第二十章比色法和分光光度法
比色法和分光光度法的基本知识
比色法和分光光度法的基本学问**节比色法和分光光度法的基本学问一、光的特性光是由光量子构成的，具有二重性，即不连续的微粒和连续的波动性。
波长和频率是光的波动性和特征，可用下式表示：λ＝C/V式中λ为波长，具有相同的振动相位的相邻两点间的距离叫波长。
Ｖ为频率，即每秒钟振动次数。
Ｃ为光速等于299770千米／秒。
光属于电磁波。
自然界中存在各种不同波长的电磁波，列成表1—1所示的波谱图。
分光光度法所使用的光谱范围在200nm—10μ（1μ=1,000nm）之间。
其中200nm－400nm为紫外光区，400nm －760nm为可见光区，760nm－10,000nm为红外光区。
二、光的互补色假如两种色光（单色光或复色光）以适当地比例混合而能产生白色感觉时，则这两种颜色就称为“互为补色”。
非发光物体的颜色（如颜料），重要取决于它对外来光线的汲取和反射，所以该物的颜色与照射光有关。
一般把物体在白昼光照射下所呈现的颜色称为该物体的颜色。
假如将白昼光照射在黄蓝两种颜色混合后的表面时．因黄颜料能反射白光中的红、橙、黄和绿四种色光，而蓝色光能汲取其中的红、橙和黄三种色光，结果使混合颜料显示绿色。
这种颜色的混合与色光的加色混合不同，三、光的选择性汲取物质对光的汲取是物质和光能相互作用的一种形式。
由于光的波粒二象性只有当入射光的能量同吸光物质的基态和激发态能量差相等时才会被汲取，而物质的基态和激发态是由物质的原子结成和原子间相互作用决议的，不同的物质的能态不同，对光的选择性汲取也就不一样。
所以物质对光具有选择汲取性。
要讨论光的选择性汲取，首先必需搞清楚其产生的机理。
原子是由质子和核外电子构成的，核外电子以不同速度在质子四周不同轨道上旋转，每个轨道的能级是不一样的。
好像卫星围绕地球转的情况是相像的。
同时，每个轨道又有方向不同的亚轨道，而同一轨道的不同亚轨上的能量也是不相同的。
当电子的运动轨道更改都会伴有汲取和释放能量。
所以不同的能量变化有不同的汲取光谱。
第20章-比色法和分光光度法
第20章比色法和分光光度法【20-1】将下列百分透光度值换算为吸光度：（1）1% （2）10% （3）50% （4）75% （5）99%解：A＝2－lg T%（1）A=2－lg 1 = 2.000（2）A=2－lg 10 = 1.000（3）A=2－lg 50 = 0.301（4）A=2－lg 75 = 0.125（5）A=2－lg 99 = 0.0044【20-2】将下列吸光度值换算为百分透光度：（1）0.01 （2）0.10 （3）0.50 （4）1.00解：lgT%=2－A（1）lgT1%=2－0.01 = 1.99 T1%=97.7 %（2）lgT2%=2－0.10 = 1.90 T2%=79.4 %（3）lgT3%=2－0.50 = 1.50 T3%=31.6 %（4）lgT4% =2－1.00 =1.00 T4%=10.0 %【20-3】有一有色溶液，用1.0 cm 吸收池在527 nm 处测得其透光度T = 60%，如果浓度加倍，则（1）T值为多少？（2）A 值为多少？（3）用5.0 cm 吸收池时，要获得T = 60%，则溶液的浓度为原来浓度的多少倍？解：A＝－lg T =εbc －lg 0.60 = 0.222浓度增倍时：（1）lg T =－0.444 T= 36 %（2）A＝－lg T = 0.444（3）1.0cm时：c1 = 0.222 5.0cm时：c2 = 0.222c2/c1= 1.0 /5.0 = 0.2倍【20-4】有两种不同浓度的KMnO4溶液，当液层厚度相同时，在527nm处透光度T分别为（1）65.0%，（2）41.8%。
