水稻转基因实验方法与步骤
水稻转基因系的分子鉴定方法
水稻转基因系的分子鉴定
1．目的
1．1从T2不同转基因株后代中鉴定得到分离出的纯转基因株、杂合转基因株和非转基因株，为根系和生理学实验提供材料；
1．2鉴定纯转基因株中插入T-DNA的拷贝数和插入方式；
1．3鉴定纯转基因株中插入T-DNA的插入位置。
2．材料
中华11 （CK）
H05系列
石狩白毛（CK）
E10系列
WD17系列
3．主要试剂和配方
3.1 DNA微量提取
微量提取液：
200mM Tris-HCl(pH7.5
250mM NaCl
25mM EDTA
0.5% SDS
酚/氯仿
氯仿
无水乙醇、70%乙醇
TE缓冲液（pH8.0）
10mg/ml RNase
3.2 Htp的PCR鉴定
Taq酶及Buffer 购自Takara公司
dNTPs购自华美公司
3.3 植物DNA大量提取
抽提液： 1.5%CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)
75mmol/L Tris-HCl PH8.0
1M NaCl
15mmol/L EDTA
沉淀液： 1%CTAB
50mmol/L Tris-HCl PH8.0
10mmol/L EDTA
高盐TE: 1mol/L NaCl
10mmol/L Tris-HCl PH8.0
1mmol/L EDTA
3．4 Southern杂交
Southern杂交液（1×）:20×SSC 250 mL
5%SDS 5 mL
10%Sarkosyl 10 mL
ddH2O 735 mL
Blocking Reagent 5 g
洗脱液(1x)：20x SSC 10 mL
5%SDS 40 mL
ddH2O 950 mL
3.5 RNA提取
Eppendorf水稻及其制品转基因成分检测方案
水稻及其制品转基因成分检测方案
全球转基因植物种植面积逐年增加，到年累计种植面积已经超过亿公顷。转基因植物及其制品的安全性问题已经引起国际社会的广泛关注。我国也颁布了多个关于转基因生物的管理法规，如农业转基因生物安全管理条例，进出境转基因产品检验检疫管理办法等，以加强对转基因生物及其制品的管理。
在我国，尽管政府从未允许在主食作物领域进行转基因商业种植，但在出口欧盟的大M制品中，“非法转基因”却被屡次查获。从年年初开始，欧盟已经次从中国进口的M制品中检出非法转基因。转基因植物及其制品的安全性已非常严峻，检测转基因的任务也日益加大。在转基因检测领域有着丰富的经验，针对水稻及其制品转基因成分的检测，提供从提取、质量评估到定性检测的整套解决方案。
提取
对水稻及其制品样本的提取，通常采用传统的有机溶剂进行抽提或是商业试剂盒进行提取。检测人员可以利用移液器、离心机、混匀仪等常规设备进行手工提取，也可以采用自动化工作站进行全自动提取。
手工提取
可以提供高品质的移液器、分液器、离心机、混匀仪等设备，根据您的样品通量和实验需要，帮你出色完成手工提取工作。
全新的移液器采用高科技材质，不但精准性高、经久耐用，而且符合人体工程学设计，适用于裂解液和核酸样本等移取。如果样本量大，加样繁琐，还可以提供操作简便、移液精准性和可重复性高的电动移液器、手动分液器以及电动分液器，帮助检测人员轻松完成长时间高通量的提取工作。
在水稻及其制品的核酸提取过程中，无论是用传统有机溶剂还是商业试剂盒进行提取，都需要高速离心机进行有效地离心。台式高速离心机具有多项创新技术，其卓越的性能可以满足对离心机转速和容量的最高要求，确保高效安全的离心。其中、以及离心机还具有特殊的转子，适用于核酸提取试剂盒中类似管的离心。另外，、和系列多功能离心机可适配水平转子以满足高通量检测的需求，如系列离心机可同时离心块微孔板或块深孔板。
水稻转基因方法 自己
转基因步骤：2-3月完成
水稻幼胚愈伤组织的培养
1.去壳成熟的水稻种子经70%乙醇消毒5min。
2.倒去乙醇，再用2.5%次氯酸钠（每50mL加一滴吐温20）消毒15min，无菌水洗5次，再用2.5%次氯酸钠消毒15min，再用无菌水浸泡30min。
