第十七章生化药物与生物制品分析概论

这类药物中含有大量抗体，注入体内不 需自身制造抗体就可以获得免疫力。只能作 为应急措施，排泄时间快，预防时间短。
（三）血液制品
由健康人血浆或经特异免疫的人血浆， 经分离、提纯或由DNA重组技术制成的血 浆蛋白制品及血液细胞有形成分统称为血 液制品。如人血白蛋白、人凝血因子等。
（四）重组DNA制品
第十七章 生化药物 与生物制品分析概论
第一节 概述
一、生物药物
生物药物（biopharmaceutics或 biopharmaceuticals）是指利用生物体、生物组 织或组成生物体的各种成分，综合运用生物学、 生物化学、微生物学、免疫学、物理化学和药 学的原理与方法制得的一大类药物。
生物药物按来源和生产方法分为： 生化药物、生物制品和其他相关
含10 mg的溶液，取20 µl，加0.2 mol/L三羟甲基氨基 甲烷-盐酸缓冲液（pH7.3）20 µl、0.1% V8酶溶液20 µl与水140 µl，混匀，置37℃水浴中2小时后，加磷酸 3 µl，作为供试品溶液；另取猪胰岛素对照品适量， 同法制备，作为对照品溶液。照含量测定项下的色谱
条件，以0.2 mol/L硫酸盐缓冲液（pH 2.3）-乙腈 （90∶10）为流动相A，乙腈-水（50∶50）为流动相 B，按下表进行梯度洗脱。取对照品溶液和供试品溶 液各25 µl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，供试 品溶液的肽图谱应与对照品溶液的肽图谱一致。
（二）酶分析法
酶能专一、高效地催化某化学反应， 通过测定酶反应速度或生成物浓度而检 测供试品含量。
1. 酶活力测定法 以酶为分析对象。
酶活力： 指酶催化化学反应的能力，即测
定被酶催化的化学反应的速率。
单位时间内底物减少或产物增加
酶活力单位： 酶在25ºC下，以最合适的底物浓度、
缓冲液离子强度和pH条件下，每分钟能转 化1mol底物的酶量为一个活性单位。
（3）本品的红外光吸收图谱应与对照的图谱（光 谱集478 图）一致。
胰岛素
【鉴别】（1）在含量测定项下记录的色谱图中， 供试品溶液主峰的保留时间应与对照品溶液主 峰的保留时间一致。——HPLC
盐酸组氨酸的鉴别：
取本品与盐酸组氨酸对照品各适量，分别加水溶 解并稀释制成每1 ml中约含0.4 mg的溶液，作为供试 品溶液与对照品溶液。照薄层色谱法（通则0502） 试验，吸取上述两种溶液各2 µl，分别点于同一硅胶 G薄层板上，以正丁醇-冰醋酸-水（0.95∶1∶1）为 展开剂，展开，晾干，喷以茚三酮的丙酮溶液 （150），在80C加热至斑点出现，立即检视。供 试品溶液所显主斑点的位置和颜色应与对照品溶液 的主斑点相同。
四、含量（效价）测定
（一）理化分析法
1. 容量分析法
盐酸组氨酸 缩合后酸碱滴定法
取本品0.2g，精密称定，加水5ml溶解后， 加甲醛与乙醇的中性混合溶液，加酚酞指示液 数滴，用氢氧化钠滴定液（0.1mol/L）滴定。每 1 ml氢氧化钠滴定液（0.1 mol/L）相当于10.48 mg的C6H9N3O2·HCl·H2O。
2. 电泳法
ChP 采用琼脂糖凝胶电泳法鉴别肝素钠乳膏： 取本品适量（约相当于肝素钠700单位），加60%乙
醇溶液10 ml，水浴加热使溶解，于4℃的冰箱中放置 约5小时，取出，滤过，取滤液作为供试品溶液。另取 肝素钠标准品，加水溶解并制成每1 ml中含200单位的
标准品溶液。取标准品溶液与供试品溶液各2 l，照电
第三节 生物制品分析
生物制品（biological products）指以微生 物、细胞、动物或人源组织和体液等为起始原 材料，用生物学技术制成，用于预防、治疗和 诊断人类疾病的制剂，如疫苗、血液制品、生 物技术药物、微生态制剂、免疫调节剂、诊断 制品等。ChP2015三部收载生物制品137种。
一、生物制品的种类 （一）疫苗类
2. 紫外-可见分光光度法