求它们的吸光度A各为多少？若已知溶液（1）的浓度为6.51×10-4mol·L-1，求出溶液（2）的浓度为多少？解：（1）A＝εbc =－lgT＝－lg 0.650 = 0.187（2）A＝－lg 0.418 = 0.379（3）当c 1= 6.51×10-4 mol • L -1时， b = 0.187∕6.51×10-4 = 287 mol -1 • L c 2= 0.379∕287 = 1.32×10-3 mol • L -1【20-5】在pH=3时，于655 nm 处测得偶氮胂Ⅲ与镧的紫蓝色配合物的摩尔吸光系数为4.50×104。
第二十章 比色和分光光度法
本章只讨论物质分子对可见光的吸收：目视比色法与分光光度法•不同浓度的同一物质吸收曲线形状相似，最大吸收波长相同，但吸光度值不同。
在任一波长处，溶液的吸光度随浓度的增加而增大，这是分光光度法定量分析的依据。
•在物质对光的吸收曲线上，吸光度最大处所对应的波长称为该物质的最大吸收波长（用λmax 表示）•在最大吸收波长附近吸光度的变化最为明显，所以定量分析中常选择最大吸收波长来测定吸光度，以获得较高的灵敏度。
•不同物质的吸收曲线的形状和最大吸收波长不同，说明光的吸收与溶液中物质的结构有关，根据这一特性可用作物质的初步定性分析。
结论：相同条件下，颜色越深，则浓度越大。
吸光度与浓度是相互关1.基本组成光源单色器样品室检测器显示光源在整个紫外光区或可见光谱区可以发射连续光谱，具有足够的辐射强度、较好的稳定性、较长的使用寿命。
可见光区：钨灯作为光源，其辐射波长范围在320～2500 nm，其中最适宜的使用范围为320-1000nm。
卤钨灯：寿命长，发光效率高(7230型、754型)紫外区：气体放电光源：氢、氘、氙灯。
发射185～400 nm的连续光谱;激光光源：氩离子激光器，可调谐染料激光器注意：1.其底及两侧为毛玻璃，另两面为光学透光面。
用的型号：751G、752、754、756、756MC、721、722、723、724高。
常用型号：710、730、760MC、760CRT、日本岛津UV－210型。
1.波长调节器（λ）；2.电位器（O）；3. 0%T电位器（100)；4.吸收池拉杆；5.灵敏度选择钮；6.电源开关；7.吸收池暗箱盖；8.显示仪显色剂加入量对吸光度A的影响(1)影响显色剂的平衡浓度和颜色(2)影响金属离子的存在状态影响显色的同时降低(3)影响络合物的组成显色反应最适宜的酸度需要通过实验进行选择。
方法是：固定被测离子及显色剂浓度，改变溶液pH值，测其吸光度，然后绘制吸光度对pH 值的关系曲线。
分光光度比色法的原理
分光光度比色法的原理
一、物质对光的吸收
分光光度比色法的基础是物质对光的吸收。
当光线穿过物质时，物质会吸收特定波长的光线，导致光的强度减弱。
物质对光的吸收程度与物质的浓度成正比，这是分光光度法进行定量分析的基础。
二、光的色散
光的色散是指光线通过棱镜或光栅等光学元件时，被分解成不同波长的光谱。
通过色散，我们可以将一束白光分解成不同颜色的光谱。
分光光度计利用这个原理，将物质吸收的光线分解成特定波长的光谱，从而确定物质对哪些波长的光线有吸收。
三、比色测定
比色测定是指在特定波长下测量物质对光的吸收程度。
通常，我们将待测物质与已知浓度的标准物质在相同条件下进行比色测定，然后根据标准曲线的斜率和截距计算出待测物质的浓度。
比色测定是分光光度比色法的重要步骤，通过它可以对物质进行定量分析。
四、定量分析
通过比色测定得到的数据，我们可以计算出待测物质的浓度。
在分光光度比色法中，我们通常使用标准曲线法或标准加入法来进行定量分析。
标准曲线法是通过绘制标准物质浓度与吸光度的关系曲线，然后根据待测物质的吸光度在曲线上找到对应的浓度。
标准加入法则是将已知浓度的标准物质加入待测样品中，然后根据吸光度的变化计算待测物质的浓度。
