分子发光分析.
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分子发光分析法
3.检测器 3.检测器
荧光计采用光电管作检测器 荧光分光光度计采用光电倍增管作检测器 电感耦合器件（charge couple device, CCD)
四、荧光分析方法与应用
1. 特点： 特点： （1）灵敏度高 比紫外-可见分光光度法高2～4个数量级
？
光度法 A = lg I0/I = KC 荧光法 I= KC
(c) 刚性平面结构：可减少分子振动，减少与溶剂的相互作用 刚性平面结构：
(d) 取代基效应 取代基效应：给电子取代基使荧光增强；吸电子取代基使荧光减弱 如苯胺和苯酚荧光较强，而硝基苯为非荧光物质 （e）重原子效应 ）重原子效应：卤素取代基随原子序数的增加，荧光减弱，而磷光增强
（3)荧光螯合物 荧光螯合物
I p = 2 . 3ϕ p I o c
式中：Ip 为磷光效率，Io 为激发光的强度人为磷光物质的摩尔吸收系数，b为 试样池的光程。在一定的条件下，ϕ 、I p、 、b均为常数，因此上式可写成： κ
I p = Kc
根据上式可以用磷光强度对磷光物质浓度制作定量分析的标准曲线
2. 温度对磷光强度的影响：随着温度的降低，磷光逐渐增强 温度对磷光强度的影响： 3.重原子效应： 3.重原子效应：重原子的高核电荷使磷光分子的电子能级交错，容易引 重原子效应 起或增强磷光分子的自旋轨道偶合作用，从而使S 起或增强磷光分子的自旋轨道偶合作用，从而使S1→ T1的体系间窜跃 概率增大，有利于增大磷光效率。 4.室温磷光 4.室温磷光 （1）固体基质：在室温下以固体基质吸附磷光体，增加分子刚性、减少三重 态猝灭等非辐射跃迁，从而提高磷光量子效率。 （2）胶束增稳：利用表面活性剂在临界浓度形成具多相性的胶束，改变磷光 体的微环境、增加定向约束力，从而减小内转换和碰撞等去活化的几率，提 高三重态的稳定性。 （3）敏化磷光: 激发三重态将能量转移于另一易发磷光的受体，让其法磷光
仪器分析课件chap12 分子发光分析法
电子处于激发态是不稳定状态，返回基态时，
通过辐射跃迁(发光)和非辐射跃迁(热)等方式失去能
量。
传递途径
辐射跃迁
非辐射跃迁
荧光 延迟荧光 磷光
系间窜越 内转换 外转换 振动弛豫
返回速度快的途径，发生几率大!
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内容导航 第一节 分子荧光磷光产生基本原理 重点与难点
(一)、非辐射跃迁
e
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内容导航 第一节 分子荧光磷光产生基本原理 重点与难点
3. 系间窜越：不同多重态在有重叠的振动能级间的 非辐射跃迁。电子自旋改变，跃迁禁阻，通过自旋轨道耦合等跃迁。
S2 S1
S0 e
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内容导航 第一节 分子荧光磷光产生基本原理 重点与难点
4. 外转换：激发态分子与溶剂或其他分子之 间产生相互作用而损失能量回到基态的非辐射 跃迁。
f
S0
T1
i
e
i
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内容导航 第一节 分子荧光磷光产生基本原理 重点与难点
2. 磷光发射：电子由第一激发三重态的最低振动能 级→基态各振动能级。发光时间：10-4～100s 。
I I f
aS2
S1
T1
hv′
S0
e
S0 →激发态→振动弛豫→内转换→系间窜越→ T1→振动弛豫→ S0
电子由基态跃迁到激发态，当电子由激发态返回基态
时，以发射电磁辐射(即光)的形式释放能量。
电能
电致发光
分子 发光
+
化学能 光能
生物活性参 与化学发光
化学发光 光致发光 生物发光
第12章 分子发光分析
配合物（荧光） 配合物（荧光）
28
(4)取代基： (4)取代基： 取代基 OH、 NHR、 a 给电子基团 如-NH2、-OH、-OCH3、-NHR、 CN、 产生的p 共轭作用增加了的 -CN、-NR2等，产生的p-π共轭作用增加了的 电子共扼程度，使荧光效率提高， π电子共扼程度，使荧光效率提高，荧光波 长长移。 长长移。 COOH、 C=O、 b 吸收电子基团如 -COOH、 -NO2 、-C=O、 NO、 SH、 减弱分子的π -NO、-SH、-NHCOCH3、-X等；减弱分子的π 电子共轭程度，使荧光减弱甚至熄灭， 电子共轭程度，使荧光减弱甚至熄灭， 电子共轭体系作用较小， c 对π电子共轭体系作用较小，如：-R、对荧光的影响也不明显。 SO3H、-NH3+等，对荧光的影响也不明显。
5
• 电子能级的多重性可用M＝2S+1表示，S为 电子能级的多重性可用M 2S+1表示， 表示 电子自旋量子数的代数和，其数值为0 电子自旋量子数的代数和，其数值为0或1。 • 当S＝0时，分子的多重性M＝1，此时分子 分子的多重性M 所处的电子能态称为单重态，用符号S 所处的电子能态称为单重态，用符号Si表 示。 • 当S＝1时，分子的多重性M＝3，此时分子 分子的多重性M 所处的电子能态称为三重态。用符号T 所处的电子能态称为三重态。用符号Ti表 示。
6
7
激发单重态与激发三重态的区别： 激发单重态与激发三重态的区别： 激发单重态分子是抗磁性分子，激发三重 激发单重态分子是抗磁性分子， 态分子是顺磁性分子； 态分子是顺磁性分子； 激发单重态的平均寿命大约10 激发单重态的平均寿命大约10-8s，激发三 重态的平均寿命大约10 1s； 重态的平均寿命大约10-4~1s； 电子由S 电子由S0→S1，S2等的跃迁较容易，属于允 等的跃迁较容易， 许跃迁。电子由S 许跃迁。电子由S0→T1，T2等的跃迁较难发 属于禁阻跃迁。 生，属于禁阻跃迁。 激发三重态比激发单重态能级稍低一些。 激发三重态比激发单重态能级稍低一些。
分子发光分析法
只有在极稀的溶液中，当 b c <0.02时才成立，对于浓度较 高的溶液，由于自猝灭和自吸收等原因，使荧光强度和荧光 物质浓度不呈线性关系。