五肽胃泌素分子结构中具有较多羰酰基 和酰胺基，在280 nm波长处有最大吸收， ChP采用UV法测定含量，吸收系数法定量。
3. HPLC法 具有温和的分析条件与良好的生
物兼容性，有利于保持生物大分子的 构象和生理活性，广泛用于生化药物 的含量测定。
（1）反相高效液相色谱法 （2）离子抑制色谱法 （3）离子对色谱法 （4）离子色谱法 （5）分子排阻色潽法
（二）多肽和蛋白质
多肽类：五肽胃泌素、生长抑素、胸腺五肽、胸 腺法新、鲑降钙素、醋酸丙氨瑞林、醋酸奥曲肽、 醋酸去氨加压素、醋酸曲普瑞林等；
蛋白质类：胰岛素、硫酸鱼精蛋白、重组人胰岛
素、重组人生长激素等。
（三）酶类与辅酶类药物 辅酶Q10、胃蛋白酶、凝血酶等
（四）多糖类药物 肝素、硫酸软骨素钠、灵芝多糖、透明质
比活性：
比活性

效价单位数 蛋白的mg数
2. 酶法分析 以酶为分析试剂或工具。
（三）生物检定法
生物检定法是利用生物体包括整体动物、离体 组织、器官、细胞和微生物评价药物生物活性的一 种方法。它以药物的药理作用为基础，以生物统计 为工具，运用特定的实验设计在一定条件下比较供 试品和相应的标准品或对照品所产生的特定反应， 通过等反应剂量间比例的运算或限值剂量引起的生 物反应程度，从而测定供试品的效价、生物活性或 杂质引起的毒性。
（二）安全性检查
1. 热原与细菌内毒素检查法
热原：家兔法 细菌内毒素：鲎试剂法
2. 异常毒性检查法
试验动物：小鼠
3. 过敏反应检查
检查药物中的异性蛋白。 试验动物：豚鼠
4. 降压物质检查法
检查药物中可能导致血压降低的杂质。 检查方法：猫血压法 猫 注 射药液观察血压下降程度
5. 无菌检查
细菌类疫苗（如狂犬病疫苗）、病毒类 疫苗（如乙肝疫苗）、联合疫苗（如百白破 疫苗）、双价及多价疫苗（双价肾综合征出 血热灭活疫苗）。
（二）抗毒素及抗血清类药物
凡用细菌类毒素或毒素免疫马或其他大动 物所取得的免疫血清叫抗毒素或抗血清。如 破伤风抗毒素等。
凡用细菌或病毒本身免疫马或其他大动物 所取得的免疫血清叫抗菌或抗病毒血清，如 抗蝮蛇毒血清等。
（四）肽图检查法
肽图检查法是通过蛋白酶或化学物质裂解 蛋白质后，采用适宜的分析方法鉴定蛋白质一 级结构的完整性和准确性。
ChP通则3405肽图检查法共收载二法， 第一法为胰蛋白酶裂解-反相高效液相色谱 法，第二法为溴化氰裂解-SDS-聚丙烯酰胺 凝胶电泳法。
胰岛素的鉴别 ChP 取本品适量，用0.1%三氟醋酸溶液制成每1 ml中
（二）生化鉴别法
1. 酶法
如尿激酶的鉴别。尿激酶是专属性较强的蛋白 水解酶，根据尿激酶能激活牛纤维蛋白溶酶原，使 其转化成纤维蛋白溶酶，纤维蛋白溶酶具有较强的 蛋白水解酶能力，而纤维蛋白原在凝血酶的作用下， 转变成纤维蛋白凝块，此凝块在纤维蛋白溶酶作用 下，水解为可溶性的小分子多肽，直接观察溶解纤 维蛋白作用的气泡上升法作为判断指标。
三、生化药物的检查
生化制药主要有六个阶段：（1）原料的选 择和预处理；（2）组织及细胞的破碎；（3） 从破碎的细胞中提取有效成分制成粗品；（4） 采用多种生化技术从粗品中将目的物精制出 来；（5）干燥及保存；（6）制剂。
（一）杂质检查
1. 氨基酸类药物中其他氨基酸的检查 2. 多肽类药物中特殊杂质的检查 3. 蛋白类药物中有关蛋白的检查 4. 酶类药物中其他酶的检查 5. 多糖类药物中分子量与分子量分布的检查
尿激酶
【鉴别】取本品适量，用巴比妥-氯化钠缓冲液 （pH7.8）稀释制成每1 ml含20单位的溶液，吸取1ml， 加牛纤维蛋白原溶液0.3 ml，再依次加入牛纤维蛋白 溶酶原溶液0.2 ml与牛凝血酶溶液0.2 ml，迅速摇匀， 立即置37℃0.5℃恒温水浴中保温，立即计时。应在 30~45秒内凝结，且凝块在15分钟内重新溶解。以 0.9% 氯化钠溶液作空白，同法操作，凝块在2小时内 不溶。
采用遗传修饰，将所需制品的编码DNA 通过一种质粒或病毒载体，引入适宜的微 生物或细胞系，DNA经过表达和翻译后成 为蛋白质，再进行提取和纯化而回收所需 制品制得。如重组人表皮生长因子。