3．倒去次氯酸钠，将种子倒到无菌滤纸上吸干，再将种子放在N6D （0.6% Gelrite）培养基上29.5度光照培养30-60天（白天12h29.5度，晚上12h29.5度）。
注;培养基每2周换一次。
农杆菌的准备
1．选择有活力的愈伤组织（相对干的、淡黄色的。如图1）转到新的N6D培养基上，29.5度光照培养3天。
注: 褐色的愈伤千万不能选，不然会影响转化效率。
2．挑取含有目的基因的农杆菌单菌落或吸取所保存的农杆菌液100ul 于5ML YEP培养液中（50mg/l Kan+， 50mg/l（利福平） Str+），28度、250rp振荡培养12-36h至OD600饱和。
3.从上述菌液中吸取500ul于50mlYEP培养液中（50mg/l Kan+，50mg/l（利福平） Str+）. 28度、250rp振荡培养12-36h至OD600=0.6-0.8。
注;农杆菌培养时要避光。因为农杆菌对光敏感。
农杆菌本身对利福平有抗性，质粒对Kan+ 有抗性，所以能在YEP培养基中（50mg/l Kan+， 50mg/l（利福平） Str+）生长的菌斑基本上转进去质粒了，只需做下菌落PCR验证下。
农杆菌的侵染
1．取15ml培养好的菌液，4度，4000rpm离心10min，去上清。
说明使用表型观察,pcr法鉴定转基因水稻的条件(一)
说明使用表型观察,pcr法鉴定转基因水稻的条件(一)
说明使用表型观察、PCR法鉴定转基因水稻的条件
1. 引言
转基因技术的广泛应用使得转基因作物的鉴定成为农业领域中的重要任务之一。其中，转基因水稻鉴定对于保障粮食安全、推动农业可持续发展具有重要意义。本文将针对使用表型观察和PCR法鉴定转基因水稻进行详细介绍。
2. 表型观察鉴定转基因水稻的条件
转基因水稻的表型观察鉴定通常需要以下条件：
•生长环境：转基因水稻和非转基因水稻应在相同的生长环境下进行观察，包括温度、湿度、光照等因素。确保生长环境的一致性有助于排除其他环境因素对水稻表型的影响。
•对照品种：选择与待鉴定水稻表型相似的非转基因水稻对照品种，用于对照比较观察结果。这有助于辨别转基因水稻的特异表型特征。
•观察时间点：需要在适当的生长阶段进行观察，以确保转基因水稻的表型特征能够明显表现出来。通常，在水稻植株出苗、分蘖、开花等关键生长阶段进行观察效果较好。
•观察指标：通过观察转基因水稻在相关生长阶段的形态特征、生理指标等来判断其是否为转基因品种。例如，观察水
稻株高、叶片形态、穗长等指标的变化情况。
3. PCR法鉴定转基因水稻的条件
PCR法是一种常用的转基因鉴定方法，也可用于转基因水稻的鉴定。下面是鉴定转基因水稻所需的条件：
•提取基因组DNA：利用合适的DNA提取方法，从待鉴定水稻样品中提取基因组DNA。确保提取的DNA质量和浓度适宜，以保证PCR反应的准确性和可靠性。
•选择适当的引物：根据需要鉴定的转基因特征，选择适当的引物。这些引物应与目标转基因序列具有特异性，以确保
转基因的步骤
1.5 农杆菌介导的水稻快速转化
1.5.1 各种培养基成分
水稻快速转化的培养基成分如表2-1，N6D培养基用于愈伤组织诱导和筛选，2N6-AS 为共培养培养基，AAM 用于配制农杆菌浸染液，RE-III 为分化培养基，HF 为生根培养基，AB 培养基用于农杆菌的活化。其中，配制固体培养基时，固定剂使用0.4%的Gerite。
1.5.2 种子的消毒
（1）水稻成熟种子去壳；
（2）置70%乙醇1min，弃乙醇，用无菌水清洗5 次；
（3）在每50ml 的 2.5%次氯酸钠溶液中滴 1 滴吐温20 混匀，然后放入乙醇处理过的水稻种子，浸泡15min，无菌水清洗 5 次；
（4）在 2.5%次氯酸钠溶液中再灭菌15min，无菌水清洗 5 次。
1.5.3 种子的接种和愈伤组织诱导
将灭菌后的成熟种子平摆于诱导培养基上，在常光照、32℃条件下培养5-8d。
1.5.4 浸染液的制备
（1）取出 1.4 中所保存的含有目标质粒的单克隆，吸取50μl 保菌液均匀涂布于固体AB培养基上，AB培养基中含50mg/L卡那霉素和50mg/L利福平，28℃条件下培养2-3d；