总之，分光光度比色法的原理主要包括物质对光的吸收、光的色散、比色测定和定量分析等方面。
通过这些原理的应用，我们可以快速、准确地测定物质的浓度，广泛应用于化学、生物学、医学等领域。
比色法和分光光度法及其仪器
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分光光度法
分光光度法的优点和缺点
分光光度法的优点包括高精度、高灵敏度和高选择性。它能够提供精确的定量数据，适用 于各种不同物质的测量。此外，分光光度法通常具有较高的灵敏度和较低的检测限，能够 检测到微量的物质 然而，分光光度法也有一些缺点。首先，它需要昂贵的仪器设备，通常只有实验室级别的 分析才使用分光光度计。其次，分光光度法需要一定的操作技能和经验，因为不同物质的 测量可能需要不同的条件和参数设置。此外，对于某些特定物质的测量，可能需要使用特 定的试剂和标准品，这可能会增加实验成本和时间
比色法和分光光度 法及其仪器
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1 比色法 2 分光光度法Biblioteka 比色法和分光光度法及其仪器
比色法和分光光度法是两种常用的化学分析方法，用 于测量溶液中的物质浓度
x
这两种方法都基于朗伯-比尔定律，该定律描述了溶液 的吸光度与溶液浓度之间的关系
PART 1
比色法
比色法
比色法是一种通过比较有色物质 溶液的颜色深度来确定其浓度的
技术
它主要基于颜色的差异，使用肉 眼或比色计来比较样品溶液和标 准溶液的颜色
比色法
比色法仪器
比色法通常使用比色计作为仪器。比色计是一种简单的 光学仪器，它通过比较样品溶液和标准溶液的颜色来测 量浓度。比色计通常由一个光源、一个滤光片和一个接 收器组成。光源发出的光通过滤光片，然后照射到样品 溶液和标准溶液上。接收器接收反射回来的光，并将其 转换为电信号。通过比较样品溶液和标准溶液的反射率 ，可以确定样品的浓度
比色法和分光光度法
分光光度法 在分光光度计中，将不同波长的光连续地照射到一定浓度的样品溶液时，便可得到与众不同波长相对应 的吸收强度。如以波长（λ）为横坐标，吸收强度（A）为纵坐标，就可绘出该物质的吸收光谱曲线。利 用该曲线进行物质定性、定量的分析方法，称为分光光度法，也称为吸收光谱法。用紫外光源测定无色 物质的方法，称为紫外分光光度法；用可见光光源测定有色物质的方法，称为可见光光度法。它们与比 色法一样，都以 Beer-Lambert 定律为基础。 上述的紫外光区与可见光区是常用的。但分光光度法的应 用光区包括紫外光区，可见光区，红外光区。 比色法 以可见光作光源，比较溶液颜色深浅度以测定所含有色物质浓度的方法。 以生成有色化合物的显色反应为基础，通过比较或测量有色物质溶液颜色深度来确定待测组分含量的方 法。比色法作为一种定量分析的方法，开始于 19 世纪 30～40 年代。比色分析对显色反应的基本要求是： 反应应具有较高的灵敏度和选择性，反应生成的有色化合物的组成恒定且较稳定，它和显色剂的颜色差 别较大。选择适当的显色反应和控制好适宜的反应条件，是比色分析的关键。 常用的比色法有两种：目视比色法和光电比色法，两种方法都是以朗伯-比尔定律(A＝εbc)为基础。常用 的目视比色法是标准系列法，即用不同量的待测物标准溶液在完全相同的一组比色管中，先按分析步骤 显色，配成颜色逐渐递变的标准色阶。试样溶液也在完全相同条件下显色，和标准色阶作比较，目视找 出色泽最相近的那一份标准，由其中所含标准溶液的量，计算确定试样中待测组分的含量。 光电比色法是在光电比色计上测量一系列标准溶液的吸光度，将吸光度对浓度作图，绘制工作曲线，然 后根据待测组分溶液的吸光度在工作曲线上查得其浓度或含量。与目视比色法相比，光电比色法消除了 主观误差，提高了测量准确度，而且可以通过选择滤光片来消除干扰，从而提高了选择性。但光电比色 计采用钨灯光源和滤光片，只适用于可见光谱区和只能 得到一定波长范围的复合光 ， 而不是单色光 束，还有其他一些局限，使它无论在测量的准确度、灵敏度和应用范围上都不如紫外-可见分光光度计。 20 世纪 30～60 年代，是比色法发展的旺盛时期，此后就逐渐为分光光度法所代替。
