水稻转基因实验方法与步骤
水稻转基因组织培养步骤
农杆菌介导的转化一．试剂1 6-BA (6-BenzylaminoPurine) Sigma Cat No. B-58982 KT (Kinetin) Sigma Cat No. K-07533 NAA (Napthalene acetic acid) Sigma Cat N-06404 IAA (Indole-3-acetic acid) Sigma Cat No. I-51485 2,4-D (2,4-Dichlorophenoxyacetic acid) Sigma Cat No. D-84076 Kanamycin USB Cat No. 179247 CH (Casein Enzymatic Hydrolysate) Sigma Cat No. C-72908 Hn (hygromycin B) GiBco BRL Cat No. 10687-0109 Cn (Carbenicillin) 国产分装10 Nicotinic acid Sigma Cat No. N-076511 Pyridoxine HCl Sigma Cat No. P-866612 Thiamine HCl Sigma Cat No. T-390213 Inositol Sigma Cat No. I-301114 Phytagel Sigma Cat No. P-816915 Dimethyl Sulfoxide-DMSO Sigma Cat No. D-587916 X-gluc (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-D-galactoside) Sigma Cat No. B-378317 AS (Acetosringone) Aldrich chem., CO 01531 EG二．溶液1.MS maxNH4NO316.5gKNO319.0gKH2PO4 1.7gMgSO4∙7H2O 3.7gCaCl2∙2H2O 4.4g 或CaCl2 3.32g逐一溶解药品后，加dH2O定容到1000ml。
转基因水稻培育实验报告
一、实验目的本实验旨在通过基因工程技术，将具有特定功能的基因导入水稻中，培育出具有抗病、抗虫、抗逆等优良性状的转基因水稻，为我国水稻育种提供新的途径。
二、实验原理转基因技术是指将外源基因导入目标生物体基因组中，使目标生物体获得新的性状或功能。
本实验采用农杆菌介导法将目的基因导入水稻中，通过基因重组，使水稻获得抗病、抗虫、抗逆等优良性状。
三、实验材料1. 水稻品种：Oryza sativa L.（籼稻）2. 抗病基因：Xa213. 抗虫基因：Bt蛋白基因4. 抗逆基因：海藻糖合成酶基因5. 农杆菌：Agrobacterium tumefaciens EHA1056. 实验试剂：限制酶、DNA连接酶、质粒、抗生素等四、实验方法1. 目的基因的克隆与构建（1）从基因库中获取抗病基因Xa21、抗虫基因Bt蛋白基因和抗逆基因海藻糖合成酶基因的DNA序列。
（2）利用PCR技术扩增目的基因。
（3）将扩增的目的基因与载体质粒连接，构建重组质粒。
2. 农杆菌转化（1）将重组质粒转化农杆菌EHA105。
（2）将转化后的农杆菌接种于含有抗生素的培养基中，筛选阳性克隆。
3. 转化水稻（1）将阳性农杆菌接种于含有抗生素的培养基中，培养至对数生长期。
（2）将农杆菌与水稻叶片接触，进行转化。
4. 筛选转基因植株（1）将转化后的水稻苗移栽至田间，进行抗性鉴定。
（2）根据抗性表现，筛选出转基因植株。
5. 分子鉴定（1）提取转基因植株的DNA。
（2）利用PCR技术检测目的基因是否整合到水稻基因组中。
五、实验结果1. 成功构建了含有抗病基因Xa21、抗虫基因Bt蛋白基因和抗逆基因海藻糖合成酶基因的重组质粒。
2. 转化后的农杆菌能够将目的基因导入水稻中。
3. 通过抗性鉴定，筛选出具有抗病、抗虫、抗逆等优良性状的转基因水稻。
4. 分子鉴定结果显示，目的基因已整合到水稻基因组中。
六、实验结论本实验成功培育出具有抗病、抗虫、抗逆等优良性状的转基因水稻，为我国水稻育种提供了新的途径。
转基因水稻中间试验要求
转基因水稻中间试验要求
1.实验目的和设计：中间试验应明确实验目的，并且在试验设
计中包括转基因水稻的基因转导方法、检测方法、结果分析等。
2.样本获取和处理：中间试验应使用符合转基因水稻要求的样本，包括转基因水稻种子、培养细胞等。
在样本处理过程中，应按照转基因水稻的特点，采取适当的处理方法。
3.环境监测和管理：在中间试验过程中，应监测和管理试验环境，包括温度、湿度、光照等条件的控制，以及病虫害防治等。
4.基因检测和分析：中间试验应使用准确的基因检测方法，确
认转基因水稻中是否成功转导了目标基因。
此外，还需要对转基因水稻的性状、产量、抗病虫性等进行分析。
5.安全评估和风险评估：中间试验还需要对转基因水稻的安全
性和风险进行评估，包括对人类、动物和环境等方面的影响评估。
6.试验记录和数据分析：中间试验应详细记录试验过程中的各
项数据，并进行统计和分析，以验证试验结果的有效性和可靠性。
7.伦理审查和法律合规：中间试验应符合伦理审查和法律法规