（2）刮取AB 培养基上的农杆菌，用AAM 重悬农杆菌，用AAM 稀释至OD600为0.1。
1.5.5 愈伤组织侵染和共培养
（1）取出诱导5-8d 的水稻愈伤组织，切去胚乳和芽鞘；
（2）将生长状态良好的愈伤组织置于浸染液中，浸泡5-8min；
（3）取出愈伤组织，置灭菌滤纸上，吸取愈伤组织表面的侵染液；
（4）在2N6-AS 培养基上铺一层无菌滤纸，并用AAM 浸湿；（5）将浸染后的愈伤组织均匀平放于2N6-AS 培养基；
水稻转基因策略-第三版
水稻转化体系的构建
（第三版，2015年3年10日）
N6D 诱导愈伤，前培养
2N6-AS 共培养
N6DS 筛选
MS-NK 再分化
MS-HF 生根
AB 农杆菌生长
MSL 侵染
N6D 1L
Chu N6 Basal Medium w/ Vitamins（PhytoTechnology Laboratories）3.99g
Myo-inositol 0.1g
Proline 2.878g
Casamino acid 0.3g
Sucrose 30g
2.4-D 2mg/L
Gellan gum(Gelrite) 3g/L(分装)
PH5.8
120℃15min
2N6-AS 1L
Chu N6 Basal Medium w/ Vitamins（PhytoTechnology Laboratories）3.99g
Myo-inositol 0.1g
Casamino acid 0.3g
Sucrose 30g
Glucose 10g
2.4-D 2mg/L
Gellan gum(Gelrite) 3g/L(分装)
PH5.8
120℃15min 冷却至50℃加1ml AS（200mg/L）不要吹的太干，该培养基要湿度
高一些较好。
N6DS 1L
Chu N6Basal Medium w/ Vitamins（PhytoTechnology Laboratories）3.99g
Myo-inositol 0.1g
Proline 2.878g
Casamino acid 0.3g
Sucrose 30g
2.4-D 2mg/L
Gellan gum(Gelrite) 3g/L(分装)
水稻转基因方法及培养基配放个
根癌农杆菌介导的转化方法
将水稻成熟种子去壳。仔细剔除有霉菌点籽粒，取饱满清亮籽粒先用７０％乙醇浸泡（表面消毒）1min ，再用含2%活性氯含量的NaClO溶液（加1-3滴Tween20）浸泡30min以上（最长可至1小时左右），并不断摇动，然后用无菌水冲洗4-5次；
将灭菌后的成熟种子置于无菌滤纸上吸干多余水分，直接接种于N2D6培养基上，于24-26ｏC暗培养7-10 天，诱导出初生愈伤组织；将上述从成熟胚诱导的初生愈伤组织直接用于与农杆菌的共培养转化；
农杆菌的准备是在含有50mg/mL km的LB 平板上划线，培养含有重组质粒的农杆菌，28ｏC培养36h。挑取活化的单个农杆菌菌落，在28ｏC于3mL 含km 的LB培养基中振荡培养过夜，第2天按1.5/50（V/V）接种量在AB液体培养基中培养，培养程度以稍早于生长对数期为宜（OD600约为0.6-0.8 ）。离心回收新鲜培养的农杆菌，并重悬于约1/2-1/3体积的AAM（含100-400mol·L-1乙酰丁香酮）液体培养基中，至OD600约为0.8-1.0左右为宜；将愈伤组织切下，立即投入含农杆菌的AAM重悬液中，浸泡15-20分钟，并不断摇动。将感染后的愈伤组织置于无菌滤纸上吸干多余的菌液，转入共培养基N6D2C上培养3天（26ｏC，暗培养）。转入筛选培养基N6D2S1上与24-26ｏC 暗培养条件下筛选2周。
新鲜长出的抗性愈伤组织或不褐化的愈伤组织转入筛选培养基N6D2S2上，继续筛选培养2次，每次2周。将抗性愈伤组织转入MSPR培养基上进行预分化处理14天，其中先在暗条件下培养7天，然后转入光条件下培养7天；经预分化处理的愈伤组织转入MSR培养基分化再生，在光下培养；再生的小苗在1/2MS0培养基上生根壮苗。
转基因水稻的原理
转基因水稻的原理
转基因水稻的原理是通过将具有特定基因的外源DNA导入到水稻细胞中，并使其正常表达，在水稻中产生所需的特定性状。转基因水稻的原理主要包括以下几个步骤：