第二十章 比色法和分光光度法
3、朗伯-比尔定律
4、透光度（透射比） 5、吸光系数（吸收系数） 6、摩尔吸收系数
书P398： 例题20-1
二、吸光度的加和性 测得溶液的吸光度等于各组分的吸光度之 和。 A总 = ∑ Ai ＝κ1 b c1 + κ2 b c2 + …… κn b cn
三、朗伯-比尔定律的偏离 1、比尔定律的局限性 2、非单色入射光引起的偏离
4、颜色的产生：物质对不同波长的光具有选
择性吸收作用而产生了不同颜色。
5、光吸收曲线 6、吸收峰：光吸收程度最大处对应的波长。
7、物质定性分析的依据：不同物质的溶液，
其最大吸收波长不同。
20.2 光吸收的基本定律
一、朗伯-比尔定 1、朗伯定律 朗伯(Lambert) 1760年阐明了光的吸收程 度和吸收层厚度的关系。 A∝b 2、比尔定律 1852年比耳(Beer)又提出了光的吸收程度 和吸收物浓度之间也具有类似的关系。 A∝ c
一、光度分析法的特点 1、灵敏度高 2、准确度能满足微量组分测定的要求 3、操作简便快速，仪器设备简单
二、物质对光的选择性吸收
1、单色光：同一波长的光称为单色光。 2、复合光：由不同波长的光组成的光称为复
合光。如可见光。 3、互补色光：两种适当颜色的单色光按一定 强度比例混合可成为一种白光，这种两种单 色光称为互补色光。
A
λ1 A
λ2
λ
λ1
λ2
λ
Aλ1= kaλ1bCa ＋kbλ1bCb Aλ2= kaλ2bCa ＋kbλ2bCb
三、光度滴定 四、酸碱解离常数的测定 五、配合物组成的测定 1、饱和法 2、连续变化法
目视比色法和分光光度法的分析和比较
目视比色法和分光光度法的分析和比较2015年12月5日龙浪李珂璇王宇鑫李嘉浩程卫东王佳佳临床医学院指导教师：徐尧一、摘要本讨论报告通过分析和比较目视比色法和分光光度法两种比色法的主要优缺点，即目视比色法操作简便但精度较低，分光光度法精确度较高但对溶液的性质要求较高；并且结合实例说明两种比色法各自的适用范围和浓度限制，即两种比色方法分别在光的波长、物质的组分、以及对朗伯-比尔定律的符合情况上有不同的适用范围，并给出了适用的吸光度范围（0.2-0.8）和浓度范围。
由此针对不同情况给出了不同的选择方案。
这对实际的研究和生产生活具有指导性的意义。
二、前言在确定有色溶液待测组分含量时，常常可以通过比较和测量溶液的颜色来进行，这种方法叫做比色法。
早在19世纪30-40年代，比色法就开始作为一种定量分析的方法被应用到研究和生产中。
常用的比色法有目视比色法和分光光度法两种，其中前者主要通过眼睛观察得出结论，后者借助光电比色计进行。
由于这两种比色方法的实际应用非常广泛，因此分析和比较两种方法对于方法的优化显得尤为重要。
三、内容（一）两种比色方法优缺点比较1.目视比色法1）优点（1）比色时操作简便，成本较低相比分光光度法，目视比色法不需要动用分光光度计，只需要几个比色管便可以完成测定，因此显得仪器设备简单，操作简便，使用成本低。
同时节省了电能，有利于能源的节约和保护。
在分析大批试样时，其优势就显得更加明显，大大节省了人力、物力、财力以及测定消耗时间。
在本实验中，我们仅需配置5个标准溶液，便可直接在比色管架上进行比较，与分光光度法中所需的多次清洗比色皿的操作要求相比比较简易。