的要求，确保试验过程符合科学伦理和法律要求。
以上是转基因水稻中间试验的一些基本要求，具体要求还可以根据实验具体情况和法律法规的要求进行确定。
转基因水稻的原理
转基因水稻的原理
转基因水稻的原理是通过将具有特定基因的外源DNA导入到水稻细胞中，并使其正常表达，在水稻中产生所需的特定性状。
转基因水稻的原理主要包括以下几个步骤：
1. 基因选择：选择具有所需特性的基因，这些基因可以来自同一物种或其他物种。
例如，选择具有抗虫性、抗草木得、耐盐碱等性状的基因。
2. 基因克隆：将选定的基因从其原始来源中克隆出来，通常使用PCR等分子生物学技术来扩增目标基因序列。
3. 插入载体：将目标基因插入携带基因转移所需的DNA片段的载体中。
常用的载体是冠状病毒、细菌或酵母等。
4. 基因转移：将插入载体的基因导入到水稻细胞中。
目前常用的方法有农杆菌介导转化和基因枪转化等。
转化过程中，目标基因被导入水稻细胞的染色体中。
5. 基因整合和表达：插入的基因在水稻细胞中整合到染色体上，并在细胞的遗传物质DNA中被正常复制和遗传。
转基因水稻的这些细胞和后代可以继续表达改良后的特性。
6. 选育和鉴定：基于获得的转基因水稻植株，进行纯系选育和鉴定，确保其稳
定性和所需特性的遗传传递。
通过这些步骤，转基因水稻可以获得具有所需特性的水稻品种，以提高水稻的抗病虫害、抗逆性、增加产量等特性，进而提高农作物的生产效益。
水稻转基因步骤
在植物转基因过程中，为了有效地识别和筛选转化子，常将目的基因和标记基因构建在同一表达载体中。
这种载体结构导致转基因植物中目的基因和标记基因始终共存，而标记基因（尤其是抗生素抗性基因）的存在可能给转基因植物的生物安全带来隐患。
目前已研发了多种方法剔除转基因植物中的标记基因，其中最常见的是共转化法(Komari 1996，McCormac 等2001)。
共转化系统是采用2个质粒或1个含有两套T—DNA表达盒的表达载体共同转化植物，其中一套表达盒含有抗性选择标记基因，另一套表达盒含有目的基因，它们转化植物时可能整合到植物基因组的不同位置。
转基因植株在减数分裂过程中，标记基因和目的基因发生分离，从而可在转基因后代中筛选到只含目的基因而不含选择标记基因的个体。
共转化从根本上排除了转基因植物中的选择标记，是保证人畜和环境安全的重要措施，因此受到了广泛的重视。
Zhou 等（2003）认为，用分别含一个T-DNA区的两个载体共转化的效率低于双T-DNA区表达载体的共转化效率。
目前关于利用双T-DNA区表达载体，获得无选择标记转基因阳性株系的研究已有不少报道（唐俐等2006，张秀春等2006，于恒秀等2005）。
花药培养与遗传转化技术相结合，可以快速获得纯合转基因植株（斯华敏等，1999，付亚萍等，2001），但是应用花药培养快速获得只含目的基因而无选择标记的转基因研究尚未见报告。
水稻是最主要的粮食作物，转基因水稻的安全显得尤为重要。
本实验室通过农杆菌介导的水稻转化体系，将包含人乳铁蛋白(hLF)、高赖氨酸(SB401)、高甲硫氨酸(RZ10)基因的表达载体p13HSR成功转化脆茎稻，由于该表达载体采用双T-DNA结构，将检测出含选择标记潮霉素磷酸转移酶基因（hpt）和目的基因的转基因阳性T0植株按单株直接进行花药培养。
在189株二倍体花培植株中检出23株有目的基因没有选择标记hpt的转基因纯合植株，得率为9.87％。
水稻转基因实验技术手册
水稻转基因实验技术手册遗传工程实验室Genetic Engineering Laboratory Discipline of Crop Genetics and BreedingFujian agricultural and Forestry University目录第一章DNA提取与纯化第二章引物设计与PCR第三章感受态细胞制备与转化（E. coli & 农杆菌）第四章电泳技术、琼脂糖凝胶DNA回收第五章质粒回收第六章RT-PCR第七章构建载体互补实验过量表达GFPGUSRNAi第八章水稻组织培养第九章原位杂交第十章石蜡切片技术第十一章扫描电子显微镜附录：第一章SDS-DNA微量提取法1、取新鲜叶片5cm 左右于1.5ml 离心管中，加入液氮研磨（电钻）。
2、加入700μl 预热至65℃的SDS 抽提液，迅速搅匀后置于65℃水浴30min 。
3、加入200μl 5M KAc ，颠倒混匀，-20℃冰浴30min 后，10,000rpm 离心5min ，将上清夜倒入另一新的1.5ml 离心管中。
注：若溶液中仍有植物组织，可进行二次离心。
4、加入等体积的异丙醇（700 μl ），-20℃冰浴30min ，11,000rpm 离心5min 。
5、弃上清，加入70%乙醇清洗液晾干。
6、将风干的DNA 溶于100 μl TE 溶液中，55℃水浴溶解1h ，再室温放置1d 。
