芦荟大黄素对PC12细胞骨架保护作用的实验研究_雷秀霞 (1)

研究原著
芦荟大黄素对PC12细胞骨架保护作用的实验研究
雷秀霞1,张琼1,李国豪2,莫健民1,何国华1
1.广州医学院附属广州市第一人民医院检验科,广东广州510180;
2.广州医学院附属广州市第一人民医院药剂科,广东广州510180
基金项目:广州市中医药、中西医结合科研资助项目(2010A8)
作者简介:雷秀霞(1966 ),女,广州人,主任技师。

研究方向:临床分子生物学检验。

摘要:目的 研究芦荟大黄素(A E)对H 2O 2及甲醛引起的PC12细胞损伤的保护作用。

方法 将PC12细胞分成A E+H 2O 2干预组、H 2O 2损伤组、A E+甲醛干预组、甲醛损伤组、AE 对照组和正常对照组6组。

各组加入相应药物干预2h 后用不同浓度H 2O 2或甲醛损伤后进行细胞骨架及凋亡染色、LDH 检测。

结果 AE +H 2O 2干预组L DH(67.7 5.5)U /L 显著低于H 2O 2损伤组的(92.0 9.9)U /L (P <0.01);A E+甲醛干预组L DH 与甲醛损伤组比较差异无统计学意义(P >0.05);A E+H 2O 2干预组细胞骨架损伤、凋亡较H 2O 2损伤组少。

结论 A E 可通过纠正H 2O 2诱导的细胞骨架的异常改变,阻滞或延缓PC12细胞的过度凋亡但对甲醛诱导的细胞骨架重排无明显保护作用。

主题词:芦荟大黄素/药理学;PC12细胞/药物作用
中图分类号:R285.5 文献标识码:A 文章编号:1009 6647(2011)23 5555 04
Study on protection of Aloe emodin for cytoskeleton in PC 12cells
L EI Xiu x ia *,ZH A NG Q iong,L I Guo hao,M O Jian min,HE Guo hua
*
Dep ar tment of L abo rator y M edicine,T he Fir s t P eop le 's H osp ital A f f iliated to
Guangz hou M edical College,Guangz hou 510180,China
Abstract Objective:T o investig ate the pr otectio n of A lo e emo din(A E)on P C12cells injur ed by H 2O 2and for malde hyde.Methods PC12cells w er e assigned into six g roups:A E +H 2O 2g roup,H 2O 2gr oup,A E +
for maldehy de
g roup,fo rmaldehyde gr oup,A E co nt rol g roup and the no rmal contr ol g ro up.Ev ery g ro up w as pretr eated w ith co rr e spo nding drug s fo r 2h,and then was injured by H 2O 2o r forma ldehy de in different concentr ation.T he concentr atio n of LDH in the supertanant o f cell culture was measur ed.M eanw hile,cytoskeleto n and apoptosis of the cells wer e de tected.Results T he co ncentrat ion of L DH in A E +H 2O 2g ro up(67.7 5.5)U /L w as sig nificantly lo wer than H 2O 2g roup(92.0 9.9)U /L (P <0.01).T her e was no significant sig nificance of L DH co nt ent between A E+fo rmaldehyde g r oup and fo rmaldehyde g roup(P >0.05).Cy toskeleto n injury and apoptosis in cells wer e reduced in A E+H 2O 2co mpa red to H 2O 2g roup.Conclusions AE has pro ctect ive effects on cy toskeleto n defo rmatio n induced by H 2O 2by w hich the apo pt osis of PC12cells could be pr ev ent o r delay ed,but A E has no significant pro tective effects o n the r earr ang ement o f cytoskeleto n in P C12cells induced by formaldehy de.MeSH:A loe emo din/phar maco lo gy ;PC12Cells/drug effects
帕金森病(Par kinson 's disease,简称PD)是一种慢性进行性神经系统疾病,主要病变为中脑黑质多巴胺能神经元黑质细胞发生变性坏死,但其确切病因及发病机制不明。