1. 基因选择：选择具有所需特性的基因，这些基因可以来自同一物种或其他物种。例如，选择具有抗虫性、抗草木得、耐盐碱等性状的基因。
2. 基因克隆：将选定的基因从其原始来源中克隆出来，通常使用PCR等分子生物学技术来扩增目标基因序列。
3. 插入载体：将目标基因插入携带基因转移所需的DNA片段的载体中。常用的载体是冠状病毒、细菌或酵母等。
4. 基因转移：将插入载体的基因导入到水稻细胞中。目前常用的方法有农杆菌介导转化和基因枪转化等。转化过程中，目标基因被导入水稻细胞的染色体中。
5. 基因整合和表达：插入的基因在水稻细胞中整合到染色体上，并在细胞的遗传物质DNA中被正常复制和遗传。转基因水稻的这些细胞和后代可以继续表达改良后的特性。
6. 选育和鉴定：基于获得的转基因水稻植株，进行纯系选育和鉴定，确保其稳
定性和所需特性的遗传传递。
通过这些步骤，转基因水稻可以获得具有所需特性的水稻品种，以提高水稻的抗病虫害、抗逆性、增加产量等特性，进而提高农作物的生产效益。
转基因水稻中间试验要求
转基因水稻中间试验要求
1.实验目的和设计：中间试验应明确实验目的，并且在试验设
计中包括转基因水稻的基因转导方法、检测方法、结果分析等。
2.样本获取和处理：中间试验应使用符合转基因水稻要求的样本，包括转基因水稻种子、培养细胞等。在样本处理过程中，应按照转基因水稻的特点，采取适当的处理方法。
3.环境监测和管理：在中间试验过程中，应监测和管理试验环境，包括温度、湿度、光照等条件的控制，以及病虫害防治等。
4.基因检测和分析：中间试验应使用准确的基因检测方法，确
认转基因水稻中是否成功转导了目标基因。此外，还需要对转基因水稻的性状、产量、抗病虫性等进行分析。
5.安全评估和风险评估：中间试验还需要对转基因水稻的安全
性和风险进行评估，包括对人类、动物和环境等方面的影响评估。
6.试验记录和数据分析：中间试验应详细记录试验过程中的各
项数据，并进行统计和分析，以验证试验结果的有效性和可靠性。
7.伦理审查和法律合规：中间试验应符合伦理审查和法律法规
的要求，确保试验过程符合科学伦理和法律要求。
以上是转基因水稻中间试验的一些基本要求，具体要求还可以根据实验具体情况和法律法规的要求进行确定。
水稻转基因步骤
在植物转基因过程中，为了有效地识别和筛选转化子，常将目的基因和标记基因构建在同一表达载体中。这种载体结构导致转基因植物中目的基因和标记基因始终共存，而标记基因（尤其是抗生素抗性基因）的存在可能给转基因植物的生物安全带来隐患。目前已研发了多种方法剔除转基因植物中的标记基因，其中最常见的是共转化法(Komari 1996，McCormac 等2001)。共转化系统是采用2个质粒或1个含有两套T—DNA表达盒的表达载体共同转化植物，其中一套表达盒含有抗性选择标记基因，另一套表达盒含有目的基因，它们转化植物时可能整合到植物基因组的不同位置。转基因植株在减数分裂过程中，标记基因和目的基因发生分离，从而可在转基因后代中筛选到只含目的基因而不含选择标记基因的个体。共转化从根本上排除了转基因植物中的选择标记，是保证人畜和环境安全的重要措施，因此受到了广泛的重视。Zhou 等（2003）认为，用分别含一个T-DNA区的两个载体共转化的效率低于双T-DNA区表达载体的共转化效率。目前关于利用双T-DNA区表达载体，获得无选择标记转基因阳性株系的研究已有不少报道（唐俐等2006，张秀春等2006，于恒秀等2005）。花药培养与遗传转化技术相结合，可以快速获得纯合转基因植株（斯华敏等，1999，付亚萍等，2001），但是应用花药培养快速获得只含目的基因而无选择标记的转基因研究尚未见报告。