3 .荧光的产生与分子结构的关系
• 分子产生荧光必须具备两个条件： • 物质分子必须具有能吸收一定频率紫外可见辐射
的特征结构，分子必须具有吸光的结构 • 吸光后被激发的分子还必须具有高的荧光量子产
荧光发射光谱 荧光激发光谱
磷光光谱
200 260 320
380 440醇溶液荧（磷）光光谱
7-1 概述
• 分子发光分析法包括荧光分析法、磷光分析法和化学发光 分析法。这三种都是通过测量被激发的分子回到基态时所 发射的光辐射来进行分析的，不同之处在于光谱产生的机 制。
荧光强度 If正比于吸收的光量Ia和荧光量子效率 ：
•
If = Ia
•
由朗-比耳定律： Ia = I0(1-10- b c )
•
If = I0(1-10- b c ) = I0(1-e-2.3 b c )
• 浓度很低时，将括号项近似处理后：
•
If = 2.3 I0 b c = Kc
② 荧光 (或磷光)发射光谱
• 固定激发光波长(选最大激发波长), 化合物发射的荧光(或 磷光强度)与发射光波长关系曲线。
荧光发射光谱 荧光激发光谱
磷光光谱
200
260 320
380 440 500 560 620
室温下菲的乙醇溶液荧（磷）光光谱
③ 激发光谱与发射光谱的关系
（1） Stokes(斯托克斯)位移 激发光谱与发射光谱之间的波长差值。发射光谱的波长比
激发光谱的长，振动弛豫消耗了能量。 （2） 荧光光谱的形状与激发波长无关 电子跃迁到不同激发态能级，吸收不同波长的能量(如l2
第七章 分子发光分析
22:50
如8-巯基喹啉在下列四种不同极性溶剂中的情况
溶剂 介电常数 四氯化碳 2.24 氯仿 5.2 丙酮 21.5 乙腈 38.8
荧光峰λ/nm 荧光效率
390
0.002
398
0.041
405
0.055
410
0.064
22:50
③ 溶液pH值对荧光强度的影响 不同的pH值，化合物所处状态不同，不同的 化合物或化合物的分子与其离子在电子构型上有 所不同。 对于金属离子与有机试剂形成的发光鏊合物， 一方面pH会影响鏊合物的形成，另一方面还会 影响鏊合物的组成，因而影响它们的荧光性质。 如：苯酚在酸性溶液中呈现荧光，但在碱性 溶液中，无荧光。
浓度范围为：10-5μg/ml～100μg/ml 。对于较 浓溶液，由于猝灭现象和自吸收等原因，使荧光 强度和浓度不呈线性关系,将向浓度轴偏离。
22:50
（2）影响荧光强度的因素 ① 溶剂对荧光强度的影响 一般来说，随着溶剂介电常数的增大，荧光 峰的波长越大，荧光效率也越大。 ② 温度对荧光强度的影响 温度上升使荧光强度下降。
22:50
① 碰撞猝灭 处于激发单重态的荧光分子与猝灭剂分子相碰 撞，使激发单重态的荧光分子以无辐射跃迁的方 式回到基态，产生猝灭作用。 。
② 静态猝灭（组成化合物的猝灭） 由于部分荧光物质分子与猝灭剂分子生成非荧 光的配合物而产生的。此过程往往还会引起溶液 吸收光谱的改变。
22:50
③ 氧的猝灭作用 分子由于系间的跨越跃迁，由单重态跃迁到三 重态。转入三重态的分子在常温下不发光，它们 在与其它分子的碰撞中消耗能量而使荧光猝灭。 溶液中的溶解氧对有机化合物的荧光产生猝灭 效应是由于三重态基态的氧分子和单重激发态的 荧光物质分子碰撞，形成了单重激发态的氧分子 和三重态的荧光物质分子，使荧光猝灭。
如8-巯基喹啉在下列四种不同极性溶剂中的情况
溶剂 介电常数 四氯化碳 2.24 氯仿 5.2 丙酮 21.5 乙腈 38.8
荧光峰λ/nm 荧光效率
390
0.002
398
0.041
405
0.055
410
0.064
22:50
③ 溶液pH值对荧光强度的影响 不同的pH值，化合物所处状态不同，不同的 化合物或化合物的分子与其离子在电子构型上有 所不同。 对于金属离子与有机试剂形成的发光鏊合物， 一方面pH会影响鏊合物的形成，另一方面还会 影响鏊合物的组成，因而影响它们的荧光性质。 如：苯酚在酸性溶液中呈现荧光，但在碱性 溶液中，无荧光。
浓度范围为：10-5μg/ml～100μg/ml 。对于较 浓溶液，由于猝灭现象和自吸收等原因，使荧光 强度和浓度不呈线性关系,将向浓度轴偏离。
22:50
（2）影响荧光强度的因素 ① 溶剂对荧光强度的影响 一般来说，随着溶剂介电常数的增大，荧光 峰的波长越大，荧光效率也越大。 ② 温度对荧光强度的影响 温度上升使荧光强度下降。
22:50
① 碰撞猝灭 处于激发单重态的荧光分子与猝灭剂分子相碰 撞，使激发单重态的荧光分子以无辐射跃迁的方 式回到基态，产生猝灭作用。 。
② 静态猝灭（组成化合物的猝灭） 由于部分荧光物质分子与猝灭剂分子生成非荧 光的配合物而产生的。此过程往往还会引起溶液 吸收光谱的改变。
22:50
③ 氧的猝灭作用 分子由于系间的跨越跃迁，由单重态跃迁到三 重态。转入三重态的分子在常温下不发光，它们 在与其它分子的碰撞中消耗能量而使荧光猝灭。 溶液中的溶解氧对有机化合物的荧光产生猝灭 效应是由于三重态基态的氧分子和单重激发态的 荧光物质分子碰撞，形成了单重激发态的氧分子 和三重态的荧光物质分子，使荧光猝灭。
第六章荧光法
CH3
CH3
CH3 CH3
维生素E： 激发波长295nm 发射波长324nm
硫色素荧光法
K 3 Fe(CN ) 6 NaOH 维生素B1
溶解后 （铁氰化钾）氧化
酸 正丁醇 荧光消失 硫色素 蓝色荧光 碱
激发λ=365nm； 发射λ=435nm
N H3C N
4.猝灭剂（quencher）的影响 荧光猝灭：是指荧光物质分子与溶剂或其它 溶质分子相互作用，引起荧光强度降低、消 失或荧光强度与浓度不呈现线性关系的现象。
引起荧光猝灭的物质，称为猝灭剂，如 卤素离子、重金属离子、氧分子、硝基化合 物、重氮化合物、羰基化合物等吸电子极性 物质。
荧光猝灭的主要原因是碰撞猝灭。 碰撞猝灭：处于激发单重态的荧光分子 与猝灭剂碰撞后，使激发态分子以无辐 射跃迁回到基态，产生猝灭。
CH 2 NH 2 HCl
N S
CH 3 C 2 H 4 OH
硫胺素
N H3C N N
N S
CH 3 C 2H 4OH
硫色素
四、环境对荧光的影响