实验准备：溶液配制：SDS-抽提液：1M Tris-HCl ：100ml 5M NaCl ：100ml 0.5M EDTA ：100ml 10% SDS ：125mlTE （pH8.0）：1M Tris-HCl （pH8.0）：5ml 0.5M EDTA （pH8.0）：1ml第二章 PCR定容至1000ml定容至500mlPrimeSTAR HS DNA Polymerase with GC Buffer & TaKaRa LA Taq with GC BufferPCR体系和程序第四章琼脂糖凝胶DNA回收*第一次使用前请先在15ml漂洗液WB中加入60ml无水乙醇1、在长波紫外下，用干净刀片将所需回收的DNA条带切下，尽力切除不含DNA的凝胶，得到凝胶体积越小越好。
水稻转基因实验方法与步骤
水稻转基因实验操作方法步骤一、水稻愈伤组织的诱导（一）以水稻幼胚为试材诱导愈伤组织1．消毒：取水稻未成熟种子（灌浆期），按以下步骤消毒：1）用自来水冲洗种子，去掉浮起的瘪谷；2）将种子放入250ml无菌烧杯中（种子数量约占1/3体积），用200ml70%酒精消毒2分钟；（在操净工作台上进行无菌操作）3）加入250ml25%次氯酸钠（NaClO）溶液，同时加数滴吐温-20，浸泡90分钟；4）倒去NaClO溶液，用无菌蒸馏水清洗种子4-5遍。
2．诱导与继代培养：（以下步骤需无菌操作）1）用镊子夹住种子，在无菌滤纸上用钢钩挤出幼胚，置入诱导培养基中；2）操作完毕后封好培养皿（一般保鲜膜），在暗处适温下（25-28℃）培养5天；3）继代培养。
用镊子剥下胚性愈伤组织（去掉芽及膜状物），置入继代培养基中（凸起面向上），暗处适温下（25-28℃）培养3天。
（二）以水稻成熟胚为试材诱导愈伤组织1．消毒：取水稻成熟种子，人工或者机械脱壳，挑选饱满光洁无菌斑的种子，按以下步骤消毒：1）将适量种子放入10ml离心管中（100颗左右），倒入75%酒精消毒2分钟；2）倒去酒精，加入一定量的0.1%升汞溶液，浸泡10分钟；3）倒去次氯酸钠溶液，用无菌蒸馏水清洗种子5-6遍，最后一遍浸泡30分钟。
2．诱导与继代培养：（以下步骤需无菌操作）1）种子放在无菌滤纸上吸干，置入成就胚诱导培养基中，每皿12－14颗；2）操作完毕用封口膜（MicroporeTMSurgicalTape）封好培养皿，在28℃光照培养箱，暗培养培养3周；3）在超净工作台上打开培养皿，用镊子挑取自然分裂的胚性愈伤组织（淡黄色，致密呈球状，去除种子和芽），置入继代培养基中，在28℃光照培养箱，继代培养1周（2周愈伤组织更为松散）。
（如不马上用，需转移至暗处，于22℃继续培养1周）二、农杆菌培养挑取农杆菌单克隆或吸取所保藏的农杆菌菌液100国于4mlYEP（含50mg/lKan和50mg/lStr）培养液中，28℃,250rpm振荡培养20-36h至菌液OD600为0.8-1.0（颜色接近橙黄色）。
水稻转基因技术的研究与应用
水稻转基因技术的研究与应用水稻是我国的主要粮食作物之一，也是全球最重要的粮食作物之一。
随着社会和经济的不断发展，人们对水稻品质和产量的要求也不断提高。
而转基因技术作为一种创新性技术，为水稻的改良提供了新的途径。
本篇文章将探讨水稻转基因技术的研究与应用。
一、水稻转基因技术的研究1.背景水稻转基因技术是将外源基因导入水稻细胞中，使水稻获得某些特定基因的性状。
这样可以通过调整水稻的生长和发育，使其在抗病、耐旱、提高产量等方面得到改善。
2.研究方法水稻转基因技术主要包括以下三种方法：(1) 农杆菌介导转化：将所需基因导入农杆菌载体，经过处理后将其导入水稻细胞中，使细胞产生抗病、提高产量等性状。
(2) 基因枪法转化：将所需基因载入金属小粒子上，压缩空气将粒子“射”入水稻细胞中。
(3) 电穿孔法转化：利用电场作用使水稻细胞短暂性开放，使基因能够有效导入细胞中。
3.研究进展目前，水稻转基因技术已取得了一些重要的进展，主要体现在以下几个方面：(1) 抗虫基因的成功导入：2007年，我国科学家成功将抗虫基因导入水稻，并以此培育了多个抗虫水稻品种。
(2) 抗病基因的成功导入：我国科学家通过细胞融合技术，将米瘟抗病基因导入一种水稻品种中，并获得了抵御米瘟病的水稻品种。
(3) 抗旱基因的成功导入：我国科学家成功将抗旱基因导入水稻，良种生长在干旱条件下的产量大大提高。
二、水稻转基因技术的应用1. 抗虫作物的生产目前，我国已经培育了多个抗虫作物品种。
这些品种通过导入相关基因并与优良品种杂交，产生出的基因工程作物比传统种植方法的作物更加耐虫。
2. 抗病作物的生产目前，我国已经获得了多个抗病作物品种。
这些品种通过导入相关基因并与优良品种杂交，产生出的基因工程作物比传统种植方法的作物更加耐病。
3. 提高产量基因工程水稻的生产方式与传统水稻生产方式相比，具有很大的优势。
通过导入相关基因，可以提高水稻的产量，并缩短生长周期。
4. 改善品质基因工程水稻的应用还可以改善水稻品质，如改良失酬水稻的品质和味道等。
实验七转基因水稻报告基因的检测
四、作业 1.目前在转基因植物研究中常用的报告基因有哪些？ 2.可采用哪些方法对GUS报告基因进行检测？
gus被称为转基因植物的报告基因。
未转基因植物中，β-葡萄糖醛酸糖苷酶酶及其所催化的反 应几乎完全不存在。
Xh LB 35S-ter Xh E Sa P E P S X B Sa
B
H
RB
hpt
35S-pro
232Wx-pro
232Int1 Wx frag
gus
Nos-ter
三、实验步骤