水稻是最主要的粮食作物，转基因水稻的安全显得尤为重要。本实验室通过农杆菌介导的水稻转化体系，将包含人乳铁蛋白(hLF)、高赖氨酸(SB401)、高甲硫氨酸(RZ10)基因的表达载体p13HSR成功转化脆茎稻，由于该表达载体采用双T-DNA结构，将检测出含选择标记潮霉素磷酸转移酶基因（hpt）和目的基因的转基因阳性T0植株按单株直接进行花药培养。在189株二倍体花培植株中检出23株有目的基因没有选择标记hpt的转基因纯合植株，得率为9.87％。RT-PCR检测结果显示外源基因已整合到转基因水稻基因组中并转录。本文首次发现插入的外源基因间存在交换事件，从而改变了花培群体中无选择标记而目的基因阳性的转基因纯系的获得率。同时还对农杆菌介导的同一载体上多个基因转化水稻后，会出现个别基因丢失的情况进行了讨论。
水稻转基因实验技术手册
水稻转基因实验技术手册
遗传工程实验室
Genetic Engineering Laboratory Discipline of Crop Genetics and Breeding
Fujian agricultural and Forestry University
目录
第一章DNA提取与纯化
第二章引物设计与PCR
第三章感受态细胞制备与转化（E. coli & 农杆菌）第四章电泳技术、琼脂糖凝胶DNA回收
第五章质粒回收
第六章RT-PCR
第七章构建载体
互补实验
过量表达
GFP
GUS
RNAi
第八章水稻组织培养
第九章原位杂交
第十章石蜡切片技术
第十一章扫描电子显微镜
附录：
第一章SDS-DNA微量提取法
1、取新鲜叶片5cm 左右于1.5ml 离心管中，加入液氮研磨（电钻）。
2、加入700μl 预热至65℃的SDS 抽提液，迅速搅匀后置于65℃水浴30min 。
3、加入200μl 5M KAc ，颠倒混匀，-20℃冰浴30min 后，10,000rpm 离心5min ，将上清夜倒入另一新的1.5ml 离心管中。
注：若溶液中仍有植物组织，可进行二次离心。 4、加入等体积的异丙醇（700 μl ），-20℃冰浴30min ，11,000rpm 离心5min 。 5、弃上清，加入70%乙醇清洗液晾干。
6、将风干的DNA 溶于100 μl TE 溶液中，55℃水浴溶解1h ，再室温放置1d 。 实验准备：
溶液配制：
SDS-抽提液：
1M Tris-HCl ：100ml 5M NaCl ：100ml 0.5M EDTA ：100ml 10% SDS ：125ml
转基因水稻筛选流程
转基因水稻筛选流程
今天我们要聊聊转基因水稻筛选流程是怎样的，对于转基因水稻筛选流程可能大家觉得它听起来很难懂的样子，但其实不难懂，接下来让我们一起来探索转基因水稻筛选流程！要探讨转基因水稻筛选流程，我们要先想清楚，弄明白什么是转基因水稻。
搞明白什么是转基因水稻之后，就可以准备进行筛选的流程了，筛选肯定是要选择，那么咱们要先来确定想要什么样的水稻，比如产量高方面的要求、抗病强的要求等。经过筛选后的水稻就初步合格了，再把这些合格的水稻种在稻田里，让它们得到充分的生长。在通过一系列的过程进行严格筛选，这一步很关键，通过严格的筛选，就会挑出合格的转基因水稻。这些水稻再用分子检测，确认一下它们基因是否成功的转入。然后下一个关节是田间试验，看看这些转基因水稻在大田里生长的怎么样。全方位的将这些转基因水稻进行安全性评估，这一步至关重要！因为这一步是确定它们是不是对人类和环境都安全。
转基因稻米收割后，需要进行品质的检测，得看看这些水稻的是不是符合质量的标准，是不是达到了我们的预期要求。
在最后，还要将这些检测的稻米进综合评价，一定要确定这些转基因水稻可以大规模种植，这样咱们就能用上这些品质更优、产量更高产的水稻啦！
以上就是我整理的转基因水稻筛选流程！大家明白了吗？。
水稻转基因实验方法与步骤
水稻转基因实验操作方法步骤
一、水稻愈伤组织的诱导
（一）以水稻幼胚为试材诱导愈伤组织
1．消毒：
取水稻未成熟种子（灌浆期），按以下步骤消毒：
1）用自来水冲洗种子，去掉浮起的瘪谷；
2）将种子放入250ml无菌烧杯中（种子数量约占1/3体积），用200ml70%酒精消毒2分钟；（在操净工作台上进行无菌操作）
3）加入250ml25%次氯酸钠（NaClO）溶液，同时加数滴吐温-20，浸泡90分钟；
4）倒去NaClO溶液，用无菌蒸馏水清洗种子4-5遍。
2．诱导与继代培养：（以下步骤需无菌操作）