1.温度的影响 一般说来，大多数荧光物质的溶液随 着温度的降低，荧光效率和荧光强度将增 加，相反，温度升高荧光效率将下降。 如荧光素的乙醇溶液在0℃以下每降低10 ℃，荧光效率增加3%，冷至-80℃时，荧光 效率为100%。
荧光
延迟荧光
磷光
系间串越 内转换
外转换
振动弛豫
激发态停留时间短、返回速度快的途径，发生的几率大， 发光强度相对大。 荧光：10-7～10 -9 s,第一激发单重态的最低振动能级→基态。 磷光：10-4～10s，第一激发三重态的最低振动能级→基态。
辐射跃迁: 荧光：受光激发的分子从第一激发单重态的最低振 动能级回到基态所发出的辐射。寿命为10-9 ~ 10 -7s。 由于是相同多重态之间的跃迁，几率较大，速度快。 磷光： 从第一激发三重态的最低振动能级回到基态 所发出的辐射。由于磷光的产生伴随自旋多重态的 改变，辐射速度远小于荧光，磷光寿命为10-4 ~10s。
分子发光分析法
第五章 分子发光分析法: 基态分子吸收了一定能量后，跃迁至激发态，当激发态分子以辐射跃迁形式将其能量释放返回基态时，便产生分子发光。
第一节 荧光分析法一、概 述 :分子荧光分析法是根据物质的分子荧光光谱进行定性，以荧光强度进行定量的一种分析方法。
与分光光度法相比，荧光分析法的最大优点是灵敏度高和选择性高。
二、荧光产生的基本原理（一）分子荧光的产生（二）荧光效率及其影响因素1.荧光效率2.荧光与分子结构的关系（1）产生荧光的条件①必须含有共轭双键这样的强吸收基团，并且体系越大， 电子的离域性越强，越容易被激发产生荧光；大部分荧光物质都含有一个以上的芳香环，且随共轭芳环的增大，荧光效率越高，荧光波长越长。
②分子的刚性平面结构有利于荧光的产生③.取代基对荧光物质的荧光特征和强度的影响 给电子基团：-OH 、-NH2、-NR2和-OR 等可使共轭体系增大，导致荧光增强。
吸电子基团：-COOH 、-NO 和-NO2等使荧光减弱。
随着卤素取代基中卤原子序数的增加，使系间窜跃加强，物质的荧光减弱，而磷光增强。
3.环境因素对荧光强度的影响（1）溶剂极性对荧光强度的影响: 一般来说，电子激发态比基态具有更大的极性。
溶剂的极性增强，对激发态会产生更大的稳定作用，结果使物质的荧光波长红移，荧光强度增大. 奎宁在苯、乙醇和水中荧光效率的相对大小为1、30和1000。
（2）温度荧光强度的影响: 一般情况下，辐射跃迁的速率基本不随温度而改变，而非辐射跃迁的速率随温度升高而显著增大。
对大多数的荧光物质而言，升高温度会使非辐射跃迁概率增大，荧光效率降低。
由于三重态的寿命比单重激发态寿命更长，温度对于磷光的影响比荧光更大。
（3）pH 对荧光强度的影响:共轭酸碱两种体型具有不同的电子氛围，往往表现为具有不同荧光性质的两种体型，各具有自己特殊的荧光效率和荧光波长。
另外，溶液中表面活性剂的存在，可以使荧光物质处于更有序的胶束微环境中，对处于激发单重态的荧光物质分子起保护作用，减小非辐射跃迁的概率，提高荧光效率。
90350-仪器分析-第八章 分子发光分析法
禁阻跃迁． • 磷光发射过程：由第一激发单重态的最低振动能级，
以系间窜跃方式转至第一激发三重态，经过振动弛豫 转至其最低振动能级，跃回至基态时便发射磷光。
3、荧光/磷光光谱曲线
§4.2 分子荧光与磷光光谱分析法
• 激发光谱曲线-荧光强度与激
发光波长的关系
• 固定测量波长为荧光/磷光的最 大发射波长，改变激发波长， 测量荧光或磷光强度；
荧光发射光谱 荧光激发光谱
磷光光谱
• 荧光或磷光光谱曲线-荧光
或磷光强度与发射光波长的关 系
• 固定激发光波长为其最大激发 波长，测量发射不同波长的荧 光或磷光强度．
200 260 320 380 440 500 560 620 室温下菲的乙醇溶液荧（磷）光光谱
§4.2 分子荧光与磷光光谱分析法
4. 荧光、磷光与分子结构的关系
荧光激发光谱荧光发射光谱
200 蒽25的0 激30发0光3谱50和4荧00光4光50n谱m500
§4.2 分子荧光与磷光光谱分析法
6、荧光强度与溶液浓度的关系（定量分析）
溶液的荧光强度(If )与溶液吸收的光强度(Ia)及荧光量
子产率( f）的关系 ：
If = Ia
由朗伯-比耳定律：
A=lg（I0/ It）， Ia= I0- It
§4.2 分子荧光与磷光光谱分析法
9. 影响分子发光的环境因素
a.溶剂的影响
除一般溶剂效应外，溶剂的极性、氢键、配位键的形成 都将使化合物的荧光发生变化；
b.温度的影响
荧光强度对温度变化敏感，温度增加，外转换去活的几 率增加。
c. 溶液pH
酸碱化合物受溶液pH的影响较大，需要严格控制.
§4.2 分子荧光与磷光光谱分析法
以系间窜跃方式转至第一激发三重态，经过振动弛豫 转至其最低振动能级，跃回至基态时便发射磷光。
3、荧光/磷光光谱曲线
§4.2 分子荧光与磷光光谱分析法
• 激发光谱曲线-荧光强度与激
发光波长的关系
• 固定测量波长为荧光/磷光的最 大发射波长，改变激发波长， 测量荧光或磷光强度；
荧光发射光谱 荧光激发光谱
磷光光谱
• 荧光或磷光光谱曲线-荧光
或磷光强度与发射光波长的关 系
• 固定激发光波长为其最大激发 波长，测量发射不同波长的荧 光或磷光强度．
200 260 320 380 440 500 560 620 室温下菲的乙醇溶液荧（磷）光光谱
§4.2 分子荧光与磷光光谱分析法
4. 荧光、磷光与分子结构的关系
荧光激发光谱荧光发射光谱
200 蒽25的0 激30发0光3谱50和4荧00光4光50n谱m500
§4.2 分子荧光与磷光光谱分析法
6、荧光强度与溶液浓度的关系（定量分析）
溶液的荧光强度(If )与溶液吸收的光强度(Ia)及荧光量
子产率( f）的关系 ：
If = Ia
由朗伯-比耳定律：
A=lg（I0/ It）， Ia= I0- It
§4.2 分子荧光与磷光光谱分析法
9. 影响分子发光的环境因素
a.溶剂的影响
除一般溶剂效应外，溶剂的极性、氢键、配位键的形成 都将使化合物的荧光发生变化；
b.温度的影响
荧光强度对温度变化敏感，温度增加，外转换去活的几 率增加。
c. 溶液pH
酸碱化合物受溶液pH的影响较大，需要严格控制.