多数学者认为该病是由多基因遗传、衰老及外界毒质暴露等综合作用引起的。

PC12细胞是大鼠肾上腺髓质嗜铬细胞瘤分化的细胞株,具有典型的神经细胞特征,PC12细胞合成的酶类、表达的受体以及合成的神经递质接近中脑多巴胺能神经元,常用于神经细胞死亡方式和神经毒性损害研究
[1]。

据报
道茶多酚由于具有显著的抗氧化、抗炎等作用,对
H 2O 2所致的PC12细胞损伤有明显的保护作用[2]。

芦荟含蒽醌类衍生物,其提取物芦荟大黄素同样具有抗氧化、抗炎、抗辐射等多种作用,为此,我们选择芦荟大黄素作为神经保护剂,研究其对PC12细胞的多种损害的保护作用及其机制,为开辟中西医结合治疗PD 的新领域提供实验依据。

1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 药物及试剂 芦荟大黄素由中国药品生物制品检定所提供(批号110795 200806);吖啶橙(AO)、溴化乙啶(EB)由北京普博欣生物科技有限责任公司
提供;考马斯亮蓝R250、四氮唑盐(M TT)由广州国奥生物技术有限公司提供;DM EM培养基、胰酶由Gib co公司提供。

1.1.2 细胞株 PC12细胞株由中山大学动物实验中心细胞库提供。

1.1.3 仪器 美国BIO T EK IN ST RU MENT S Quant全自动酶标仪;日本OLYMPUS IX 71荧光倒置显微镜;日本OLYM PUS A U 2700全自动生化分析仪。

1.2 方法
1.2.1 M TT细胞毒性检测 将生长至80%~90%汇合时细胞消化后调整密度为1 104/ml,每孔200 l接种于96孔细胞培养板。

于37 、5%CO2条件下培养24h后,换液,实验孔加入不同浓度AE(0、5、10、20、40、80 g/m l),并设相应试剂浓度对照孔分别继续培养24h。

各浓度组重复3孔。

按MT T检测方法测定各孔光密度并计算细胞存活率。

细胞存活率(%)=(实验组平均OD值-试剂相应浓度对照组平均OD值)/正常对照组平均OD值。

选择细胞毒性小浓度相对较高的AE浓度为最终干预浓度(20 g/m l),按1.2.1方法接种细胞并培养24h,加入20 g/ml AE干预2h(对照组不加),分别加入不同浓度H2O2(0、50、100、200、400、800 mol/ ml)或甲醛(0、5、10、20、40、80 mol/m l)损伤,各浓度组重复3孔,24h后留取各孔上清液检测乳酸脱氢酶(LDH)活性并计算细胞存活率。

1.2.2 实验分组及药物干预 消化对数期生长的PC12细胞于24孔培养板中,每孔加1ml细胞悬液,干预组每孔加入终浓度为20 g/m l A E作用2h,分组实验如下:H2O2组:加入终浓度为100 m ol/m l H2O2;AE+H2O2干预组:加入终浓度为20 g/m l AE和100 m ol/m l H2O2;甲醛组:加入终浓度为40 mol/ml甲醛;AE+甲醛干预组:加入终浓度为20 g/m l AE和40 mol/ml甲醛;AE对照组:加入终浓度为20 g/ml AE;正常对照组:仅加等体积细胞悬液,每组重复3孔。

于37 、5%CO2培养4h后,分别作细胞骨架、细胞凋亡染色及LDH活性检测。

1.2.3 细胞骨架染色 细胞用H ank's洗涤2次后,加入2.5%戊二醛固定30m in,蒸馏水漂洗细胞3次,加入1%T rito nX 100浸泡10min,蒸馏水漂洗细胞3次,加入0.2%考马斯亮蓝R250于37 染色4min,用蒸馏水漂洗细胞3次,于倒置显微镜下观察细胞骨架。

1.2.4 吖啶橙/溴化乙啶(AO/EB)染色 细胞用PBS洗涤2次后,加入AO(100 g/ml)和EB(100 g/ ml)各5 l混合,室温下避光染色1min,在400倍显微镜下随机观察5个视野,计数凋亡、坏死细胞占总细胞的比率。