1.取转基因稻米24粒，剥去颖壳。 2.各切1/4胚乳放置于96孔板中，加适量X-gluc溶液 10ul。 3.37º C保温2小时。 4.GUS+、GUS- 计数，并计算比值。
实验七 转基因水稻GUS报告基因的检测
一、实验目的 通过本实验掌握在转基因植物中检测GUS报告 基因（gus）表达活性的操作方法，并掌握通过 GUS阳性和阴性分离比推测外源基中，编码β-葡萄糖醛酸糖苷酶，该酶的
作用底物是无色的X-葡萄糖苷酸（简称X-gluc）。当把表达β葡萄糖醛酸糖苷酶的转基因植物组织与X-gluc一起温育时，该 酶就会将反应体系中无色的X-gluc底物水解产生出深蓝色的5溴-4氯靛蓝。该反应很容易用普通的生化反应检测出来，由此
水稻转基因系的分子鉴定方法
水稻转基因系的分子鉴定1．目的1．1从T2不同转基因株后代中鉴定得到分离出的纯转基因株、杂合转基因株和非转基因株，为根系和生理学实验提供材料；1．2鉴定纯转基因株中插入T-DNA的拷贝数和插入方式；1．3鉴定纯转基因株中插入T-DNA的插入位置。
2．材料中华11 （CK）H05系列石狩白毛（CK）E10系列WD17系列3．主要试剂和配方3.1 DNA微量提取微量提取液：200mM Tris-HCl(pH7.5250mM NaCl25mM EDTA0.5% SDS酚/氯仿氯仿无水乙醇、70%乙醇TE缓冲液（pH8.0）10mg/ml RNase3.2 Htp的PCR鉴定Taq酶及Buffer 购自Takara公司dNTPs购自华美公司3.3 植物DNA大量提取抽提液： 1.5%CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)75mmol/L Tris-HCl PH8.01M NaCl15mmol/L EDTA沉淀液： 1%CTAB50mmol/L Tris-HCl PH8.010mmol/L EDTA高盐TE: 1mol/L NaCl10mmol/L Tris-HCl PH8.01mmol/L EDTA3．4 Southern杂交Southern杂交液（1×）:20×SSC 250 mL5%SDS 5 mL10%Sarkosyl 10 mLddH2O 735 mLBlocking Reagent 5 g洗脱液(1x)：20x SSC 10 mL5%SDS 40 mLddH2O 950 mL3.5 RNA提取Trizol: 购自Invitragen公司10×MOPS: 80mmol/L NaAc0.2mol/L MOPS10mmol/L EDTA加DEPC处理的水定容，调pH值至7.0 RNA上样混合物：0.25%溴酚兰0.25%二甲苯菁50％甘油1 mmol/L EDT A1.2%甲醛变性胶(100ml)：1.2g grose73ml DEPC水10×MOPBuffer 10 mL2.2M甲醛 6 mL3.6 RT-PCR反转录酶SuperscriptIII试剂盒购自Invitragen公司 PCR所用试剂同前。
水稻转基因技术
1.报告基因的酶法检测,常用的报告基因有:gus、nos、ocs等。
当然最后转基因植株必须移栽于大田,进行田间鉴定,不仅对改 良性状还要对其它农艺性状进行评价,选育综合性状优良的株系。
11
三、存在的问题
外源基因的稳定遗传、高效表达及目的基因的沉默。 转基因水稻的安全性问题。 水稻育种转入的基因多数为抗病虫基因，这类基因 产生的毒蛋白等物质，随着人们长期食用，是否会有 累积效应？
水稻转基因技术
第二组
1
目录
1 2
水稻装基因技术
外源基因鉴定
存在的问题与展望
3
7
黄金大米:
又名“金色大米”，是一 种 转基因大米，由美国先正达 公司研发。其不同于正常大米 的主要功能为帮助人体增加维 生素A吸收。因为色泽发黄， 该大米品种被称为“黄金大 米”。
左为普通大米，右为黄金大米
3
水 稻 转 基 因 技 术
12
基因枪法
农杆菌介导发
PEC介导转化法
其他方法
花粉管通道发 电击法
4
一、水稻转基因技术
基因枪法：
定义：又称微弹轰击法，是利用基因枪，将载有目的
基因的金属颗粒加速，高速射入受体作物细胞，并随机 整合到受体细胞的基因组上，然后通过细胞和组织培养 技术，再生出新的植株。
原理：是将外源DNA包在微小的金粒或钨粒表面,再 通过高压将微粒高速地射入受体细胞或组织。
7
PEC介导转化法：
原理：是利用化合物聚乙二醇(PEG)及高pH条件诱 导原生质体体外摄取外源DNA。 特点：原生质体作为受体具有群体数大,便于操作,DNA 分子易于进入,获得纯合性的转化子等优点,但原生质体培 养难度大、再生频率低、周期长、不适合水稻转化研究。
抗虫转基因水稻检测技术研究综述
抗虫转基因水稻检测技术研究综述抗虫转基因水稻是通过将特定的抗虫基因导入水稻，使其具有抵抗虫害的能力。
为了确保转基因水稻的安全性和环境友好性，对其进行检测是非常重要的。
本文综述了目前常用的抗虫转基因水稻检测技术。
一、抗虫鉴定技术抗虫鉴定是通过观察转基因水稻对虫害的抵抗性来确认其是否为抗虫转基因水稻的方法。
这是最直观的检测方法，但需要大量的时间和劳动力。
二、基因组学方法1. PCR技术PCR技术是一种常用的转基因水稻检测方法。
通过特异性引物，可以扩增出抗虫基因在转基因水稻中的片段。
这种方法能够准确快速地检测出转基因水稻的存在。
