酒酵母对高浓度酒精十分敏感，其在工业发酵系统中的酒精浓度一般在14%以下，导致了其高浓度酒精的生产成本，从而限制了其商业化应用。

在此基础上，本项目拟通过对前期对酿酒酵母乙醇耐受性、高温耐受性、高渗性等方面的研究，全面解析酿酒酵母不同类型逆境下的耐受性提升技术，为实现高容积率酒精发酵的产业化应用奠定基础。

一、资料和方法（一）菌株从浓香型白酒窖池中筛选出的一株酿酒酵母Y013。

（二）培养基筛选菌种的培养基：5.0克/升、10.0克/升、1.0克/升、0.5克/升（无水）、0克/升琼脂、0.0333克/升的孟加拉国红、0.1克/升的氯霉素、1000毫升的蒸馏水、121度的天然 pH值、20分钟的杀菌。

倾斜式培养基：20.0克/升、10.0克/升、5.0克/升、14.0克/升琼脂、1000毫升蒸馏水、天然 pH值、121℃杀菌20分钟。

发酵培养基：一份高粱粉，和四份水一起蒸煮0.5~1小时，按照淀粉酶的使用说明，将淀粉酶添加到其中，然后进行液化。

在液化之后，再添加一份55~75℃的温水，将其搅拌均匀，在55~75℃下糖化0.5~1小时，用稀碘液测试，不会出现蓝色，用细纱布过滤，对溶液的糖度进行测量，并将其调节为8~10°波美度，自然 pH值,115℃消毒20分钟后才能使用。

产中性蛋白酶工程菌的构建及其发酵条件的初步优化

ＣｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎａｎｄＳｔｕｄｙｏｆＦｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎＣｏｎｄｉｔｉｏｎｓｏｆＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ
ＳｔｒａｉｎｆｏｒＰｒｏｄｕｃｉｎｇＮｅｕｔｒａｌＰｒｏｔｅａｓｅ
１００ｍＬ／５００ｍＬ、摇床转速１８０ｒ／ｍｉｎ、温度３４℃的条件下发酵４８ｈ，发酵液的酶活力可达２４８７．５Ｕ／ｍＬ，比优化前提高
了７８％．
关键词：中性蛋白酶；枯草芽孢杆菌；工程菌；发酵条件中图分类号：Ｑ７８６文献标志码：Ａ文章编号：１６７２ — ６５１０（２０１３）０５０００９ — ０５
摘
要：为构建１株产中性蛋白酶的工程菌株并对其发酵条件进行优化，以中性蛋白酶工业生产菌株枯草芽孢杆菌
ＡＳ１．３９８的基因组为模板，采用ＰＣＲ技术扩增获得中性蛋白酶基因ｐｒ，与高拷贝质粒ｐＷＢ９８０连接并转入蛋白酶缺
●
第２８卷
第５期
天津科技大学学报
ＪｏｕｒｎａｌｏｆＴｉａｎｊｉｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅ＆Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
Ｖｌ０１．２８ ห้องสมุดไป่ตู้ ＮＯ．５Ｏｃｔ．２０１３

一种生产原儿茶酸的大肠杆菌工程菌构建方法及应用[发明专利]

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202010581182.1(22)申请日 2020.06.23(71)申请人厦门大学地址 361000 福建省厦门市思明南路422号(72)发明人袁吉锋　陈玉芬　(74)专利代理机构厦门创象知识产权代理有限公司 35232代理人王凤玲　尤怀成(51)Int.Cl.C12N 15/70(2006.01)C12N 1/21(2006.01)C12P 7/42(2006.01)C12R 1/19(2006.01)(54)发明名称一种生产原儿茶酸的大肠杆菌工程菌构建方法及应用(57)摘要本发明涉及一种生产原儿茶酸的大肠杆菌构建方法及应用，该方法包括：PCR扩增获取PmLAAD、HmaS、HMO、BFD、HFD1、HpaBC、PobA七种基因；构建质粒pET -PmLAAD -HmaS、质粒pCDF -HMO -BFD、质粒pACYC -HpaBC和质粒pACYC -PobA和质粒pRSF -HFD1；将上述部分质粒共同转入大肠杆菌MG1655RARE感受态细胞中，分别得到第一重组大肠杆菌工程菌和第二重组大肠杆菌工程菌。