实验重复3次。

1.3 统计学处理 实验数据以 x s表示,采用Excel 统计软件进行配对资料t检验及独立样品t检验,P< 0.05为差异具有统计学意义。

2 结 果
浓度为5、10、20、40、80 g/m l的AE作用PC12细胞24h后细胞存活率依次为100%、98.4%、96.5%、81.6%和62.4%,说明高浓度(40、80 g/ml) AE对PC12细胞有一定的不良反应,故干预实验选择使用20 g/m l AE。

浓度为50、100、200、400、800 mo l/ml H2O2损伤组细胞存活率依次为93.0%、89.8%、81.7%、46.5%和28.9%,显著低于AE+H2O2干预组(100%、96.7%、91.8%、49.8%和28.1%)(P< 0.05),说明20 g/ml的AE对H2O2引起的PC12损伤有一定的保护作用,尤对低于200 mol/ml H2O2引起的损伤保护作用较为明显。

浓度为5、10、20、40、80 m ol/m l甲醛损伤组细胞存活率依次为87.9%、82.1%、79.7%、77.5%和56.2%,稍低于AE+甲醛干预组(95.5%、88.7%、85.5%、72.9%和71.1%),但差异无统计学意义(P> 0.05),说明20 g/m l的AE对甲醛引起的PC12损伤保护作用不明显。

AE+H2O2干预组细胞培养上清液LDH含量为(67.7 5.5)U/L,显著低于H2O2损伤组(92.0 9.9)U/L(P<0.01),与正常对照组(65.5 2.1)U/ L和AE对照组(74.3 8.7)U/L比较,差异无统计学意义(P>0.05),说明H2O2损伤组细胞死亡较多。

AE+甲醛干预组细胞培养上清液LDH含量为(78.3 16.3)U/L,与甲醛损伤组(62.5 9.1)U/L、正常对照组和AE对照组比较差异均无统计学意义(P>0.05),说明AE对甲醛引起的PC12细胞损伤无明显的保护作用。

AE+H2O2干预组细胞骨架纤维走势清楚,纹理清晰;H2O2损伤组细胞骨架纤维间隙增大,稀疏,偶见骨架断裂出现。

AE+甲醛干预组和甲醛损伤组细胞骨架纹理比较模糊,排列紊乱,细胞形态不规则,边缘绉缩,着色不均。

AE对照组和正常对照组细胞骨架纤维纹理清晰,呈典型密集网络状结构,细胞形态理想(图1)。

A:AE+H 2O 2干预组 B:H 2O 2损伤组 C:AE+甲醛干预组 D:甲醛损伤组 E:AE 对照组 F:正常对照组
图1 各组细胞细胞骨架的改变
AO/EB 细胞凋亡染色可见AE+H 2O 2干预组细胞生长状况良好,偶见凋亡早期和死亡细胞(10.5%);H 2O 2损伤组细胞生长状况尚可,但死亡细胞相对较多(19.4%),偶见凋亡晚期细胞出现;AE+甲醛干预
组和甲醛损伤组细胞生长状况不理想,细胞变圆、变小,形态异常,死亡细胞较多(30.8%和34.9%),偶见凋亡晚期细胞出现;AE 对照组和正常对照组细胞形态完整,偶见死亡细胞(3.32%和2.7%)。

见图2。

A:AE+H 2O 2干预组 B:H 2O 2损伤组 C:AE+甲醛干预组 D:甲醛损伤组 E:AE 对照组 F:正常对照组
图2 各组细胞细胞凋亡坏死情况
3 讨 论
研究发现PD 患者黑质中过氧化氢、脂质过氧化物、蛋白质和DNA 氧化产物等含量明显增加,而还原型谷胱甘肽(GSH )水平显著下降,这些物质的含量改变证实PD 患者脑内氧化增加而抗氧化和自由基清除系统功能低下,从而更易受到氧化应激损害,氧化应激导致细胞内ROS 产生过多,进而导致多巴胺能神经元凋亡最终导致PD 的发生[3,4]。

甲醛和H 2O 2是典型的氧化剂,能诱导脂质过氧化、依剂量 效应关系耗竭细胞内GSH 、打开线粒体渗透性转运通道或上调P38蛋白激酶p38活性,导致凋亡相关基因Bax 表达,半胱天冬酶(caspase)活化,进而启动细胞凋亡[5-7]。