（2）适用范围较广，可用于不严格符合Lambert-Beer定律的情况目视比色法是通过比较通过光的强度来测定组分含量，可以在白光下进行[2]，因此对于有些不严格符合Lambert-Beer定律的显色反应也是适用的。
例如在用碘量比色法测定油脂中过氧化值时，碘和淀粉反应的特征蓝色只有在含碘量在2~10μg[6]时才较为严格地符合Lambert-Beer定律，因此只要反应产生的碘稍稍过量或不足，使用分光光度法测定就会产生较大误差，只能使用目视光度法。
第二十章比色法和分光光度法
A kbc
k：摩尔吸光系数 L · mol-1 · cm-1
MK
式中M为摩尔质量
k 是吸光物质在一定波长和溶剂条件下的特征常数。 在温度和波长等条件一定时， k 仅与吸收物质本身 的性质有关，与待测物浓度无关。 k 是吸光物质吸光能力的量度， k 值越大， 光度法
测定该物质的灵敏度越高。
20.3.2 分光光度计的基本部件
光源 单色器 检测系统 吸收池 读数指示器
1. 光源 作用：发出所需波长范围内的连续光谱。要求具有 足够的辐射强度、较好的稳定性、较长的使用寿命。 可见光区常用钨灯、或碘钨灯，波长范围： 320~2500 nm
2. 单色器
作用：将光源发出的连续光谱分解为单色光。单色
黄 橙 红
绿
青 青蓝 蓝
白光
如 CuSO4 溶 液 呈 蓝 色 就是吸收了白光中黄 光。
紫红
如果将不同波长的光通过一固定浓度和厚度
的有色溶液，测量每一波长下有色溶液对光的吸
收程度（吸光度A），然后以波长为横坐标，吸
光度为纵坐标作图，得一曲线，称吸收曲线。
图中Ⅰ、Ⅱ、 Ⅲ三条曲线， 代表同一被测 物质含量由高 到低的吸收曲 线。
A = k b c，k 在一定波长下是一常数，如入射光不 为单色光，则k不为常数，A 与c 不成直线关系。
A
在最大吸收波长附近
通常有一个吸收强度相
差较小的区域，如入射
光在此范围内，因k 变
化较小，引起的偏离也 较小，A与c基本上呈直 λmax λ 线关系。
3.由于溶液本身发生化学变化 的原因引起的偏离
适宜的酸度范围由实验确定：固定其它条件，改变 pH值测A，作A ~ pH曲线，选择曲线平坦部分对应的 pH值作为测量条件。
分光光度法与比色法
1、几个概念：分光光度法在分光光度计中，将不同波长的光连续地照射到一定浓度的样品溶液时，便可得到与众不同波长相对应的吸收强度。
如以波长（λ）为横坐标，吸收强度（A）为纵坐标，就可绘出该物质的吸收光谱曲线。
利用该曲线进行物质定性、定量的分析方法，称为分光光度法，也称为吸收光谱法。
用紫外光源测定无色物质的方法，称为紫外分光光度法；用可见光光源测定有色物质的方法，称为可见光光度法。
它们与比色法一样，都以Beer-Lambert定律为基础。
上述的紫外光区与可见光区是常用的。
但分光光度法的应用光区包括紫外光区，可见光区，红外光区。
比色法colorimetry以可见光作光源，比较溶液颜色深浅度以测定所含有色物质浓度的方法。
以生成有色化合物的显色反应为基础，通过比较或测量有色物质溶液颜色深度来确定待测组分含量的方法。
比色法作为一种定量分析的方法，开始于19世纪30～40年代。
比色分析对显色反应的基本要求是：反应应具有较高的灵敏度和选择性，反应生成的有色化合物的组成恒定且较稳定，它和显色剂的颜色差别较大。
选择适当的显色反应和控制好适宜的反应条件，是比色分析的关键。
常用的比色法有两种：目视比色法和光电比色法，两种方法都是以朗伯-比尔定律(A＝εbc)为基础。
常用的目视比色法是标准系列法，即用不同量的待测物标准溶液在完全相同的一组比色管中，先按分析步骤显色，配成颜色逐渐递变的标准色阶。
试样溶液也在完全相同条件下显色，和标准色阶作比较，目视找出色泽最相近的那一份标准，由其中所含标准溶液的量，计算确定试样中待测组分的含量。