1）用镊子夹住种子，在无菌滤纸上用钢钩挤出幼胚，置入诱导培养基中；2）操作完毕后封好培养皿（一般保鲜膜），在暗处适温下（25-28℃）培养5天；3）继代培养。用镊子剥下胚性愈伤组织（去掉芽及膜状物），置入继代培养基中（凸起面向上），暗处适温下（25-28℃）培养3天。
（二）以水稻成熟胚为试材诱导愈伤组织
1．消毒：
取水稻成熟种子，人工或者机械脱壳，挑选饱满光洁无菌斑的种子，按以下步骤消毒：1）将适量种子放入10ml离心管中（100颗左右），倒入75%酒精消毒2分钟；
2）倒去酒精，加入一定量的0.1%升汞溶液，浸泡10分钟；
3）倒去次氯酸钠溶液，用无菌蒸馏水清洗种子5-6遍，最后一遍浸泡30分钟。2．诱导与继代培养：（以下步骤需无菌操作）
1）种子放在无菌滤纸上吸干，置入成就胚诱导培养基中，每皿12－14颗；
2）操作完毕用封口膜（MicroporeTMSurgicalTape）封好培养皿，在28℃光照培养箱，暗培养培养3周；
水稻基因敲除实验方法
水稻基因敲除实验方法
水稻基因敲除实验一般通过利用转基因技术或重组腺病毒技术实现。转基因技术可以把特定基因经过特殊处理加入水稻基因组中，从而获得缺少该基因的水稻突变体。重组腺病毒技术主要是把候选基因的抑制效应的基因片段，通过腺病毒载体转入水稻细胞，最终在水稻细胞中得到基因组中所需的突变体。这两种技术都可以用来获得水稻基因敲除，但是转基因技术更安全，比较容易实现，相对来说效率也更高。通常，将转基因技术用于水稻基因敲除的实验步骤为：1）开发载体，使用植物表达载体，这种载体能够实现含有尽可能多的外源基因片段的全长核酸；2）获取植物芽孢子衍生的有丝分裂细胞，使用含有候选基因片段的载体对细胞进行转化；3）把转化后的细胞移植到实验培养基上培养，从中得到突变体；4）然后对突变体进行分子遗传分析，确定基因突变类型；5）最后，进行功能性鉴定，即查看突变体在发育、生长、营养、抗病等方面是否有变化。
通过这种方式，可以获得缺少某个基因的水稻突变体，为水稻遗传育种提供了重要的实验参考。
实验七转基因水稻报告基因的检测
gus被称为转基因植物的报告基因。
未转基因植物中，β-葡萄糖醛酸糖苷酶酶及其所催化的反 应几乎完全不存在。
Xh LB 35S-ter Xh E Sa P E P S X B Sa
B
H
RB
hpt
35S-pro
232Wx-pro
232Int1 Wx frag
gus
Nos-ter
三、实验步骤
1.取转基因稻米24粒，剥去颖壳。 2.各切1/4胚乳放置于96孔板中，加适量X-gluc溶液 10ul。 3.37º C保温2小时。 4.GUS+、GUS- 计数，并计算比值。
实验七 转基因水稻GUS报告基因的检测
一、实验目的 通过本实验掌握在转基因植物中检测GUS报告 基因（gus）表达活性的操作方法，并掌握通过 GUS阳性和阴性分离比推测外源基因整合的拷贝数。
二、实验原理
gus存在某些细菌中，编码β-葡萄糖醛酸糖苷酶，该酶的
作用底物是无色的X-葡萄糖苷酸（简称X-gluc）。当把表达β葡萄糖醛酸糖苷酶的转基因植物组织与X-gluc一起温育时，该 酶就会将反应体系中无色的X-gluc底物水解产生出深蓝色的5溴-4氯靛蓝。该反应很容易用普通的生化反应检测出来，由此
四、作业 1.目前在转基因植物研究中常用的报告基因有哪些Hale Waihona Puke Baidu 2.可采用哪些方法对GUS报告基因进行检测？
转基因水稻
转基因稻米可能通过以下途径对环境和农业经济造成不利影响。
a.杂草问题
转基因稻米对杂草稻或野生稻的基因流(植物间通过交叉授粉而发生的基因流动)将是有害的。如果基因流将 外源基因转入到杂草稻和/或红稻中，可能会增加它们的竞争优势而使其变得更为麻烦，农民将为杀死它们而施用 更多的有毒化学品。例如，抗虫或抗病基因的转入将会增加红稻的竞争优势。
类似的转基因大米试吃活动已在中国国28个城市开展，都是华中农业大学为活动提供所需的转基因大米。而 这一次，还加入了刚刚收割不久的、由其自身研究种植的“黄金大米”。
中国科学院院士、华中农业大学生命科学学院院长张启发，在活动中作了题为《作物育种的主要发展趋......