§4.2 分子荧光与磷光光谱分析法
第二章分子发光分析
18
(3) 刚性平面结构 实验发现，多数具有刚性平面结构的 有机分子具有强烈的荧光。
因为这种结构可以减少分子的振动， 使分子与溶剂或其它溶质分子的相互作用 减少，也就减少了碰 撞去活的可能性。
19
（4）取代基效应
给电子基团，荧光增强（-OH、-OR、-CN、-NH2）
芳环上 取代基ຫໍສະໝຸດ 产生了p-共轭作用，增强了电子共轭程度，使最低 激发单重态与基态之间的跃迁几率增大。
4
2．分子内的光物理过程
其中S0、S1和S2分别表示分子的基态、第一和第二电子激发的单重态
T1和T2则分别表示分子的第一和第二电子激发的三重态。
V=0、1、2、3、…表示基态和激发态的振动能级。
5
非辐射能量传递过程；
S1
S2
T1
S0 吸光1
吸光2
振动弛豫:
在同一电子能级 中，电子由高振 动能级转至低振 动能级，而将多 余的能量以热 的
A + B C* + D C* C + h
36
间接发光是被测物A或B，通过化学反应生成初始激发态产
物C* ， C* 不直接发光，而是将其能量转移给F，使F跃迁 回基态，产生发光。
A + B C* + D C*+F F* + E F* F + h
2. 气相化学发光和液相化学发光
（1）气相化学发光
（一）荧光和磷光的产生
从分子结构理论来讨论
振动能级
电子所处的能级
分子中电子
转动能级
的能量状态
S=0, J=1 单重态S表示
（所有电子都是自旋配对的） 电子的多重态 大多数基态分子都处于单重态
J=2S+1
(3) 刚性平面结构 实验发现，多数具有刚性平面结构的 有机分子具有强烈的荧光。
因为这种结构可以减少分子的振动， 使分子与溶剂或其它溶质分子的相互作用 减少，也就减少了碰 撞去活的可能性。
19
（4）取代基效应
给电子基团，荧光增强（-OH、-OR、-CN、-NH2）
芳环上 取代基ຫໍສະໝຸດ 产生了p-共轭作用，增强了电子共轭程度，使最低 激发单重态与基态之间的跃迁几率增大。
4
2．分子内的光物理过程
其中S0、S1和S2分别表示分子的基态、第一和第二电子激发的单重态
T1和T2则分别表示分子的第一和第二电子激发的三重态。
V=0、1、2、3、…表示基态和激发态的振动能级。
5
非辐射能量传递过程；
S1
S2
T1
S0 吸光1
吸光2
振动弛豫:
在同一电子能级 中，电子由高振 动能级转至低振 动能级，而将多 余的能量以热 的
A + B C* + D C* C + h
36
间接发光是被测物A或B，通过化学反应生成初始激发态产
物C* ， C* 不直接发光，而是将其能量转移给F，使F跃迁 回基态，产生发光。
A + B C* + D C*+F F* + E F* F + h
2. 气相化学发光和液相化学发光
（1）气相化学发光
（一）荧光和磷光的产生
从分子结构理论来讨论
振动能级
电子所处的能级
分子中电子
转动能级
的能量状态
S=0, J=1 单重态S表示
（所有电子都是自旋配对的） 电子的多重态 大多数基态分子都处于单重态
J=2S+1
分析化学-分子发光分析法
3. 流式细胞术（FCM） 对悬液中的单细胞或其他生物粒子,通过检测
标记的荧光信号，实现高速、逐一的细胞定量 分析和分选的技术。
§4 化学发光分析法
Chemiluminescence Analysis
基本原理 化学发光反应类型 化学发光测量仪器 化学发光分析法的应用
一、基本原理
化学发光是由于化学反应而导致的光发射。 发生于生命体系的化学发光称为生物发光。 生物发光均有酶（荧光素酶）参加。
最大化学发光强度与发光物质浓度成正 比： Icl max = Kc
化学发光的积分值与发光物质浓度成正 比： Icl = Kc
二、化学发光反应的类型
直接化学发光
A 十 B C＊ ， C＊ C 十 hν
间接（敏化）化学发光 A 十 B C＊ + D ， C＊+ F C 十 F＊
F＊ F 十 hν
三、New technique of fluorescence analysis
1. 激光荧光分析 F 与 I0 成正比，激光的强度大，可提高
荧光法的灵敏度。
2.时间分辨荧光分析
由于不同分子的荧光寿命不同，在激发 和检测之间延缓一段时间，使不同荧光寿命 的物质达到分别检测的目的。
时间分辨荧光免疫法 将稀土元素的螯合物标记抗体，与体液中 的抗原结合。当加入一种增效剂时，稀土 元素被释放出来，形成新的螯合物，能产生 长寿命的 荧光（10 ~1000 μs)。待样品中 蛋白质等物质所发荧光完全衰减后进行测定， 可有效消除背景干扰。 已用于测定甲胎蛋白、促性腺绒毛激素、 皮质醇等体内微量物质的测定。
2.化学发光免疫分析仪
化学发光免疫分析是将化学发光分析和 免疫分析相结合而建立的一种超微量分析 技术。兼具发光分析的高灵敏性和抗原抗 体反应的高特异性的特点。
分子发光分析法
分子发光分析法基态分子吸收了一定能量后，跃迁至激发态，当激发态分子以辐射跃迁形式将其能量释放返回基态时，便产生分子发光(Molecular Luminescence)。
依据激发的模式不同，分子发光分为光致发光、热致发光、场致发光和化学发光等。
光致发光按激发态的类型又可分为荧光和磷光两种。
本章讨论分子荧光(Molecular Fluorescence)、分子磷光(Molecular Phosphorescence)和化学发光(Chemiluminescence)分析法。
第一节荧光分析法一、概述分子荧光分析法是根据物质的分子荧光光谱进行定性，以荧光强度进行定量的一种分析方法。
早在16世纪，人们观察到当紫外和可见光照射到某些物质时。
这些物质就会发出各种颜色和不同强度的光，而当照射停止时，物质的发光也随之很快消失。
到1852年才由斯托克斯(Stokes)给予了解释，即它是物质在吸收了光能后发射出的分子荧光。
斯托克斯在对荧光强度与浓度之间的关系进行研究的基础上，于1864年提出可将荧光作为一种分析手段。
1867年Goppelsroder应用铝—桑色素络合物的荧光对铝进行了测定。
进入20世纪，随着荧光分析仪器的问世，荧光分析的方法和技术得到了极大发展，如今已成为一种重要且有效的光谱分析手段。
荧光分析法的最大优点是灵敏度高，它的检出限通常比分光光度法低2~4个数量级，选择性也较分光光度法好。
虽然能产生强荧光的化合物相对较少，荧光分析法的应用不如分光光度法广泛，但由于它的高灵敏度以及许多重要的生物物质都具有荧光性质。
使得该方法在药物、临床、环境、食品的微量、痕量分析以及生命科学研究各个领域具有重要意义。
二、基本原理(一)分子荧光的产生大多数分子含有偶数电子。
根据保里不相容原理，基态分子的每一个轨道中两个电子的自旋方向总是相反的，因而大多数基态分子处于单重态(2S+1=1)，基态单重态以S0表示。
当物质受光照射时，基态分子吸收光能就会产生电子能级跃迁而处于第一、第二电子激发单重态，以S1、S2表示。
新编仪器分析第四版第三章分子发光分析法
a. 化学反应必须产生足够的化学能，且被发光物质
吸收形成电子激发态。
在紫外可见光区观察化学发光，160~420kJ· mol-1激发能。 化学反应多是在有O3、H2O2等参加的高能反应。
b. 处于激发态分子能够以光的形式释放能量返回基态
45
2.化学发光效率
化学发光效率CL
激发态分子的产率
发射的光子数 CL Ce em 参加反应的分子数 激发态分子数 发射的光子数 参加反应的分子数 激发态分子数
第三章 分子发光分析法
1
第一节 概述 分子发光（molecular luminescence）
某些物质分子吸收能量跃迁到较高的电子激发态后， 返回基态的过程中伴随发光的现象。以此建立的起来 的分析方法很为非自发光分析法。
hγ
M+ 能量 →M＊
M
2
分子发光分析法: 根据物质所发射的光谱线的位置及强度 进行物质鉴定和含量测定的方法。
620
17
二、分子荧光的性质
1、荧光激发光谱
18
（1）激发光谱的绘制
固定第二单色器波长，改变第一单色器波长进行扫描 反映了激发光波长连续变化时，某一固定荧光测定波长强度
的变化。Fλ—纵坐标， λex(激发波长)—横坐标
光源 第一单色器 或滤光片
激发
Fλ
记录仪 荧光
固定em 荧光波长
第二单色器 或滤光片
22
镜像关系?