由于活性氧族的主要成分在代谢过程中能产生活性氧和自由基导致细胞凋亡从而引起神经元损害[8]。

本结果显示,甲醛和H 2O 2能促使细胞LDH 漏出增多,诱导肾上腺嗜铬细胞瘤细胞凋亡、坏死,与王春燕[7]李瑛等[9]报道一致,而芦荟大黄素对H 2O 2诱导的PC12细胞损伤有一定的保护作用,其作用机理可
能与AE 具有抗菌、消炎、抗衰老等功效,对超氧阴离子自由基和羟自由基有清除作用,诱导抗氧化酶的活性,对脂质过氧化引起的炎症反应有治疗作用等有关[5,7]。

但实验结果也显示,AE 对甲醛诱导的PC12细胞损伤无明显保护作用,其原因可能由于甲醛能引起细胞DNA 分子断裂或DNA DNA 、DNA 蛋白质交联有关[6]。

细胞凋亡是机体清除衰老、畸变或恶化细胞的一种主动、程序化的生理过程;肌动蛋白是构成细胞骨架的主要成分,其表达水平的变化与细胞形态变化密切相关。

有研究表明,细胞凋亡时肌动蛋白细丝发生断裂,肌动蛋白网络结构遭到破坏[10]。

本结果显示,H 2O 2能致细胞骨架纤维间隙增大、稀疏,甚至出现骨架断裂,而AE 可通过纠正细胞骨架的异常改变,阻滞或延缓PC12细胞的过度凋亡,但结果未显示对甲醛诱导的细胞骨架重排有明显保护作用,至于更进一步的原因和作用机制有待同行们研究探讨。

参考文献
[1] You ng LH,Ik eda Y,Lefer AM.Caveolin 1peptide ex erts car
diop rotective effects in myocardial ischemia reperfusion via nitric oxide mechanism [J].Am J Physiol H eart Circ Ph ysiol,2001,280(6):H 2489 2495.
[2] 邓凤君,徐江平,杨迎暴,等.茶多酚对H 2O 2诱导PC 12细胞损伤
的保护作用[J].中草药,2010,41(6):945 949.
[3] H ald A ,L Ot h ariu s J.Oxidative .Stress an d in flammation in
Parkins on's dis ease :is there a causal lin k[J ]?E xp Neurol,2005,193(2):279 290.
[4] 崔群力,孙圣刚.姜黄素通过抗氧化作用拮抗鱼藤酮致PC12细胞损
伤的研究[J ].华中科技大学学报(医学版),2010,39(1):37 41,46.[5] 赵云罡,徐建兴.线粒体、活性氧和细胞凋亡[J].生物化学与生物
物理进展,2001,28(2):168 171.
[6] 赵冬梅,张璐萍,刘洪付.甲醛致雌性小鼠卵巢细胞DNA 损伤及
Bcl2和Bax 表达的影响[J].滨州医学院学报,2010,33(5):328 330.[7] 王春燕,刘逸,杨胜圆.H 2O 2通过上调P38的活性而诱导PC12
细胞凋亡[J].湖南师范大学学报(医学版),2009,6(3):22 25.[8] 姜恩平,吴金义,陈建光.北五味子总木脂素对H 2O 2诱导PC12
细胞凋亡的影响[J].吉林大学学报(医学版),2009,35(3):466 469.
[9] 李瑛,王婧,让欧艳,等.甲醛致肾上腺嗜铬细胞瘤细胞凋亡作用
[J ].中国公共卫生,2009,25(6):733 735.
[10] 高清,吴波.细胞凋亡与细胞骨架的改变[J].医学研究生学报,
2008,21(8):877 880.
收稿日期:2011 04 08 责任编辑:许纬洲
误诊与教训分析
异位妊娠破裂误诊1例分析
石宝玉1,章德本2
河北省承德市双滦区人民医院1.妇产科;2.急诊科067101
通讯作者:章德本,E mail:zhdb a@sin
主题词:妊娠,异位/并发症;破裂/诊断;误诊
中图分类号:R714.220.4 文献标识码:B 文章编号:1009 6647(2011)23 5558 01 对异位妊娠破裂误诊1例分析如下。