根据本发明实施例，该方法获得的重组大肠杆菌可使原儿茶酸达最大收率，具有广阔的工业化应用前景。

权利要求书1页说明书6页序列表4页附图3页CN 111647616 A 2020.09.11C N 111647616A1.一种生产原儿茶酸的大肠杆菌工程菌构建方法，其特征在于，包括以下步骤：PCR扩增获取PmLAAD、HmaS、HMO、BFD、HFD1、HpaBC、PobA七种基因，将PmLAAD和HmaS基因双片段、HMO和BFD基因双片段用BsaI酶切，随后分别连接进入经BamHI和XhoI双酶切的表达载体pETDuet -1、pCDFDuet -1，得到质粒pET -PmLAAD -HmaS和质粒pCDF -HMO -BFD；将HFD1酶切后，连接进入表达载体pRSFDuet -1中得到质粒pRSF -HFD1；将HpaBC、PobA基因单片段酶切，分别连接经BamHI和XhoI双酶切的pACYCDuet -1载体，获得质粒pACYC -HpaBC和质粒pACYC -PobA；将质粒pET -PmLAAD -HmaS、质粒pCDF -HMO -BFD、质粒pRSF -HFD1和质粒pACYC -HpaBC共同转入大肠杆菌MG1655 RARE感受态细胞中，得到第一重组大肠杆菌工程菌MG1655-PCA1；将质粒pET -PmLAAD -HmaS、质粒pCDF -HMO -BFD、质粒pRSF -HFD1和质粒pACYC -PobA共同转入大肠杆菌MG1655 RARE感受态细胞中，得到第二重组大肠杆菌工程菌MG1655-PCA2。

L-脯氨酸-4-羟化酶的异源表达和合成反式-4-羟基-L-脯氨酸的条件优化

L-脯氨酸-4-羟化酶的异源表达和合成反式-4-羟基-L-脯氨酸的条件优化周海岩;李会帅;王培;柳志强【摘要】L-脯氨酸-4-羟化酶(L-Proline-4-hydroxylase,P4H)是依赖α-酮戊二酸(α-KG)和Fe2+的双加氧酶成员之一,在反式4-羟基-L-脯氨酸(trans-4-hydroxy-L-proline,t-4Hyp)等重要手性化合物的生物合成中发挥关键作用.本研究构建了来源于Bradyrhizobium japonicum USDA 6的P4H重组大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)/pET-28b-p4hBJ,SDS-PAGE和酶活检测结果表明,该菌株具有表达可溶性P4H和催化合成t-4Hyp的能力.通过优化,确定了该重组菌全细胞催化合成t-4Hyp较优的反应体系和条件:10 mLpH 6.5 80 mmol/LMES缓冲液、9 mmol/L L-Pro,6 mmol/L L-抗坏血酸,6 mmol/L α-KG,0.8 mmol/LFeS04·7H2O,反应温度为35℃;在20 g/L湿细胞的催化反应中,t-4Hyp的合成量达到34.86 mg/L,比优化前(17.53 mg/L)提高了98.86％.该工作为进一步利用P4H生物催化法合成t-Hyp奠定了一定的技术基础.%L-Proline-4-hydroxylase (P4H) is a member of Fe (Ⅱ)/c-ketoglutarate (cα-KG)-dependent dioxygenase superfamily,playing an important role in biosynthesis of trans-4-hydroxy-L-proline (t-4Hyp) and other important chiral building-block chemicals.In this work,recombinant Escherichia coli BL21 (DE3)/pET-28b-p4hBJ harboring P4H gene p4HBJ,originated from Bradyrhizobium japonicum USDA 6 was constructed.The results of SDS-PAGE and enzyme activity solubly analysis showed that P4H was expressed solubly and actively in E.coli BL21 (DE3)/pET-28b-p4hBJ.Furthermore,the whole cell catalysis conditions with E.coli BL21 (DE3)/pET-28b-p4hBJ was investigatedand optimized for t-4Hyp biosynthesis.The optimum reaction system and conditions were as follows:10 mL pH 6.5 MES buffer,9 mmol/L L-Pro,6 mmol/L L-ascorbic acid,6 mmol/L α-KG,0.8 mmol/L FeSO4 · 7H2O;the reaction temperature was 35 ℃.Under the optimized conditions,a t-4Hyp yield of 34.86 mg/L was achieved via whole cell catalysis reaction with 20 g/L wet cells,which was 98.86％ higher than that of pre-optimization.The work provided an important theoretical foundation for the further research of t-4Hyp biosynthesis with P4H as biocatalyst.【期刊名称】《工业微生物》【年(卷),期】2017(047)001【总页数】9页(P1-9)【关键词】L-脯氨酸-4-羟化酶;反式-4-羟基-L-脯氨酸;双加氧酶;生物合成;生物催化;优化【作者】周海岩;李会帅;王培;柳志强【作者单位】浙江省生物有机合成技术研究重点实验室,生物工程学院,浙江工业大学,浙江杭州310014;生物转化与生物净化教育部工程研究中心,浙江杭州310014;浙江省生物有机合成技术研究重点实验室,生物工程学院,浙江工业大学,浙江杭州310014;生物转化与生物净化教育部工程研究中心,浙江杭州310014;浙江省生物有机合成技术研究重点实验室,生物工程学院,浙江工业大学,浙江杭州310014;生物转化与生物净化教育部工程研究中心,浙江杭州310014;浙江省生物有机合成技术研究重点实验室,生物工程学院,浙江工业大学,浙江杭州310014;生物转化与生物净化教育部工程研究中心,浙江杭州310014【正文语种】中文反式-4-羟基-L-脯氨酸(trans-4-hydroxy-L-proline，t-4Hyp)是一种重要的L-羟脯氨酸(L-Hydroxyproline，简称Hyp)同分异构体，在生物体的一些生理和病理过程中发挥关键的作用，广泛应用于食品、化妆品、医药和化工等领域[1]。