IF4800
4400
固定em=620nm(MAX)
1→ 4 1→ 3
固定ex=290nm (MAX)
1→4 1→3 1→2
4 3 2 1
S1
4000 3600 3200 2800 2400 2000 1600 1200 800 400
吸收形成电子激发态。
在紫外可见光区观察化学发光，160~420kJ· mol-1激发能。 化学反应多是在有O3、H2O2等参加的高能反应。
b. 处于激发态分子能够以光的形式释放能量返回基态
45
2.化学发光效率
化学发光效率CL
激发态分子的产率
发射的光子数 CL Ce em 参加反应的分子数 激发态分子数 发射的光子数 参加反应的分子数 激发态分子数
第三章 分子发光分析法
1
第一节 概述 分子发光（molecular luminescence）
某些物质分子吸收能量跃迁到较高的电子激发态后， 返回基态的过程中伴随发光的现象。以此建立的起来 的分析方法很为非自发光分析法。
hγ
M+ 能量 →M＊
M
2
分子发光分析法: 根据物质所发射的光谱线的位置及强度 进行物质鉴定和含量测定的方法。
620
17
二、分子荧光的性质
1、荧光激发光谱
18
（1）激发光谱的绘制
固定第二单色器波长，改变第一单色器波长进行扫描 反映了激发光波长连续变化时，某一固定荧光测定波长强度
的变化。Fλ—纵坐标， λex(激发波长)—横坐标
光源 第一单色器 或滤光片
激发
Fλ
记录仪 荧光
固定em 荧光波长
第二单色器 或滤光片
22
镜像关系?
IF4800
4400
固定em=620nm(MAX)
1→ 4 1→ 3
固定ex=290nm (MAX)
1→4 1→3 1→2
4 3 2 1
S1
4000 3600 3200 2800 2400 2000 1600 1200 800 400
第五章 分子发光分析法
s
体系间窜跃（ 不同多重态, 体系间窜跃（ isc ）：不同多重态,有重叠的转动能级间的非辐 射跃迁（ S1→T1跃迁 跃迁） 磷光发射：电子由第一激发三重态 射跃迁（ S1→T1跃迁） 。磷光发射：电子由第一激发三重态 的最低振动能级( =0)跃迁至基态各振动能级 跃迁至基态各振动能级（ T1→S0跃迁 跃迁）。 的最低振动能级(v=0)跃迁至基态各振动能级（ T1→S0跃迁）。 S2 Intersystem Crossing 系间窜跃 S1 磷光发射 Phosphorescence T1
第五章 分子发光分析法
基态分子吸收一定能量后，跃迁至激发态， 基态分子吸收一定能量后，跃迁至激发态，当激 发态分子以辐射跃迁形式将其能量释放返回基态时 分子以辐射跃迁形式将其能量释放返回基态 发态分子以辐射跃迁形式将其能量释放返回基态时， 便产生分子发光 分子发光（ 便产生分子发光（Molecular Luminescence）。 ）。 依据激发的模式不同，分子发光分为光致发光 依据激发的模式不同，分子发光分为光致发光 按激发的类型又可分为荧光和磷光两种）、 荧光和磷光两种）、热致发 （按激发的类型又可分为荧光和磷光两种）、热致发 场致发光和化学发光等 光、场致发光和化学发光等。 本 分子荧光（Molecular Fluorescence）、 分子荧光（ ）、 章 分子磷光（ 分子磷光（Molecular Phosphorescence） ） 化学发光（ 化学发光（Chemiluminescence） ）
S0 λ2 λ1
内转移（ ） 相同多重态的两个电子能级之间 之间（ 内转移（ic） ：相同多重态的两个电子能级之间（如S2 S1,S1 S0）的非辐射跃迁 。 ）
S2 T1 S1
S0 λ2 λ1
分析化学(仪器分析)第五章 分子发光分析法
给电子基团(-OH, -NH2, -NR2, -OR)使共轭体系增 大，导致荧光增强。反之， 吸电子基团(-COOH, NO, -NO2)使荧光减弱。
“重原子效应”--- 随着卤素取代基原子序数的增 加，物质的荧光减弱，磷光增强的现象。 分子中由于重原子的存在导致容易发生系间 窜跃的效应，产生的原因是原子序数高的重原子 的电子自旋和轨道间的相互作用变大，容易发生 自旋偶合作用，使S1－T1的体系间窜跃显著增加 所致。
23
② 静态猝灭（组成化合物的猝灭） 由于部分荧光物质分子与猝灭剂分子生成非荧光 的配合物而产生的。此过程往往还会引起溶液吸收 光谱的改变。 ③ 转入三重态的猝灭（S1—T1–– S0） 分子由于系间的跨越跃迁，由单重态跃迁到三重 态。转入三重态的分子在常温下不发光，它们在与 其它分子的碰撞中消耗能量而使荧光猝灭。 溶液中的溶解氧对有机化合物的荧光产生猝灭效 应是由于三重态基态的氧分子和单重激发态的荧光 物质分子碰撞，形成了单重激发态的氧分子和三重 态的荧光物质分子，使荧光猝灭。
18
（3）环境因素对荧光的影响
a. 溶剂的影响 电子激发态比基态具有更大的极性， 溶剂的极性增强，对激发态会产生更大的 稳定作用，使荧光波长红移，强度增大。 b. 温度的影响 辐射跃迁的速率不随温度而变，而非 辐射跃迁的速率随温度升高而显著增大。 温度升高，使得非辐射跃迁概率增大。 T增大， φf减小
26
如果 固定激发光波长为其 最大激发波长，然后测定 不同的波长时所发射的荧 光或磷光强度，即可得到 荧光或磷光发射光谱曲线。 荧光强度最大时的波长即 为发射波长λem 激发光谱和荧光光谱是荧 光测定时选择激发波长和 荧光测量波长的依据，也 可以用于鉴别荧光物质
27
激发光谱与发射光谱的关系
“重原子效应”--- 随着卤素取代基原子序数的增 加，物质的荧光减弱，磷光增强的现象。 分子中由于重原子的存在导致容易发生系间 窜跃的效应，产生的原因是原子序数高的重原子 的电子自旋和轨道间的相互作用变大，容易发生 自旋偶合作用，使S1－T1的体系间窜跃显著增加 所致。
23
② 静态猝灭（组成化合物的猝灭） 由于部分荧光物质分子与猝灭剂分子生成非荧光 的配合物而产生的。此过程往往还会引起溶液吸收 光谱的改变。 ③ 转入三重态的猝灭（S1—T1–– S0） 分子由于系间的跨越跃迁，由单重态跃迁到三重 态。转入三重态的分子在常温下不发光，它们在与 其它分子的碰撞中消耗能量而使荧光猝灭。 溶液中的溶解氧对有机化合物的荧光产生猝灭效 应是由于三重态基态的氧分子和单重激发态的荧光 物质分子碰撞，形成了单重激发态的氧分子和三重 态的荧光物质分子，使荧光猝灭。