2. Southern blottingSouthern blotting是一种基于DNA的电泳分离和转移的技术。
通过使用与抗虫基因相应的DNA探针，可以检测出转基因水稻中抗虫基因在基因组中的存在。
2. ELISA技术ELISA技术是一种常用的免疫学检测方法。
通过使用与抗虫蛋白相应的抗体，可以检测出转基因水稻中抗虫蛋白的含量。
四、转录组学方法转录组学是研究一个细胞或组织中基因转录过程的一种方法。
通过分析转基因水稻和野生型水稻的RNA序列差异，可以检测出转基因水稻中抗虫基因是否被表达和转录。
抗虫转基因水稻的检测技术主要包括抗虫鉴定、基因组学方法、蛋白质组学方法和转录组学方法。
这些方法在检测抗虫转基因水稻中起到了重要的作用，并且随着科技的不断发展和进步，这些方法也在不断完善和优化，提高了检测的准确性和效率。
我们也需要加强对转基因水稻检测技术的研究，以满足抗虫转基因水稻的安全性和环境友好性要求。
水稻转基因实验操作[2]
![水稻转基因实验操作[2]](https://img.taocdn.com/s3/m/ee8ee83143323968011c927c.png)
水稻转基因实验操作（谢越、赵建宁、艾鹏慧、孙淑斌整理）（2006.7）一、水稻（日本晴）愈伤组织的诱导（以水稻成熟胚为试材诱导愈伤组织）1．消毒：取水稻成熟种子，人工或者机械脱壳，挑选饱满光洁无菌斑的种子，按以下步骤消毒：1）将种子放入100ml无菌烧杯中，倒入70%酒精消毒1分钟；2）倒去酒精，加入100ml 30%次氯酸钠（NaClO）溶液（5.2%次氯酸钠），浸泡30分钟；3) 倒去次氯酸钠溶液，用无菌蒸馏水清洗种子4-5遍，最后一遍浸泡30分钟。
2．诱导与继代培养：（以下步骤需无菌操作）1）种子放在无菌滤纸上吸干，置成熟胚于诱导培养基中，每皿12－14颗；2）操作完毕用封口膜（Micropore TM Surgical Tape）封好培养皿，在30℃光照培养箱，培养4周；3）在超净工作台上打开培养皿，用镊子挑取自然散落的胚性愈伤组织（淡黄色，致密呈球状），在30℃光照培养箱，继代培养1-2周。
(没有脱落的可在原培养基上继续培养7天，次数多了效果会减弱)二、农杆菌（工程菌）培养挑取农杆菌单克隆或吸取所保藏的农杆菌（EHA105）菌液100µl于4ml YEP（含50mg/LSpec和50mg/L Str）培养液中，28℃，250rpm振荡培养20-36h至菌液OD600为0.8-1.0。
三、感菌与共培养1）取培养好的工程菌液1ml于1.5ml离心管中，4℃，5000rmp，离心1min，去上清。
用含200µmol/LAs的30ml AAM感菌液制成悬浮液。
2）将长到一定大小的水稻愈伤组织挑出，放入农杆菌悬浮液侵染5分钟（愈伤量没过50ml离心管锥形部位即可）。
3）将愈伤组织取出，置于无菌的滤纸上沥干30-40分钟；4）将愈伤组织置于共培养基上(共培养基上面垫上一层9cm无菌滤纸)。
28℃（组培室）暗培养2.5天。
四、愈伤组织的抗生素筛选将愈伤组织取出，用无菌水清洗6次，其间需不停的振荡（组培室震荡机最大速率）。
水稻品种改良的基因技术方法
水稻品种改良的基因技术方法水稻是全球最重要的粮食作物之一，也是世界上最主要的主食。
为了满足全球不断增长的需求，必须提高水稻的产量和品质。
而基因技术是一种新兴的改良水稻品种的方法。
本文将详细介绍水稻品种改良的基因技术方法，包括基因克隆、基因组编辑和转基因技术等。
1. 基因克隆基因克隆是一种利用分子生物学手段将目标基因复制出来并插入到宿主细胞中的方法。
水稻的基因组已经被测序，因此基因克隆成为改良水稻品种的重要手段。
首先，需要从野生品种或其他品种中筛选出与所需性状相关的基因。
然后，利用PCR技术扩增目标基因的DNA序列，再将扩增出来的DNA片段插入到特殊载体中。
最后，将该载体引入水稻细胞中，DNA片段就能够在水稻细胞中表达出来，产生所需的性状。
2. 基因组编辑基因组编辑是一种通过直接编辑水稻基因组的方式改良水稻品种的方法。
与传统基因克隆方法不同，基因组编辑可以对水稻基因组进行精确的修改，从而实现对水稻性状的精确调节。
为了利用基因组编辑技术改良水稻品种，首先需要使用CRISPR/Cas9系统，这是一种先进的基因编辑工具。
CRISPR/Cas9系统利用一种特殊的酶Cas9和一个针对目标基因的RNA序列，直接切割水稻基因组中的目标位点。
然后，可以将所需基因的DNA片段插入到已经被编辑的位点中，从而实现所需性状的表达。
3. 转基因技术转基因技术是一种将外源基因引入水稻细胞中，从而改变水稻性状的方法。
转基因技术通常包括两个步骤：首先，需将目标基因插入到植物表达载体中，然后将该载体引入水稻细胞中。
转基因技术已被广泛应用于改良水稻的性状，例如提高产量、改进品质、增强抗病能力等。
然而，转基因技术也存在着负面影响。
由于外源基因的引入可能会破坏基因组的稳定性，导致水稻植株的生长和发育异常、易感病等问题。
因此，在进行转基因改良时需要进行充分的风险评估。
总结通过基因克隆、基因组编辑和转基因技术等方法，可以调节水稻的性状和提高其产量和品质。
转基因水稻品种