大肠杆菌高细胞密度发酵

课程设计说明书课程名称：发酵工程设计题目：大肠杆菌的高细胞密度发酵院系：生物与食品工程学院学生姓名：郑帅超学号：201106040030专业班级：11 生物技术指导教师：李安华2014年5月26日课程设计任务书设计题目枯草芽孢杆菌产淀粉酶发酵工艺的优化学生姓名郑帅超所在院系生物与食品工程学院专业、年级、班11生物技术设计要求：1、树立正确的设计指导思想，严谨负责、实事求是、刻苦钻研、勇于探索的作风和学风。

2、根据所给资料，按照任务书中提出的范围和要求按时独立完成，不得延误，不得抄袭他人成果。

3、说明书应字迹清楚文字通顺，并附有各项设计成果表，摘引其他书籍或杂志的材料必须注明出处。

4、设计标准要求规范、实用、切合实际。

5、设计应严格按有关设计规范进行。

6、设计结束后，以个人为单位提交设计说明书一份（后附流程图）。

学生应完成的工作：1、在老师的帮助下完成题目设计。

2、学生查阅相关文献、资料制定实验路线，并有指导老师检查实验路线的合理性和可行性。

3、学生在实验室完成实验方案。

4、完成课程设计说明书的初稿，由指导老师帮助修改，最后定稿。

参考文献阅读：[1]李寅等著，高细胞密度发酵技术，化学工业出版社，2006-10-01，177~288.[2]陈坚,李寅,毛英鹰,等. 生物工程学报,1998 ,14(4) :452～455.[3]李民,陈常庆,朴勤,等. 生物工程学报,1998 ,14(3) :270～275.[4]杨汝燕,李民,陈常庆. 工业微生物,1998 ,28(3) :30～33.[5 ]李民,陈常庆,朴勤等,生物工程学报,1998 ,14 (3) :270~275.[6]杨汝燕,李民,陈常庆,工业微生物,1999 ,29(1) :25～28.[7]徐皓,李民,阮长庚,等. 工业微生物,1998 ,28(2) :20～25.[8]刘社际,葛永红,杨立明. 中国生物制品学杂志,1999 ,12 (1) :29 ～31.工作计划：2013.5.11分组并确认指导老师，在老师指导下查阅文献，确定题目。