18
（3）环境因素对荧光的影响
a. 溶剂的影响 电子激发态比基态具有更大的极性， 溶剂的极性增强，对激发态会产生更大的 稳定作用，使荧光波长红移，强度增大。 b. 温度的影响 辐射跃迁的速率不随温度而变，而非 辐射跃迁的速率随温度升高而显著增大。 温度升高，使得非辐射跃迁概率增大。 T增大， φf减小
26
如果 固定激发光波长为其 最大激发波长，然后测定 不同的波长时所发射的荧 光或磷光强度，即可得到 荧光或磷光发射光谱曲线。 荧光强度最大时的波长即 为发射波长λem 激发光谱和荧光光谱是荧 光测定时选择激发波长和 荧光测量波长的依据，也 可以用于鉴别荧光物质
27
激发光谱与发射光谱的关系
分子发光分析法
磷光光谱
200 260 320 380 440 500 560 620 室温下菲的乙醇溶液荧（磷）光光谱
3.激发光谱与发射光谱的关系
a.Stokes位移
激发光谱与发射光谱之间的波长差值。发射光谱的波长比
激发光谱的长，振动弛豫消耗了能量。
b.发射光谱的形状与激发波长无关
电子跃迁到不同激发态能级，吸收不同波长的能量(如能级
非光谱分析法
光谱分析法
折 射 法
圆 二 色 性 法
X 射 线 衍 射 法
干 涉 法
旋 光 法
原子光谱分析法
原 子 吸 收 光 谱
原 子 发 射 光 谱
原 子 荧 光 光 谱
X 射 线 荧 光 光 谱
分子光谱分析法
分分核 紫红子子磁 外外荧磷共 光光光光振 谱谱光光波 法法谱谱谱
法法法
各种光分析法
1. 原子发射光谱分析法 以火焰、电弧、等离子炬等作为光源，使气态原子
反跃迁的几率也越大，即产生的光谱呈镜像对称。
荧光激发光谱
荧光发射光谱
200 250 300 350 400 450 500 nm
蒽的激发光谱和荧光光谱
三、荧光的产生与分子结构的关系
relation between fluorescence and molecular structure
1.分子产生荧光必须具备的条件
（1）具有合适的结构：分子必须具有与所照射的辐射频率相
适应的结构, 才能吸收激发光； （2）具有一定的荧光量子产率。荧光量子产率也叫荧光效率 或量子效率，它表示物质发射荧光的能力，通常用下式表示
荧光量子产率（）： 发射的光量子数
吸收的光量子数
在产生荧光的过程中，涉及到许多辐射和无辐射跃迁过程， 如荧光发射、内转移、系间跨跃和外转移等。因此，荧光的 量子产率，将与上述每一个过程的速率常数有关。 如外转换过程速度快，不出现荧光发射。
分子发光分析法(精)
（3） 间接测定某些生物试样
氨基酸 + O2
葡萄糖氧化酶 氨基酸氧化酶
酮酸 +NH3 + H2O2
葡萄糖 + O2 + H2O 葡萄糖酸 + H2O2 通过测定生成的H2O2 ，确定氨基酸、葡萄糖含量。
2018/9/16
草酸二酯(能量提供体)+高浓度双氧水+稠环芳烃(能量接
pH7 - 8
复合物与氧反应，产生化学发光： AMP·LH2 ·E + O2 [氧化荧光素]* + AMP+CO2 + H2O
[氧化荧光素]* 氧化荧光素 + h
最大发射波长562nm；
2018/9/16
生物发光分析应用 2
烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)在细菌中的黄素酶作用 下，在氧化型黄素单核苷酸(FMA)存在下，发生发光反应 ： NADH + FMA + H+ NAD+ + FMNH2 FMNH2 + RCHO + O2 FMN + RCOOH + H2O + h
受体)+金属离子+溶剂组成的反应体系，可发出很强的可见光 ，发光效率高，使用不同的稠环芳烃，发射出不同颜色的光( 冷光源)。
2018/9/16
பைடு நூலகம்
生物发光分析应用 1
在pH 7～8；荧光素酶(E)和Mg2+的存在下，荧光素 (LH2)与磷酸三腺甙(ATP)的反应，生成磷酸腺甙(AMP)荧光 素和荧光素酸的复合物和镁的焦磷酸盐(ppi)： ATP + LH2 + E + Mg2+ AMP·LH2 ·E +Mg ppi + 2H+
分子发光分析法与分子
分子发光分析法与分子
分子发光分析法是一种分子生物学分析技术，该技术利用激发和荧光等光学原理，可准确、灵敏地检测某一特定识别序列的DNA或RNA，根据检测结果用于病原
体的鉴定、对感染过程的追踪及毒素的检测等方面的实验。
首先，分子发光分析是一种特殊的酶联免疫吸附实验，通过向样品中添加放射
性标记的双链DNA探针，由特定酶解离双链，探针与核酸结合，可以检测出特定序列的DNA或RNA。
使用这一技术，可以追踪影响基因表达和变异的基因或基因产物。
其次，分子发光分析法还可以用于检测DNA片段和品种变异，从而便于理解特
定基因之间的关系，以及定义物种在进化过程中的节点。
通过研究其他物种的变化，可以让科学家更好地了解人类的进化和免疫过程。
综上所述，分子发光分析法在病原体鉴定、追踪感染过程、毒素检测和基因变
异检测等科学研究中发挥着重要作用。
同时，由于分子发光分析法检测精准、信息丰富，已经成为全球多学科研究的重要手段之一。
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S1 S2
T1
比分子吸收的能量小
λ
3
>λ
2
>λ
1
S0 吸光1 吸光2
荧光3
荧光
11
磷光发射:
S1
电子由基态单重态激发至第一 激发三重态的几率很小，因为这 是禁阻跃迁。 但是，由第一激发单重态的最 低振动能级，有可能以系间窜跃 方式转至第一激发三重态，再经 过振动驰豫，转至其最低振动能 级，由此激发态跃回至基态时，S0 便发射磷光，
S1 S2 T1
S0 吸光1 吸光2 9
S1
系间窜跃:
S2
T1
指不同多重态间 的无辐射跃迁， 例如S1→T1就是一 种系间窜跃。 通常，发生系间 窜跃时，电子由S1 的较低振动能级转 移至T1的较高振动 能级处。
10
S0 吸光1 吸光2 荧光3