转基因水稻品种一、转基因水稻的概念转基因水稻是指通过基因工程技术将外源基因导入水稻基因组中，从而使水稻获得新的性状或特性的水稻品种。
例如，可能导入抗虫基因使水稻能够抵抗特定害虫的侵害，或者导入抗除草剂基因方便田间杂草管理等。
1. 抗虫转基因水稻- Bt转基因水稻- 原理：将苏云金芽孢杆菌（Bt）中的杀虫蛋白基因导入水稻。
Bt蛋白能够特异性地毒杀鳞翅目害虫，如螟虫等。
当害虫取食转基因水稻后，Bt蛋白在害虫肠道内被激活，与肠道上皮细胞表面的特异性受体结合，造成肠道穿孔，最终导致害虫死亡。
- 优势：显著减少化学杀虫剂的使用量。
传统防治螟虫等害虫需要多次喷洒农药，这不仅成本高，而且农药残留会对环境和人类健康造成潜在威胁。
抗虫转基因水稻能在很大程度上解决这些问题，提高水稻产量的稳定性。
- CpTI转基因水稻- 原理：豇豆胰蛋白酶抑制剂（CpTI）基因被导入水稻。
CpTI能够抑制害虫体内的胰蛋白酶活性，从而影响害虫的消化过程，达到抗虫的目的。
- 优势：具有较广的抗虫谱，对多种害虫都有一定的抑制作用。
同时，由于其作用机制与Bt蛋白不同，两者结合使用可以延缓害虫对单一抗虫基因产生抗性。
2. 抗除草剂转基因水稻- 例如，导入抗草甘膦基因的水稻。
- 原理：草甘膦是一种广谱性的除草剂，它通过抑制植物体内的5 - 烯醇丙酮莽草酸 - 3 - 磷酸合成酶（EPSPS）的活性来杀死植物。
抗草甘膦转基因水稻中导入了经过修饰的EPSPS基因，这种基因编码的酶对草甘膦不敏感，从而使水稻在使用草甘膦除草剂时能够正常生长，而杂草被有效清除。
- 优势：方便田间杂草管理。
在传统水稻种植中，人工除草劳动强度大，化学除草容易对水稻产生药害。
抗除草剂转基因水稻可以在水稻生长期间精准地使用草甘膦进行除草，提高田间管理效率，减少杂草与水稻争肥、争光等情况，有助于提高水稻产量。
三、转基因水稻的安全性争议1. 环境安全方面- 基因漂移问题- 争议点：转基因水稻中的外源基因可能通过花粉传播等方式漂移到野生稻或其他近缘植物中，从而可能改变野生植物的基因组成和生态特性。
转基因水稻Bt汕优63外源插入结构验证和定量检测方法建立
转基因水稻Bt汕优63外源插入结构验证和定量检测方法建立一、背景介绍Bt汕优63是一种经过基因工程技术改造的转基因水稻品种，通过引入Bt基因，使其具备抗虫特性，有效减少农药使用，保障粮食安全。
为确保Bt汕优63中外源基因插入结构的稳定性和表达量，本研究旨在建立一套针对其外源插入结构的验证和定量检测方法。
二、外源插入结构验证方法1. DNA提取从Bt汕优63植株中提取基因组DNA，作为后续实验的模板。
2. PCR扩增设计特异性引物，针对Bt基因及其侧翼序列进行PCR扩增。
通过琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，验证Bt基因是否成功插入水稻基因组。
3. 序列分析将PCR扩增产物进行测序，与预期序列进行比对，确认插入位点和序列的正确性。
三、定量检测方法建立1. 实时荧光定量PCR（qPCR）以Bt基因为目标，设计特异性引物和探针，建立qPCR检测体系。
通过标准曲线法对Bt基因在水稻基因组中的表达量进行定量分析。
2. qPCR实验步骤（1）制备cDNA：以提取的RNA为模板，反转录合成cDNA。
（2）配制qPCR反应体系：包括cDNA模板、引物、探针、dNTPs、Taq酶等。
（3）设置qPCR反应程序：包括预变性、变性、退火、延伸等步骤。
（4）数据分析：采用软件分析Ct值，根据标准曲线计算Bt基因的相对表达量。
四、方法优化与验证1. 优化实验条件：对qPCR反应体系中的引物浓度、探针浓度、退火温度等进行优化，确保检测体系的灵敏度和特异性。
2. 重复性实验：进行多次独立实验，验证检测方法的重复性。
3. 线性范围验证：通过制备不同浓度的标准品，构建标准曲线，验证检测方法的线性范围。
本研究成功建立了Bt汕优63外源插入结构的验证和定量检测方法，为后续转基因水稻的监管、研究和应用提供了有力的技术支持。
通过这些方法，可以确保Bt汕优63中外源基因的稳定性和表达量，为我国转基因作物的发展和安全提供保障。
六、实验操作注意事项1. DNA提取过程中的注意事项确保实验过程中使用的器械和容器无菌，避免DNA污染。
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水稻转基因实验操作方法步骤一、水稻愈伤组织的诱导（一）以水稻幼胚为试材诱导愈伤组织1．消毒：取水稻未成熟种子（灌浆期），按以下步骤消毒：1）用自来水冲洗种子，去掉浮起的瘪谷；2）将种子放入250ml无菌烧杯中(种子数量约占1/3体积)，用200ml 70%酒精消毒2分钟；（在操净工作台上进行无菌操作）3）加入250ml 25%次氯酸钠（NaClO）溶液，同时加数滴吐温-20，浸泡90分钟；4）倒去NaClO溶液，用无菌蒸馏水清洗种子4-5遍。
2．诱导与继代培养：（以下步骤需无菌操作）1）用镊子夹住种子，在无菌滤纸上用钢钩挤出幼胚，置入诱导培养基中；2）操作完毕后封好培养皿(一般保鲜膜)，在暗处适温下（25-28℃）培养5天；3）继代培养。
用镊子剥下胚性愈伤组织（去掉芽及膜状物），置入继代培养基中（凸起面向上），暗处适温下（25-28℃）培养3天。