一株高产丝氨酸羟甲基转移酶基因工程菌的构建及发酵产酶条件优化

关键词：ｇｌｙＡ基因；丝氨酸羟甲基转移酶；基因工程；发酵产酶中图分类号：Ｑ８１２文献标志码：Ａ文章编号：１６７４－３６４４（２０１３）０３ — ０２１９ — ０６
Ｌ一丝氨酸是生糖氨基酸，由于其处于多条代
谢途径，难以从生物体内直接大量分离，故具有许多重要的生理功能和作用，在化工、制药、食品、化妆品和生物农药等行业有着广泛的应用口］。近
诱导表达条件口］（如诱导剂种类、浓度、诱导时
选育或构建一株优良菌株仅仅是开始，要使
优良菌株潜力发挥出来，还须优化其培养过程，以
获得较高的产物得率。微生物生长过程是一个复杂的过程，其代谢途径和代谢产物的生产会受到很多内在或外在的多因素影响，如菌种选育ｒ５］、培养基改良ｌ６］、培养条件（如温度、ｐＨ、溶氧）和
的生长速度和茵液浓度最佳；当表达条件的诱导温度为３Ｏ℃、诱导剂浓度为０．５ｍｍｏｌ／Ｌ、诱导时间为５ｈ
时，基因工程茵诱导目的蛋白表达效果最好。通过ＳＤＰＡＧＥ分析和酶活测定后发现，在优化条件下基因工程茵Ｇ１６发酵产丝氨酸羟甲基转移酶能力占茵体总蛋白的６Ｏ左右，且蛋白活性正常。

基因工程改造产表面活性素菌株发酵工艺优化

基因工程改造产表面活性素菌株发酵工艺优化陈子慧;王静;胡婧;高光军;林军章;汪卫东;汪庐山【期刊名称】《当代化工》【年(卷),期】2022(51)10【摘要】由于基因工程菌株与野生菌株的发酵体系及工艺上存在较大差异,现有工艺难以满足基因工程菌的工业化发酵需求,因此本课题以产表面活性素基因工程菌株为对象开展其代谢规律及发酵工艺研究。

利用模拟发酵罐对比野生菌株及基因工程菌株的生长代谢规律,同时对基因工程菌株的诱导剂及合成前体添加、消泡方式及通气量等发酵参数进行优化。

研究表明:野生菌株和基因工程菌株代谢规律不同,基因工程菌株OD600峰值为野生菌株的20倍;合成前体Leu和诱导剂IPTG的添加时机对表面活性素产率影响较大,优化得到在培养基中添加合成前体共同灭菌,且接种2.5 h后加入诱导剂的方式对表面活性素的表达最佳;基因工程菌株发酵过程中耗氧量大且产生大量泡沫,建立了包括泡沫回流工艺和植物油消泡的2种消泡方式;优化后最佳通气比为1.0 vvm、接种量为4%、发酵时长为60 h的条件下,10 L 模拟发酵罐表面活性素产率达到14.2 g·L^(-1)。

本研究为该类基因工程菌株工业化应用奠定坚实基础。

【总页数】6页(P2375-2380)【作者】陈子慧;王静;胡婧;高光军;林军章;汪卫东;汪庐山【作者单位】中国石化胜利石油管理局有限公司博士后科研工作站;中国石化胜利油田分公司石油工程技术研究院;中国石化微生物采油重点实验室;中国石化胜利油田分公司【正文语种】中文【中图分类】TQ815【相关文献】1.响应面法优化西藏黄牛源产纤维素酶菌株发酵条件2.产荧光嗜铁素菌株P11的发酵条件优化3.CHU-R菌株产虾青素的发酵工艺研究4.产表面活性素野生菌株的筛选、鉴定及其发酵条件研究5.芽胞杆菌工程菌株B9BD产表面活性素发酵培养基优化因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

枯草芽孢杆菌GMP还原酶基因_guaC_突变株的构建

枯草芽孢杆菌GMP 还原酶基因(guaC )突变株的构建张西锋1,李万芬2(1.武汉工业学院生物与制药工程学院,湖北武汉430023;2.武汉星辰现代生物工程有限公司,湖北武汉430074)摘要以受体菌的gua C 基因为同源重组的指导序列,构建了整合表达载体p GT9GH ,通过双交叉同源重组的方法将线性化的p GT9GH 整合到受体菌的染色体上,构建了guaC 基因的缺失突变株B .subtilis G J07,并在guaC 基因的5c 端和3c 端之间引入了一个拷贝核黄素操纵子,通过PCR 方法验证了同源重组的正确性,最后测定了同源重组突变后的菌株G J 07的核黄素产量。