辐射能量传递过程 荧光发射: 电子由第一激发单重态的最低振动能级→基态 得到最大波长为λ 3的荧光 由图可见，发射荧光的能量
① 分子必须具有与所照射的辐射频率(紫外-可 见光）相适应的结构(π→π*和n→π*); 才能吸收 激发光； ② 吸收了与其本身特征频率相同的能量之后， 必须具有一定的荧光量子产率。
20
1.荧光效率
它表示物质发射荧光的能力，通常用下式表示
f
发荧光的分子数 激发分子的总数
Kf Kf
荧光效率越高； 物质发射荧光越强
荧光是由激发单重态最低振动能层至基态
区别
磷光是由激发三重态最低振动能层至基态
13
(二 )荧光的激发光谱和发射光谱
激发光谱:(ex)
以不同波长的入射光激发荧光物质,在荧 光最强的波长处测量荧光强度 即以激发光波长为横坐标,以荧光强度为 纵坐标绘制曲线即可得到激发光谱曲线。
发射光谱：(em)
固定激发光波长（最大） 然后测定不同的波长时所发射的荧光强度 即可绘制荧光发射光谱曲线
440
500
560
620
17
λቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
室温下菲的乙醇溶液荧（磷）光光谱
激发光谱与发射光谱的关系
a. Stokes位移 激发光谱与发射光谱之间的波长差值。发射光谱的波
长比激发光谱的长，由于振动弛豫、内转化消耗了能量
b. 发射光谱的形状与激发波长无关 电子跃迁到不同激发态能级，吸收不同波长的能量(如 能级图2, 1)，产生不同吸收带，但均回到第一激发单重 态的最低振动能级再跃迁回到基态，产生波长一定的荧
f
Ki
kf为荧光发射过程的速率常数（与化学结构有关） ki为其它有关过程的速率常数的总和（化学环境）
凡使kf 值升高而使ki值降低的因素，都可增强荧光。
21
2. 荧光与有机化合物结构的关系 （1）跃迁类型 实验证明，对于大多数荧光物质，首先经历 激发，然后经过振动弛豫或其他无辐射 跃迁，再发生 跃迁而得到荧光。 （2）共轭效应 实验证明，容易实现激发 的芳香族化合物 容易发生荧光，增加体系的共轭度荧光效率一般 也将增大，主要是由于增大荧光物质的摩尔吸光 系数，有利于产生更多的激发态分子
S2
T1
吸光1
吸光2 荧光3
磷光
这个跃迁过程（T1→S0）也是 自旋禁阻的，其发光速率较慢， 约为10-4-10s。因此，这种跃迁所 发射的光，在光照停止后，仍可 持续一段时间。
磷光
12
猝灭 指激发分子与溶剂分子或其它溶质分子 的相互作用及能量转移，使荧光或磷光强 度减弱甚至消失。这一现象称为“熄灭” 或“猝灭”。 荧光与磷光的根本区别：
仪器分析
原子吸收
原子光谱 原子发射 原子荧光 光谱分析 分子吸收 分子光谱 分子发光 红外光谱 紫外-可见光谱
2
第八章 分子发光分析法
分子
吸收能量
激发为激发态
释放出能量
基态
辐射跃迁 电能 化学能 光能
光的形式释放
非辐射跃迁
以热的形式释放
称为“发光” 光致发光 分子发光 荧光 磷光
3
化学发光
分子荧光/磷光分析法 一、基本原理 （一）荧光和磷光的产生 从分子结构理论来讨论 振动能级
14
激发光谱和荧光光谱
F
激发光谱 荧光光谱
max λ ex
max λ em
λ nm
在荧光的产生过程中，由于存在各种形 式的无辐射跃迁，损失能量，所以它们的 最大发射波长都向长波方向移动，以磷光 波长的移动最多，而且它的强度也相对较 弱。
16
F 激发光谱
荧光发射光谱
磷光光谱
200
260
320
380
7
非辐射能量传递过程；
S1
S2
T1
振动弛豫:
在同一电子能级 中，电子由高振 动能级转至低振 动能级，而将多 余的能量以热 的 形式发出。发生
S0
振动弛豫的时 间为10-12s数量 级。
吸光1
吸光2
8
内转移:
当两个电子能级非常靠近以至其振动能级有重 叠时， 常发生电子由高能级以无辐射跃迁方式转移至低能级。 （S1 转移 S2）
激发单重态S与激发三重态T的不同点：
⑴ S是抗磁分子(磁矩=0)，T是顺磁分子(磁矩≠0)
⑵ tS = 10-8s, tT = 10-4～1s；(发光速度很慢)
⑶ 基态单重态到激发单重态的激发为允许跃迁，
基态单重态到激发三重态的激发为禁阻跃迁；
⑷ 激发三重态的能量较激发单重态的能量低
5
荧
光 的 产 生
光 c. 镜像规则
通常荧光发射光谱与它的吸收光谱（与激发光谱形状 一样）成镜像对称关系。
18
镜像规则的原因
基态上的各振动能级
分布与第一激发态上的各
振动能级分布类似； 基态上的零振动 能级与第一激发态的
二振动能级之间的跃
迁几率最大，相反跃 迁也然。
（三）荧光的影响因素 分子产生荧光必须具备两个条件：
激发态分子
辐射跃迁 无辐射跃迁
荧 光
磷 光
猝 灭
内 转 换
系 间 跨 越
振动 弛 豫
受激发分子的去活化过程
2．分子内的光物理过程
其中S0、S1和S2分别表示分子的基态、第一和第二电子激发的单重态
T1和T2则分别表示分子的第一和第二电子激发的三重态。 V=0、1、2、3、…表示基态和激发态的振动能级。
22
(3) 刚性平面结构
实验发现，多数具有刚性平面结构的 有机分子具有强烈的荧光。 因为这种结构可以减少分子的振动， 使分子与溶剂或其它溶质分子的相互作用 减少，也就减少了碰 撞去活的可能性。
电子所处的能级
分子中电子 的能量状态
电子的多重态
转动能级
S=0, J=1 单重态S表示
（所有电子都是自旋配对的）
J=2S+1
S：为各电子自旋量子 数的代数和
大多数基态分子都处于单重态 三重态 T表示 电子在跃迁过程中伴随着
4 自旋方向的变化（自旋平行）
S=1, J=3
基态单重态S
激发态单重态S
激发态三重态T
T1
比分子吸收的能量小
λ
3
>λ
2
>λ
1
S0 吸光1 吸光2
荧光3
荧光
11
磷光发射:
S1
电子由基态单重态激发至第一 激发三重态的几率很小，因为这 是禁阻跃迁。 但是，由第一激发单重态的最 低振动能级，有可能以系间窜跃 方式转至第一激发三重态，再经 过振动驰豫，转至其最低振动能 级，由此激发态跃回至基态时，S0 便发射磷光，
S1 S2 T1
S0 吸光1 吸光2 9
S1
系间窜跃:
S2
T1