（二）以水稻成熟胚为试材诱导愈伤组织1．消毒：取水稻成熟种子，人工或者机械脱壳，挑选饱满光洁无菌斑的种子，按以下步骤消毒：1）将适量种子放入10ml离心管中（100颗左右），倒入75%酒精消毒2分钟；2）倒去酒精，加入一定量的0.1%升汞溶液，浸泡10分钟；3) 倒去次氯酸钠溶液，用无菌蒸馏水清洗种子5-6遍，最后一遍浸泡30分钟。
2．诱导与继代培养：（以下步骤需无菌操作）1）种子放在无菌滤纸上吸干，置入成就胚诱导培养基中，每皿12－14颗；2）操作完毕用封口膜（Micropore TM Surgical Tape）封好培养皿，在28℃光照培养箱，暗培养培养3周；3）在超净工作台上打开培养皿，用镊子挑取自然分裂的胚性愈伤组织（淡黄色，致密呈球状，去除种子和芽），置入继代培养基中，在28℃光照培养箱，继代培养1周（2周愈伤组织更为松散）。
（如不马上用，需转移至暗处，于22℃继续培养1周）二、农杆菌培养挑取农杆菌单克隆或吸取所保藏的农杆菌菌液100µl于4ml YEP（含50mg/lKan和50mg/l Str）培养液中，28℃，250rpm振荡培养20-36h至菌液OD600为0.8-1.0（颜色接近橙黄色）。
三、共培养和抗性愈伤组织的选择1．感菌与共培养：1）取培养好的菌液500µl于1.5ml离心管中，4℃，4000rmp，离心2min，去上清。
用含200umol/l As的30ml AAM感菌液制成悬浮液，使菌液OD600的终浓度为0.01（0.08-0.1）；2）将长到一定大小的水稻愈伤组织挑出，放入农杆菌悬浮液侵染5分钟；3）将愈伤组织取出，置于无菌的滤纸上沥干30-40分钟；4）将愈伤组织置于共培养基上。
25℃暗培养2-3天（表面会长有薄薄的一层农杆菌）。
2．选择：1）将愈伤组织取出，用无菌水清洗5-6次（多次洗会更好），其间需不停的振荡。
再用含250mg/l羧苄青霉素钠的无菌水清洗1~2遍。
最后置于无菌滤纸上沥干2小时；2）将晾干的愈伤转入含250mg/l Carbenicillin（羧苄青霉素钠）和50mg/l潮霉素的选择培养基上进行第一轮选择，28℃，光照培养14天（若农杆菌无法抑制，可加大抗生素浓度，最大用过500mg/l）；3）将长有抗性愈伤的初始愈伤转到含250mg/l Carbenicillin和50mg/l潮霉素的培养基上进行第二轮选择，28℃，光照培养，直到颗粒性的抗性愈伤组织长出。
四、抗性愈伤组织的预分化（可选）将新长出的抗性愈伤组织转入预分化培养基中，25℃，光照培养7天。
五、抗性愈伤组织的诱导分化和生根挑取从同一愈伤来的颜色鲜黄的抗性愈伤3-4颗，移入装有分化培养基的培养皿或塑料广口瓶中（每皿或每瓶放置5-7颗），用封口膜封好，放入恒温培养室中，28℃，光照培养(16h光/8h暗)，等待分化成苗（15-30天）。
待苗长至1cm左右，放入生根培养基中壮苗注：以上一至五的操作步骤皆在无菌条件下进行。
六、转基因苗的锻炼和移栽转基因苗从分化到移栽最短时间为两个月左右。
将苗根部和茎叶分化得较完好的试管挑出（苗长至试管顶部，就要及时开盖），打开封口膜，加入适量蒸馏水或无菌水（防止培养基长菌），炼苗3天至一周左右，然后洗去琼脂，移栽到温室的土钵中生长，检测。
附录：各种母液及培养基的配制方法 一、溶液配制0.1%升汞：小心称取1克HgCl ，用少量蒸馏水溶解后，定容至1000ml 。
25%次氯酸钠溶液：量取250mlNaClO ，用蒸馏水定容至1000ml 。
激素溶液配制方法： KT 加少量稀碱（1M NaOH ）溶解，再用蒸馏水定容 1 mg/ml 6-BA 加稀碱(同上)或盐酸溶解，再用蒸馏水定容 1 mg/ml NAA 加碱溶解（1M NaOH ），再用蒸馏水定容 1 mg/ml 2，4-D 加少量稀碱或酒精溶解，再用蒸馏水定容 1 mg/ml ABA 先用乙醇溶解，再用蒸馏水定容1 mg/ml水稻培养液配方（贮备液）：试 剂每10升溶液中的克数1．NH 4NO 3 914 2．NaH 2PO 4·2H 2O 403 3．K 2SO 4 714 4．CaCl 2 886 5．MgSO 4·7H 2O 32406．MnCl 2·4H 2O 15.0 分别溶解后加500ml 浓硫酸，然后再加蒸馏水到10L 。
（NH 4）6·Mo 7O 24·4H 2O0.74 H 3BO 3 9.34 ZnSO 4·7H 2O 0.35 CuSO 4·5H 2O 0.31 FeCl 3·6H 2O 77.0 柠檬酸（-水合物）119*使用时，每4L 培养液中加1号~6号贮备液，各5ml 。
为使水稻生长健壮，可另加SiO 2，50ppm~100ppm 。
调节pH 值至5.0~5.1。