1 病历摘要
女,38岁。

主因呕吐、腹泻10h 伴胸闷、乏力2h 于2010 04 29T 19:00就诊。

患者于10h 前出现恶心、呕吐,呕吐物为胃内容物,非喷射性。

后出现下腹坠胀、腹泻,为大量稀水样便,无脓血,当时未予处理。

2h 前出现头晕、胸闷、乏力。

既往体健,未婚,末次月经时间2010 04 12,经期规律,经量中等。

查体:T 36.6 ,P 148次/min,BP 50/30mm Hg ,神清,面色苍白,双肺呼吸音清,未闻及干湿性啰音,H R 148次/min,律齐,腹平坦,脐周轻压痛,无反跳痛及肌紧张,叩鼓音,移动性浊音阴性,肠鸣音亢进。

门诊资料:血常规W BC 22.8 109/L ,GRA 91%,LY M 6.5%,M ID 2.5%,RBC 3.77 1012/L ,H b 109g/L ,P LT 208 109/L ,尿常规:白细胞(+),便常规:外观黄绿色稀便,镜检白细胞(+)/HP ,血K + 4.0mmo l/L ,Na +135.3mmol/L ,Cl -97.7mmol/L 。

门诊以急性胃肠炎、低血容量性休克收入院。

入院后给予抗感染、补液等支持治疗,2d 后病情无好转,并逐渐出现尿少,明显腹痛,查体见下腹部明显压痛,反跳痛,查腹部CT 及B 超示:腹腔积液。

腹腔穿刺抽出不凝血,经妇科会诊并行尿妊娠试验显示阳性,遂考虑为异位妊娠破裂、失血性休克,急行剖腹探查,术中证实为:左侧输卵管间质部妊娠破裂,腹腔出血约3000ml,行左输卵管切除术,住院治疗10d 痊愈出院。

2 讨 论
异位妊娠是妇产科常见急腹症,近年来国内外报告异位妊娠的发病率正在成倍的增加,现约占妊娠总数的1%~2%,最常见于输卵管妊娠,发病率占异位妊娠的95%
[1]。

本病误诊率
为13%~19%[2],个别报道高达35.9%~67.9%[3]。

现就本例误诊原因分析如下:(1)患者初期病史、症状、体征不典型。

本例患者未婚,无停经史,无阴道出血,以呕吐、腹泻为首发症状。

追问病史,此患者有未婚同居史,发病初期仅有轻微腹痛,就诊过程中无明显腹痛,入院时腹部体征仅脐周轻微压痛,肠鸣音明显亢进,血常规白细胞增高,红细胞及血色素无明显降低,便常规等支持急性肠炎诊断,这些都干扰了初诊医生的思路,导致误诊的发生。

此病例完整的体现了诊断异位妊娠应注意的 三个不一定 ,即 结婚与否不一定,有无停经史不一定,有无阴道出血不一定 。

(2)接诊者思路不开阔,查体不仔细。

患者发病早期即出现休克症状,而腹泻患者除 中毒性菌痢 外,罕有早期即出现休克症状者,且经大量补液治疗,休克症状不缓解,即应考虑到有持续性失血或失液的可能。

而接诊者被病史、症状的表象所迷惑, 急性胃肠炎 的印象占据了主导地位,从主观上导致了误诊的发生。

通过本例,我们应接受如下教训:(1)在牢固掌握异位妊娠临床特征的同时,不要拘泥于典型的病史及症状,一定要注意到前文提到的 三个不一定 ;(2)要求我们医生特别是首诊医生诊断疾病思路要开阔,查体要仔细,观查病情要及时,对于出现的问题要及时分析并加以解决,病情不明确时要及时请相关科室会诊,避免不必要的拖延,而延误救治的最佳时机。

参考文献
[1] 乐杰.妇产科学[M ].7版.北京:人民卫生出版社,2008:105.[2] 张步宁.异位妊娠误诊37例分析[J ].中国误诊学杂志,2001,1
(2):254 255.
[3] 梁心玲,朱坤仪.异位妊娠150例临床分析[J].中国实用妇科与
产科杂志,2001,17(3):157.
收稿日期:2011 04 02 责任编辑:魏建。