指不同多重态间 的无辐射跃迁， 例如S1→T1就是一 种系间窜跃。 通常，发生系间 窜跃时，电子由S1 的较低振动能级转 移至T1的较高振动 能级处。
10
S0 吸光1 吸光2 荧光3
辐射能量传递过程 荧光发射: 电子由第一激发单重态的最低振动能级→基态 得到最大波长为λ 3的荧光 由图可见，发射荧光的能量
① 分子必须具有与所照射的辐射频率(紫外-可 见光）相适应的结构(π→π*和n→π*); 才能吸收 激发光； ② 吸收了与其本身特征频率相同的能量之后， 必须具有一定的荧光量子产率。
20
1.荧光效率
它表示物质发射荧光的能力，通常用下式表示
f
发荧光的分子数 激发分子的总数
Kf Kf
荧光效率越高； 物质发射荧光越强
荧光是由激发单重态最低振动能层至基态
区别
磷光是由激发三重态最低振动能层至基态
13
(二 )荧光的激发光谱和发射光谱
激发光谱:(ex)
以不同波长的入射光激发荧光物质,在荧 光最强的波长处测量荧光强度 即以激发光波长为横坐标,以荧光强度为 纵坐标绘制曲线即可得到激发光谱曲线。
发射光谱：(em)
固定激发光波长（最大） 然后测定不同的波长时所发射的荧光强度 即可绘制荧光发射光谱曲线
440
500
560
620
17
λቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
室温下菲的乙醇溶液荧（磷）光光谱
激发光谱与发射光谱的关系
a. Stokes位移 激发光谱与发射光谱之间的波长差值。发射光谱的波
长比激发光谱的长，由于振动弛豫、内转化消耗了能量
b. 发射光谱的形状与激发波长无关 电子跃迁到不同激发态能级，吸收不同波长的能量(如 能级图2, 1)，产生不同吸收带，但均回到第一激发单重 态的最低振动能级再跃迁回到基态，产生波长一定的荧
f
Ki
kf为荧光发射过程的速率常数（与化学结构有关） ki为其它有关过程的速率常数的总和（化学环境）
凡使kf 值升高而使ki值降低的因素，都可增强荧光。
21
2. 荧光与有机化合物结构的关系 （1）跃迁类型 实验证明，对于大多数荧光物质，首先经历 激发，然后经过振动弛豫或其他无辐射 跃迁，再发生 跃迁而得到荧光。 （2）共轭效应 实验证明，容易实现激发 的芳香族化合物 容易发生荧光，增加体系的共轭度荧光效率一般 也将增大，主要是由于增大荧光物质的摩尔吸光 系数，有利于产生更多的激发态分子
S2
T1
吸光1
吸光2 荧光3
磷光
这个跃迁过程（T1→S0）也是 自旋禁阻的，其发光速率较慢， 约为10-4-10s。因此，这种跃迁所 发射的光，在光照停止后，仍可 持续一段时间。
磷光
12
猝灭 指激发分子与溶剂分子或其它溶质分子 的相互作用及能量转移，使荧光或磷光强 度减弱甚至消失。这一现象称为“熄灭” 或“猝灭”。 荧光与磷光的根本区别：
仪器分析
原子吸收
原子光谱 原子发射 原子荧光 光谱分析 分子吸收 分子光谱 分子发光 红外光谱 紫外-可见光谱
2
第八章 分子发光分析法
分子
吸收能量
激发为激发态
释放出能量
基态
辐射跃迁 电能 化学能 光能
光的形式释放
非辐射跃迁
以热的形式释放
称为“发光” 光致发光 分子发光 荧光 磷光
3
化学发光
分子荧光/磷光分析法 一、基本原理 （一）荧光和磷光的产生 从分子结构理论来讨论 振动能级
14
激发光谱和荧光光谱
F
激发光谱 荧光光谱
max λ ex
max λ em
λ nm
在荧光的产生过程中，由于存在各种形 式的无辐射跃迁，损失能量，所以它们的 最大发射波长都向长波方向移动，以磷光 波长的移动最多，而且它的强度也相对较 弱。
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F 激发光谱
荧光发射光谱
磷光光谱
200
260
320
380
7
非辐射能量传递过程；
S1
S2
T1
振动弛豫:
在同一电子能级 中，电子由高振 动能级转至低振 动能级，而将多 余的能量以热 的 形式发出。发生
S0
振动弛豫的时 间为10-12s数量 级。
吸光1
吸光2
8
内转移:
当两个电子能级非常靠近以至其振动能级有重 叠时， 常发生电子由高能级以无辐射跃迁方式转移至低能级。 （S1 转移 S2）
激发单重态S与激发三重态T的不同点：
⑴ S是抗磁分子(磁矩=0)，T是顺磁分子(磁矩≠0)
⑵ tS = 10-8s, tT = 10-4～1s；(发光速度很慢)
⑶ 基态单重态到激发单重态的激发为允许跃迁，
基态单重态到激发三重态的激发为禁阻跃迁；
⑷ 激发三重态的能量较激发单重态的能量低
5
荧
光 的 产 生
光 c. 镜像规则
通常荧光发射光谱与它的吸收光谱（与激发光谱形状 一样）成镜像对称关系。
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镜像规则的原因
基态上的各振动能级
分布与第一激发态上的各
振动能级分布类似； 基态上的零振动 能级与第一激发态的
二振动能级之间的跃
迁几率最大，相反跃 迁也然。
（三）荧光的影响因素 分子产生荧光必须具备两个条件：
激发态分子
辐射跃迁 无辐射跃迁
荧 光
磷 光
猝 灭
内 转 换
系 间 跨 越
振动 弛 豫
受激发分子的去活化过程
2．分子内的光物理过程
其中S0、S1和S2分别表示分子的基态、第一和第二电子激发的单重态
T1和T2则分别表示分子的第一和第二电子激发的三重态。 V=0、1、2、3、…表示基态和激发态的振动能级。
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(3) 刚性平面结构
实验发现，多数具有刚性平面结构的 有机分子具有强烈的荧光。 因为这种结构可以减少分子的振动， 使分子与溶剂或其它溶质分子的相互作用 减少，也就减少了碰 撞去活的可能性。
电子所处的能级
分子中电子 的能量状态
电子的多重态
转动能级
S=0, J=1 单重态S表示
（所有电子都是自旋配对的）
J=2S+1
S：为各电子自旋量子 数的代数和
大多数基态分子都处于单重态 三重态 T表示 电子在跃迁过程中伴随着
4 自旋方向的变化（自旋平行）
S=1, J=3
基态单重态S
激发态单重态S
激发态三重态T