结果表明:同源重组突变后的菌株G J 07的核黄素产量明显高于初始菌株G J 06,发酵60h 提高了24.5%。

关键词同源重组;枯草芽孢杆菌;guaC 基因中图分类号 Q 786;S 852.61 文献标识码 A 文章编号 0517-6611(2011)05-02556-03Construction of Bacill us subtilis GMP Reductase Gene (gua C )M utant ZHAN G X-i feng et al (Co llege of Biolog ica l and Ehar maceuti cal Eng i neer i ng ,W uhan Po l y t echni c U ni versi ty ,W uhan ,Hubei 430023)Abstract A n i nteg rated expressi on vector p GT9GH by usi ng guaC gene o f recept or strai n as gu i de sequence f o r ho m ologous recombi nati on .And t hen ,by usi ng the m et hod o f double cross over recombi nati on bet ween p l as m i d and chro moso m e ,the li near i zated pl as m i d p GT9GH were i ntegrated i nt o receptor stra i n to get gua C gene mut ant B.sub tilis G J 07,i n which ,one copy of l act ochro me operon was i nserted bet ween 5c and 3c ter m i na l o f guaC gene .The homo l ogous reco mbi nati on events were confir med by PCR met hods ,and then ,t he r i bofl avi n y i e l d of mut ant strain G J 07w asm easured .The res ults of shake flas k cult ure sho w ed t ha,t t he production o f r i bofl avi n o fG J 07w as 24.5%higher than t hat o f GJ 06i n 60h .K ey words Integ rati on ;Bacill us subtilis ;gua C gene基金项目国家重点新产品计划项目(2003ED760039);武汉工业学院引进(培养)人才科研启动资金项目(2010RZ16)。

枯草芽孢杆菌发酵培养基及发酵条件优化

枯草芽孢杆菌发酵培养基及发酵条件优化作者：焉兆萍宋士良陆克文来源：《国外畜牧学·猪与禽》2019年第01期摘; 要：本文对枯草芽孢杆菌的发酵培养基和发酵条件进行了筛选优化。

采用单因素试验和正交试验方法，确定该枯草芽孢杆菌的优化培养基为：豆粕40 g/L、玉米粉20 g/L、葡萄糖15 g/L、磷酸氢二钾3 g/L、磷酸二氢钾1.5 g/L、硫酸镁0.5 g/L、硫酸铵0.35 g/L、酵母浸粉0.2 g/L、硫酸锰0.2 g/L、硫酸亚; ;铁0.1 g/L、碳酸钙0.1 g/L。

最适发酵条件为：初始pH 7.2，接种量5%，发酵温度35 ℃，摇床转速250 r/min。

关键词：枯草芽孢杆菌;发酵培养基;发酵条件中图分类号：TQ920.6 文献标志码：A 文章编号：1001-0769（2019）01-0051-05枯草芽孢杆菌是嗜温、好氧、产芽孢的革兰氏阳性杆状细菌，在自然界中广泛存在，对人畜无毒无害，且不污染环境;能产生多种抗菌物质和酶，具有广谱抗菌活性。

该菌已被我国农业农村部列入饲料添加剂目录名单，越来越多地被研制成微生物制剂，其制剂作为“绿色”饲料添加剂，在畜牧养殖业、饲料加工业中得到广泛应用，成为现代养殖业的一种常规添加剂，具有广阔的发展前景[1]。

枯草芽; 孢桿菌在动物肠道内具有较强的生物夺氧能力，这对动物的营养物质利用、生长、防病起到重要作用[2];其还可以通过产生抗体和提高嗜菌作用等，刺激免疫，激发体液免疫与细胞免疫，从而提高动物的生产性能和饲料利用率[3]。

由于枯草芽孢杆菌生长速度快、营养需求简单、易于存活、无致病性，具有良好的发酵基础，国内外已有众多学者对此菌进行了大量研究[4]。

本文通过单因素试验与正交试验，对枯草芽孢杆菌的发酵培养基和发酵条件进行了研究，确定其最佳发酵培养基和最适发酵条件，以最大限度地提高枯草芽孢杆菌的发酵菌数，降低生产成本，满足工业化发酵生产的要求。