（五）微生态活菌制品
4. 安全性检查
此类药物性质特殊，生产工艺复杂，易 引入生理活性杂质，故需要进行安全性的 检查。
如注射用重组人干扰素α2b原液中要检 查外源性DNA残留量，鼠IgG残留量，宿 主菌蛋白残留量、残余抗生素活性等。
5. 需做效价（含量）测定
生物药物质量控制与化学药物基本一致， 包括性状、鉴别、检查和含量测定；但也不尽 相同，特别是生物制品，在均一性、有效性、 安全性和稳定性等方面有严格要求，必须对其 进行原材料、生产过程（包括培养和纯化工艺 过程）和最终产品的全过程质量控制。
酸、黄芪多糖、人参多糖等 （五）核酸与核苷酸类药物
ATP、氟尿嘧啶、肌苷等
二、鉴别试验 （一）理化鉴别法
理化鉴别法包括化学鉴别法、光谱 鉴别法和色谱鉴别法。
ChP2015硫唑嘌呤的鉴别：
（1）取本品约5 mg ，加盐酸（1→2）1 ml溶解后， 加碘试液数滴，即产生棕色沉淀。
（2）取本品约10 mg，加2 mol/L盐酸溶液使溶解并 稀释至100 ml，摇匀，取5 ml，用水稀释至50 ml，摇 匀，照紫外-可见分光光度法（通则0401）测定，在 280 nm的波长处有最大吸收。
第二节 生化药物分析
生化药物是从生物体分离纯化或用化学合 成、微生物合成或现代生物技术制得的生化 基本物质。 特点：
1. 是生物体内的基本生化成分 2. 来自生物体，来源复杂，有些结构不明确， 相对分子量不是定值，多属于高分子物质。
一、生化药物的种类
（一）氨基酸及其衍生物
各种单氨基酸、氨基酸衍生物和复合氨基酸。
根据胰岛素的降血糖作用，利用小鼠的惊厥 反应来鉴别胰岛素：
小鼠 （胰降岛血素糖大 ）量 惊厥
葡萄糖
惊厥停止
胰岛素 取本品适量，加用酸调节至pH值为2.5～3.0
的水制成每1 ml中含5单位的溶液。在20~30℃ 条件下，取体重为20~24 g的小鼠5只，按每20 g体重皮下注射上述溶液0.25 ml，注射2小时 后，至少应有4只小鼠发生惊厥。立即给惊厥 的小鼠腹腔注射10％葡萄糖液1 ml，应能使惊 厥停止。
ChP2015玻璃酸酶的鉴别：
取健康豚鼠1只，分别于背部两处，皮内注射 0.25%亚甲蓝的氯化钠注射液0.1 ml，作为对照，另 两处皮内注射用上述溶液制成的每1 ml 中含本品10 单位的溶液0.1 ml， 四处注射位置须交叉排列，源自文库 互间的距离应大于 3 cm，注射后 5分钟，处死动物， 将皮剥下，自反面观察亚甲蓝的扩散现象，供试品 溶液所致的蓝色圈应大于对照品溶液所致的蓝色圈。
泳法（通则0541 第三法）试验，供试品溶液与对照品 溶液所显斑点的迁移距离的比值应为0.9～1.1。
（三）生物鉴别法
利用生物体对药物的反应来鉴别药物。鉴 别通常需要标准品或对照品在同一实验条件 下进行对照试验加以确证。
如玻璃酸酶的鉴别。玻璃酸酶为蛋白分解酶，可促 使皮下输液或局部积贮的渗出液和血液的扩散，以利 于吸收，因此玻璃酸酶的鉴别是根据扩散作用。利用 结缔组织中的玻璃酸具有较大的黏滞性，对体液扩散 有阻滞作用，在动物皮内注射玻璃酸酶，通过对黏多 糖玻璃酸的解聚作用，能加速染色剂亚甲蓝的扩散和 吸收，使皮内注射的亚甲蓝和玻璃酸酶的蓝色圈大于 单独注射亚甲蓝的蓝色圈。
组成、N端氨基酸序列、肽图等方法加 以证实。
如注射用重组人干扰素α1b的原液检定： 除理化分析外，按规定进行肽图检查，
至少每年测定一次产品N端氨基酸序列。
3. 生物活性检查
质量不稳定，特别是制备多肽或蛋白质 类药物时，因生产工艺条件的变化，导致 失活。故需要进行生物活性的检查。
如注射用重组人干扰素α2a的原液检定 要进行生物学活性的检查。
生物医药产品。
二、生物药物分析的特点
1. 相对分子质量的测定
生物药物中除氨基酸、核苷酸等为小分子化 合物，其他如蛋白质、多糖、核酸均为大分子 的生命物质，相对分子量大，不是定值。即使 组分相同，往往由于分子量不同而产生不同的 生理活性（如肝素），故要进行相对分子质量 的测定。
2. 生化法结构确证 常需要选择生物化学分析如氨基酸