光电比色法是在光电比色计上测量一系列标准溶液的吸光度，将吸光度对浓度作图，绘制工作曲线，然后根据待测组分溶液的吸光度在工作曲线上查得其浓度或含量。
与目视比色法相比，光电比色法消除了主观误差，提高了测量准确度，而且可以通过选择滤光片来消除干扰，从而提高了选择性。
但光电比色计采用钨灯光源和滤光片，只适用于可见光谱区和只能得到一定波长范围的复合光，而不是单色光束，还有其他一些局限，使它无论在测量的准确度、灵敏度和应用范围上都不如紫外-可见分光光度计。
比色法和分光光度法
例如, 白光通过CuSO4溶液时, 溶液 颜色为蓝色。
吸收曲线: 为了精确表明溶液对不 同波长光的吸收情况, 可将不同波长 的单色光依次通过某一固定浓度的有 色溶液, 测量该溶液对各单色光的吸 收程度, 即吸光度, 以波长为横坐标, 吸光度为纵坐标作图所得曲线, 即为 吸收曲线, 或称吸收光谱。
光栅:色散元件, 利用光的衍射和干 涉原理制成。当白光通过密刻平行条 痕的光栅后, 将不同波长的光色散成 连续光谱。具有波长范围宽、色散均 匀、分辨本领高等优点。
c. 吸收池(比色皿) 用于盛装被测试液和参比溶液。 按制作材料不同分为石英吸收 池和玻璃吸收池。
d. 检测器 作用: 是将光强度信号转换为可 测电信号, 常见检测器有光电池和 光电管。 光电池: 国产581-G型光电比色 计及72型分光光度计。
与目视比色法相比, 光度法的特点: ① 灵敏度高;10-5 ~ 10-6mol/L ② 准确度较高; ③ 仪器设备较简单, 操作简便、 快速； ④ 应用广泛。
(2) 光的性质和物质的颜色 光的性质: 光是一种电磁波, 具 有波粒二象性。光的波动性可用 波长来描述, 其单位常用纳米(nm) 表示, 波长越短, 能量越高。
具有同一波长的光称为单色光,由不 同波长光组成的光称为复合光。
互补色光: 若将两种颜色的光按适当的 强度比混合可成白光, 那么这两种光称为 互补色光。
物质的颜色: 物质对光的吸收是具有选择性的。 当一束白光通过溶液时, 若溶液对各 种色光都不吸收, 则白光全部通过, 溶液呈无色透明; 若各种色光几乎全 被吸收, 则溶液呈黑色; 若溶液只吸收 某种色光, 则溶液呈透过光的颜色, 也 就是说, 溶液呈吸收光的互补色光的 颜色。
(2) 吸光系数 当b以cm, c以g/L为单位, K为吸光 系数, 用符号a表示, 单位为L/g · cm A=abc 当b以cm, c以mol/L为单位时, K为 摩尔吸光系数, 用符号ε表示, 单位 为L/ mol · cm A=εbc a a与ε的关系: M
第章比色法和分光光度法
第20章比色法和分光光度法【20-1】将下列百分透光度值换算为吸光度：（1）1% （2）10% （3）50% （4）75% （5）99%解：A＝2－lg T%（1）A=2－lg 1 = 2.000（2）A=2－lg 10 = 1.000（3）A=2－lg 50 = 0.301（4）A=2－lg 75 = 0.125（5）A=2－lg 99 = 0.0044【20-2】将下列吸光度值换算为百分透光度：（1）0.01 （2）0.10 （3）0.50 （4）1.00解：lgT%=2－A（1）lgT1%=2－0.01 = 1.99 T1%=97.7 %（2）lgT2%=2－0.10 = 1.90 T2%=79.4 %（3）lgT3%=2－0.50 = 1.50 T3%=31.6 %（4）lgT4% =2－1.00 =1.00 T4%=10.0 %【20-3】有一有色溶液，用1.0 cm 吸收池在527 nm 处测得其透光度T = 60%，如果浓度加倍，则（1）T值为多少？（2）A 值为多少？（3）用5.0 cm 吸收池时，要获得T = 60%，则溶液的浓度为原来浓度的多少倍？解：A＝－lg T =εbc －lg 0.60 = 0.222浓度增倍时：（1）lg T =－0.444 T= 36 %（2）A＝－lg T = 0.444（3）1.0cm时：c1 = 0.222 5.0cm时：c2 = 0.222c2/c1= 1.0 /5.0 = 0.2倍【20-4】有两种不同浓度的KMnO4溶液，当液层厚度相同时，在527nm处透光度T分别为（1）65.0%，（2）41.8%。