华中农业大学将转基因大米正做猕猴喂养实验，专家自己连吃14年。对于转基因水稻的安全性，有“反转派” 质疑实验作假，要求公开。
“杂交水稻之父”袁隆平在接受媒体采访时曾表示，“转基因不能一概而论”。他认为转基因也是今后的发 展方向，同时透露他也正在进行转基因水稻的相关研究。 袁隆平认为：“虽然我国杂交水稻技术在国际上领先， 但如果不加强分子育种技术研究，短则五年、长则十年，我国的杂交水稻技术就要落后国际水平了。”转基因技 术是分子技术中的一类，因此必须加强转基因技术的研究和应用，没有技术就没有地位。
中国国产的转基因水稻已在美国获得食用许可。
背景技术
转基因生物技术的研究，大多分布在抗虫基因工程、抗盐基因工程、抗病基因工程、抗逆基因工程、品质基 因工程、品质改良基因工程、控制发育的基因工程等领域。如抗虫基因工程将Bt基因导入棉花、玉米、水稻、烟 草、马铃薯等作物，毒杀害虫；或将胶蛋白酶抑制剂基因导入作物，干扰害虫消化作用，而导致害虫死亡。
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水稻转基因实验操作方法步骤
一、水稻愈伤组织的诱导
（一）以水稻幼胚为试材诱导愈伤组织
1．消毒：
取水稻未成熟种子（灌浆期），按以下步骤消毒：
1）用自来水冲洗种子，去掉浮起的瘪谷；
2）将种子放入250ml无菌烧杯中(种子数量约占1/3体积)，用200ml 70%酒精消毒2分钟；（在操净工作台上进行无菌操作）
3）加入250ml 25%次氯酸钠（NaClO）溶液，同时加数滴吐温-20，浸泡90分钟；
4）倒去NaClO溶液，用无菌蒸馏水清洗种子4-5遍。
2．诱导与继代培养：（以下步骤需无菌操作）
1）用镊子夹住种子，在无菌滤纸上用钢钩挤出幼胚，置入诱导培养基中；
2）操作完毕后封好培养皿(一般保鲜膜)，在暗处适温下（25-28℃）培养5天；
3）继代培养。用镊子剥下胚性愈伤组织（去掉芽及膜状物），置入继代培养基中（凸起面向上），暗处适温下（25-28℃）培养3天。
（二）以水稻成熟胚为试材诱导愈伤组织
1．消毒：
取水稻成熟种子，人工或者机械脱壳，挑选饱满光洁无菌斑的种子，按以下步骤消毒：1）将适量种子放入10ml离心管中（100颗左右），倒入75%酒精消毒2分钟；
2）倒去酒精，加入一定量的0.1%升汞溶液，浸泡10分钟；
3) 倒去次氯酸钠溶液，用无菌蒸馏水清洗种子5-6遍，最后一遍浸泡30分钟。
2．诱导与继代培养：（以下步骤需无菌操作）
1）种子放在无菌滤纸上吸干，置入成就胚诱导培养基中，每皿12－14颗；
2）操作完毕用封口膜（Micropore TM Surgical Tape）封好培养皿，在28℃光照培养箱，暗培养培养3周；
3）在超净工作台上打开培养皿，用镊子挑取自然分裂的胚性愈伤组织（淡黄色，致密呈球状，去除种子和芽），置入继代培养基中，在28℃光照培养箱，继代培养1周
（2周愈伤组织更为松散）。（如不马上用，需转移至暗处，于22℃继续培养1周）
二、农杆菌培养
挑取农杆菌单克隆或吸取所保藏的农杆菌菌液100µl于4ml YEP（含50mg/lKan和50mg/l Str）培养液中，28℃，250rpm振荡培养20-36h至菌液OD600为0.8-1.0（颜色接近橙黄色）。
三、共培养和抗性愈伤组织的选择
1．感菌与共培养：
1）取培养好的菌液500µl于1.5ml离心管中，4℃，4000rmp，离心2min，去上清。用含200umol/l As的30ml AAM感菌液制成悬浮液，使菌液OD600的终浓度为0.01