二、培养基的配制：1．培养基母液配方：1）N6培养基母液（20倍）：每升含：KNO356.6gMgSO4·7H2O 2.7gKH2PO48g(NH4)2SO49.26gCaCl· 2H2O 3.32g2）B5微量母液(100倍)：每升含：KI 0.0750gH3BO30.30gMnSO4·H2O 1.0gZnSO4·7H2O 0.2gNa2MoO4·2H2O 0.025gCuSO4·5H2O 0.0025gCoCl2·6H2O 0.0025g3）B5有机母液：烟酸(VB3) 1mg/ml盐酸吡哆醇(VB6)1mg/ml盐酸硫胺素(VB1)10 mg/ml肌醇10 mg/ml4）MS培养基大量元素（20倍）：每升含：NH4NO333.0gKNO338.0gCaCl2·2H2O 8.8g（相当于CaCl2 6.644g）MgSO4·7H2O 7.4gKH2PO4 3.4g5)铁盐(100倍)：FeSO4·7H2O 2.78gNa2EDTA·2H2O 3.73g注：FeSO4·7H2O和Na2EDTA·2H2O分别溶解混合后，需加热煮沸使Fe2＋螯合，最终溶液颜色为深黄色。
7）AA大量元素母液（每升含量）：KCl 2.95gCaCl2·2H2O 0.15gMgSO4·7H2O 0.25gNaH2PO4·2H2O0.15g2．培养基配方1）粳稻幼胚、成熟胚愈伤组织诱导培养基（每升含量）：N6大量元素：50ml B5微量：10ml铁盐：10ml烟酸： 1 ml盐酸吡哆醇： 1 ml盐酸硫胺素： 1 ml肌醇：10ml L-Glu：0.5 g L-pro: 0.5 g(2.8g) CH : 0.3g2,4-D : 2.5ml（2ml）蔗糖：30gAgar 8g PH值：5．8注：括号中为成熟胚愈伤组织诱导培养基成份及用量，其它与幼胚配方相同。
以下同2）粳稻幼胚、成熟胚愈伤组织继代培养基（每升含量）：N6大量元素：50ml B5微量：10ml铁盐：10ml烟酸： 1 ml盐酸吡哆醇： 1 ml盐酸硫胺素： 1 ml肌醇：10ml L-Glu：0.5 g L-pro: 0.5 g(2.8g) CH : 0.3g6-BA（2,4-D）0.5ml(2ml)NAA(不加) 0.5ml蔗糖30g Agar 8g PH值：5．83）籼稻幼胚、成熟胚愈伤组织诱导培养基（每升含量）：烟酸： 1 ml盐酸吡哆醇： 1 ml盐酸硫胺素： 1 ml肌醇：10ml L-Glu：0.5 g L-pro: 0.5 g CH : 0.3g2,4-D : 2.5ml麦芽糖：30g Phytagel: 4.0g PH值：5．84）粳（籼）稻共培养培养基（每升含量）：N6（MS）大量元素：50ml B5微量：10ml铁盐：10ml 烟酸： 1 ml盐酸吡哆醇： 1 ml盐酸硫胺素： 1 ml 肌醇： 2 g MES 3.9g蔗糖（麦芽糖）：30g CH : 0.5g Phytagel: 4.0gPH值：5．555℃时加As 至终浓度为200μM5）选择培养基（MCH/NCH，籼稻/粳稻）每升含量：MS/N6大量元素：50ml B5微量：10ml铁盐：10ml 烟酸： 1 ml盐酸吡哆醇： 1 ml盐酸硫胺素： 1 ml 肌醇：10ml L-Glu：0.5 g L-pro: 0.5 g CH : 0.3g2,4-D : 2ml麦芽糖/蔗糖：30g Phytagel: 4.0g PH值：5．8灭菌后再加：Hyg（潮霉素）50 mg/LHyg（潮霉素）50 mg/L6）粳稻预分化培养基配方（每升含量）：烟酸： 1 ml盐酸吡哆醇： 1 ml盐酸硫胺素： 1 ml肌醇：10ml L-Glu：0.5 g L-pro: 0.5 g CH : 0.3g6-BA: 2 ml NAA 0.1 ml ABA 5ml 蔗糖：30g Phtagel 4.0g PH值 5.8灭菌后再加Carbenicillin250mg/lHyg（潮霉素）50 mg/L7）粳稻分化培养基配方（每升含量）：N6大量元素：50ml B5微量：10ml铁盐：10ml 烟酸： 1 ml盐酸吡哆醇： 1 ml盐酸硫胺素： 1 ml 肌醇：10ml L-Glu：0.5 g L-pro: 0.5 g CH : 0.3g6-BA: 3 ml NAA 0.5 ml 蔗糖：30g Agar8 gPH值：5．88）粳稻生根培养基配方（每升含量）：N6大量元素：25ml B5微量：5ml铁盐：5ml烟酸：0.5ml盐酸吡哆醇：0.5 ml盐酸硫胺素：0.5 ml 肌醇：5ml蔗糖：20g agar:7 g9）籼稻分化培养基配方（每升含量）：MS大量元素：50ml B5微量：10ml铁盐：10ml 烟酸： 1 ml盐酸吡哆醇： 1 ml盐酸硫胺素： 1 ml 肌醇：10ml L-Glu：0.5 g L-pro: 0.5 g CH : 0.3g KT: 2.5 ml NAA 0.5 ml 麦芽糖：30g agar:8 gPH值：5．810）农杆菌生长的YEP液体培养基配方（每升含量）：酵母提取物10g蛋白胨10gNaCl 5gpH 7.0链霉素(Str) 50mg 卡那霉素(Kan)或其它抗生素50mg11）农杆菌生长的YM固体培养基配方（每升含量）：244NaCl 0.2g Agar 12gPH 7.0链霉素(Str) 50mg 卡那霉素(Kan)或其它抗生素50mg12）悬浮农杆菌感染愈伤组织团的培养基配方（AAM）每升含量：AA大量元素：100ml B5微量：10ml铁盐：10ml 烟酸： 1 ml盐酸吡哆醇： 1 ml盐酸硫胺素： 1 ml 肌醇：10ml MES： 3.9 g CH : 0.5g 麦芽糖：30g PH值：5．555℃时加As至终浓度为200μM。