求它们的吸光度A各为多少？若已知溶液（1）的浓度为6.51×10-4mol·L-1，求出溶液（2）的浓度为多少？解：（1）A＝εbc =－lgT＝－lg 0.650 = 0.187（2）A＝－lg 0.418 = 0.379（3）当c1= 6.51×10-4 mol • L-1时，b = 0.187∕6.51×10-4 = 287 mol -1 • Lc 2= 0.379∕287 = 1.32×10-3 mol • L -1【20-5】在pH=3时，于655 nm 处测得偶氮胂Ⅲ与镧的紫蓝色配合物的摩尔吸光系数为4.50×104。
比色法与紫外分光光度法的异同
比色法与紫外分光光度法的异同比色法和紫外分光光度法，这俩听上去好像很复杂的科学名词，其实它们都跟“测量颜色”有关系。
嗯，简单说就是看东西的颜色，然后通过这个颜色来判断里面有什么成分。
你可能会想，这俩是不是差不多？是的，差不多，但细节上还是有点不同的，了解清楚了，能让你在实验室里也能像个小专家一样，得心应手。
比色法嘛，简单来说，就是通过溶液的颜色来判断它的浓度。
比方说，你往水里加了某种化学物质，水的颜色可能会变得更加浓烈。
你通过比较颜色的深浅，来推算浓度。
你觉得有点意思吧？其实这就像你平时看着一杯饮料的颜色，越深可能说明加糖多，越浅可能说明糖少，做化学实验也是一样。
可是，比色法有个小问题就是它受光线、溶液颜色、试剂浓度等各种因素的影响，哎，这就让它的准确性有点小小的波动。
紫外分光光度法呢，就像是比色法的“升级版”，有点像拿着超级显微镜来看问题。
它的原理是通过紫外线光源照射样品，然后测量样品吸收了多少光，最后得出结论。
简而言之，紫外线比可见光更“强”，它能穿透更多的东西。
所以，紫外分光光度法通常用来测量那些对紫外线有吸收的物质，比如药物中的有效成分，或者环境中的污染物。
这种方法不仅能量度颜色的深浅，还能更精确地定量物质的含量。
比色法和紫外分光光度法，最大的不同就体现在它们对光的“利用”上。
比色法主要依赖的是可见光，而紫外分光光度法则是通过紫外光去探测物质的特性。
就像你用手电筒和紫外线手电筒照东西，两者照出来的效果完全不一样。
比色法的测量范围一般限制在了肉眼能看到的颜色范围内，所以它适合一些比较简单的、颜色鲜明的实验；紫外分光光度法就不一样了，紫外光波长比可见光短，能“看到”更深层的东西，能测量更多“看不见”的物质。
所以，紫外分光光度法在处理一些微量物质或者需要高精度测量的场合，表现得更有“压倒性优势”。
不过，说到优缺点，它们俩也各有千秋。
比色法简单易用，设备不复杂，花费也相对便宜。
你只需要准备一个比色皿，把样品放进去，然后在一定的波长下对比颜色，就可以得出浓度。
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单组分定量方法
工作曲线法
比较法 相同条件下测定试样和标样溶液的吸光度
，由标样浓度计算试样的浓度。必须遵循朗伯－比
耳定律，试样浓度接近标样时准确度高。
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多组分定量方法 组分X和组分Y的吸收光谱不重叠， 则直接在各自的最大波长测定
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组分X和组分Y的吸收光谱重叠