（0.08-0.1）；
2）将长到一定大小的水稻愈伤组织挑出，放入农杆菌悬浮液侵染5分钟；
3）将愈伤组织取出，置于无菌的滤纸上沥干30-40分钟；
4）将愈伤组织置于共培养基上。25℃暗培养2-3天（表面会长有薄薄的一层农杆菌）。2．选择：
1）将愈伤组织取出，用无菌水清洗5-6次（多次洗会更好），其间需不停的振荡。再用含250mg/l羧苄青霉素钠的无菌水清洗1~2遍。最后置于无菌滤纸上沥干2小
时；
2）将晾干的愈伤转入含250mg/l Carbenicillin（羧苄青霉素钠）和50mg/l潮霉素的选择培养基上进行第一轮选择，28℃，光照培养14天（若农杆菌无法抑制，可加
大抗生素浓度，最大用过500mg/l）；
3）将长有抗性愈伤的初始愈伤转到含250mg/l Carbenicillin和50mg/l潮霉素的培养基上进行第二轮选择，28℃，光照培养，直到颗粒性的抗性愈伤组织长出。
四、抗性愈伤组织的预分化（可选）
将新长出的抗性愈伤组织转入预分化培养基中，25℃，光照培养7天。
五、抗性愈伤组织的诱导分化和生根
挑取从同一愈伤来的颜色鲜黄的抗性愈伤3-4颗，移入装有分化培养基的培养皿或塑料广口瓶中（每皿或每瓶放置5-7颗），用封口膜封好，放入恒温培养室中，28℃，光照培养(16h光/8h暗)，等待分化成苗（15-30天）。待苗长至1cm左右，放入生根培养基中壮苗注：以上一至五的操作步骤皆在无菌条件下进行。
六、转基因苗的锻炼和移栽
转基因苗从分化到移栽最短时间为两个月左右。将苗根部和茎叶分化得较完好的试管挑
出（苗长至试管顶部，就要及时开盖），打开封口膜，加入适量蒸馏水或无菌水（防止培养基长菌），炼苗3天至一周左右，然后洗去琼脂，移栽到温室的土钵中生长，检测。
附录：
各种母液及培养基的配制方法 一、溶液配制
0.1%升汞：小心称取1克HgCl ，用少量蒸馏水溶解后，定容至1000ml 。 25%次氯酸钠溶液：量取250mlNaClO ，用蒸馏水定容至1000ml 。 激素溶液配制方法： KT 加少量稀碱（1M NaOH ）溶解，再用蒸馏水定容 1 mg/ml 6-BA 加稀碱(同上)或盐酸溶解，再用蒸馏水定容 1 mg/ml NAA 加碱溶解（1M NaOH ），再用蒸馏水定容 1 mg/ml 2，4-D 加少量稀碱或酒精溶解，再用蒸馏水定容 1 mg/ml ABA 先用乙醇溶解，再用蒸馏水定容
1 mg/ml
水稻培养液配方（贮备液）：
试 剂
每10升溶液中的克数
1．NH 4NO 3 914 2．NaH 2PO 4·2H 2O 403 3．K 2SO 4 714 4．CaCl 2 886 5．MgSO 4·7H 2O 3240
6．MnCl 2·4H 2O 15.0 分别溶解后加500ml 浓硫酸，然后再加蒸馏水到10L 。 （NH 4）6·Mo 7O 24·4H 2O
0.74 H 3BO 3 9.34 ZnSO 4·7H 2O 0.35 CuSO 4·5H 2O 0.31 FeCl 3·6H 2O 77.0 柠檬酸（-水合物）
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*使用时，每4L 培养液中加1号~6号贮备液，各5ml 。为使水稻生长健壮，可另加SiO 2，50ppm~100ppm 。调节pH 值至5.0~5.1。