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纳米材料与生物分析
拓展知识
纳米材料的良好光学性能,被用于生物染色剂和免疫标记物： 胶体Au、Ag纳米材料可用于对蛋白质染色,用分光光度法 可检测到纳克级蛋白质。
纳米银的吸光光度法已用于Hg(Ⅱ)、Cr、Co、三聚氰胺、
芳香族化合物、DNA序列、组氨酸以及组氨酸标记的蛋白 、色氨酸、半胱氨酸和蛋白质等的测定
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吸 光 度 2 3 1
1 无偏离 2 正偏离 3 负偏离
浓度
9
偏离的原因：
1. 比尔定律本身的局限性
2. 非单色入射光引起的偏离
3. 由于溶液本身发生化学变化的原因
而引起的偏离
化学变化包括：电离反应；酸碱反应；配位反应； 缔合反应；吸光物质浓度变化，产生偏离。
10
20.3.2 分光光度计的基本部件
光源→单色器→吸收池→检测系统→读数指示器
光栅
光二极管阵列多通道分光光度计光路图
11
检流计标尺透光度与吸光度的关系
A=-lgT=lg=lg100-lgI
12
显色反应与显色条件的选择 M(被测离子)+R(显色剂) == MR(有色配合物)
显色反应一般应充分考虑以下几个方面因素：
1. 显色剂的用量
2. 酸度对显色剂浓度、显色剂颜色、配合物组成、 被测离子存在的状态的影响 3. 显色时的温度和时间 4. 溶剂的影响
的绿色光吸收最强,从而
呈现互补色-紫色
图20-1
不同浓度高锰酸钾溶液的光吸收曲线
5
20.2 光吸收的基本定律
朗伯-比尔定律
A: 吸光度(absorbance) I0: 入射光强度
It: 透过光强度
K: 比例常数 b: 液层厚度 C: 溶液浓度
6
Lambert － Beer 定律是光吸收的基本定律， 是各类分光光度法定量分析的依据和基础： A＝-lgT＝lg(I0/It)＝bc
在特定波长和溶剂情况下，摩尔吸光系数是物
质的特征参数。 越大，测定时灵敏度越高。
8
偏离Lambert－Beer定律的因素 根据Beer定律，吸光度对浓度作图所得的直 线截距为0，斜率为εb。但实际上，吸光度与浓度 的关系有时是非线性的，或者不通过零点，即出现 偏离Lambert－Beer定律的现象。
无机及分析化学
（第五版） 南京大学化学化工学院
1
第二十章 比色法和分光光度法
了解比色法、分光光度法的特点 掌握光的吸收定律及其适用范围 掌握分光光度法的分析方法 了解显色反应及其条件的选择 了解分光光度法仪器测量的误差及测量条件的选择
2
Hale Waihona Puke 20.1 概述34
λmax=525 nm
KMnO4溶液对525 nm
5. 干扰物质的影响及消除
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20.5 分光光度法仪器测量误差及其消除
光度计读数误差是经常遇到的测量误差,当透光度读数太大或太 小时,微小的透光度读数误差会造成相当大的浓度相对误差。
相 对 误 差
一般分光光度计透光率误
差约在+0.2 ％-+2％之间，
通常透光率控制在 15-65 ％ 之间（吸光度0.2-0.8）。
ε摩尔吸收系数(molar absorptivity)
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总的吸光度具有加和性 A＝ 1bc1 + 2bc2 + 3bc3 + …… b一般用cm表示; c 以 g•L 为单位时， 称为吸光系数，用 a 表示，单 位为L • g -1 •cm -1 。 c 以mol•dm-3为单位时，称为摩尔吸光系数，用 表示，单位为L • mol -1 •cm -1 。