石蜡切片的基本操作流程

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石蜡切片制作流程

石蜡切片制作流程以石蜡切片制作流程为标题，写一篇文章。

石蜡切片制作是一项常见的实验技术，在生物学、医学和材料科学等领域广泛应用。

石蜡切片可以用于显微镜下的观察和分析，能够提供关于细胞和组织结构的详细信息。

下面将介绍一下石蜡切片的制作流程。

1. 组织固定：首先，需要从感兴趣的样本中取得组织样本，并将其进行固定。

固定是为了保持组织的形态结构和化学成分，常用的固定剂有福尔马林、乙醛等。

固定过程中，需要确保样本完全浸泡在固定液中，通常需要数小时至数天的时间，以确保组织被充分固定。

2. 脱水：固定后的组织样本需要进行脱水处理，以去除其中的水分。

脱水是将样本中的水分逐渐替代为有机溶剂，常用的有乙醇、丙酮等。

通常采用递增浓度的有机溶剂，从低浓度逐渐提高到高浓度。

每个浓度的脱水液中，样本需要浸泡一定的时间，以确保脱水彻底。

3. 渗透：脱水后的组织样本需要进行渗透处理，以使其与石蜡更好地结合。

渗透剂通常为石蜡溶液，可以将样本浸泡在石蜡溶液中，以使其逐渐渗透进入组织内部。

渗透过程中，需要注意控制温度和时间，以确保渗透均匀。

4. 包埋：渗透后的组织样本需要进行包埋处理，即将其嵌入到石蜡中。

首先，将组织样本放置在石蜡模具中，并加入适量的石蜡。

然后，将模具放入石蜡包埋机中，利用加热和真空等处理，使石蜡与组织样本充分结合。

包埋过程中需要严格控制温度和时间，以确保石蜡固化完全。

5. 切片：包埋后的组织样本需要进行切片处理，以获取薄片供观察。

首先，使用切片机将石蜡块切割成薄片。

然后，将薄片置于载玻片上，并加热使其与载玻片结合。

最后，使用刮片等工具将石蜡薄片修整成所需的形状和大小。

6. 然后，对切片进行染色处理，以增强对组织结构的观察。

常用的染色方法有血液学染色、免疫组化染色等。

染色后，可以使用显微镜观察和分析切片中的细胞和组织结构。

总结起来，石蜡切片制作流程包括组织固定、脱水、渗透、包埋、切片和染色等步骤。

每个步骤都需要严格控制条件和时间，以确保制作出高质量的石蜡切片。

石蜡切片免疫组化步骤

石蜡切片免疫组化步骤1.石蜡切片放置在60℃恒温箱中烘烤120分钟。

2.脱蜡和水化：二甲苯(20min)→二甲苯(20min)→无水乙醇(10min)→95%乙醇(10min)→90乙醇(10min)→80%(10min)4.抗原修复：柠檬酸钠缓冲液95度，10分钟. (枸橼酸三钠3g枸橼酸0.4g然后加水到950毫升左右，然后用NaOH或HCI调pH值6.0，最后定容在1000ml)5. PBS浸洗2次各5min6.加3%H2O2孵育5min(室温或37度，避光)。

肝组织过氧化物酶含量高。

需增加浓度或增长时间。

蒸馏水洗2minx3次8.pbs-曲拉通通透（pv法不需要）9.与二抗种属一致的血清封闭非特异位点。

（pv法不需要）9.滴加一抗4℃过夜10.PBS浸洗3次各5min11.滴加二抗室温或37℃孵育30min12.PBS洗3次各5min15.DAB显色5~20min，自来水充分涮洗16.苏木素复染2~3min，自来水充分涮洗17.氨水反蓝，过蓝可用盐酸酒精分化2s，自来水充分涮洗.用稀氨水返蓝，自来水里加几滴稀氨水，就行了，返蓝时间5分钟左右，就很好看了;淡氨水有人用50ml自来水＋三四滴的氢氧化铵；18.脱水、透明80%(5min)→90%(5min)→95%(5min)→100%(5min)→ 100%(5min)→二甲苯(10min)→二甲苯(10min)19.封片：中性树脂，加盖玻片(组织部位切勿残留小气泡)，自然晾干二、操作流程1、脱蜡和水化脱蜡前，应将组织芯片放在60℃恒温箱中烘烤2h以上，然后按以下流程进行：二甲苯Ⅰ（1h）、二甲苯Ⅱ（30min）、100%酒精（30min）、95%酒精（15min）、70%酒精（15min）、50%酒精（15min）、蒸馏水（15min）2、3%H2O2，室温封闭5～10分钟，消除内源性过氧化物酶的活性。

3、甩去H2O2，蒸馏水洗2min×3次。

石蜡切片的操作流程

在显微镜下观察植物体内部的细微结构之前,必须根据植物材料的特性,采用不同的方法,对植物材料进行处理,把材料制成透明的玻片标本.根据材料的性质和制作法的不同,常用的植物显微制片技术可以分为切片法与非切片法两大类,前者常用的有徒手切片法,冰冻切片法,火棉胶切片法,石蜡切片法,冷冻切片法等,其中以石蜡切片法最为常用.后者包括整体封藏法,涂布法,压片法等.石蜡切片法石蜡切片法是以石蜡作包埋剂,用旋转切片机将材料切成薄片,经一系列处理制成永久制片的方法.在研究植物的细胞,组织,胚胎以及形态等方面石蜡切片法是最理想的制片方法.石蜡切片法的一般流程为:取材→固定→抽气→洗涤→脱水→透明→浸蜡→包埋→修块→切片→粘片→染色→封片.取材用锋利的刀片切取新鲜的植物材料,选定适宜的材料,立即固定. 取材的注意事项如下:(1)取材料要新鲜.动作要迅速,以免挤压损坏组织;取病理材料时,应设置对照材料.(2)所取材料大小要适当:根和茎一般直径≤5mm,切取成5-10mm 小段;叶片一般取过中脉处,切成2-5mm宽,5-8mm长.在切材料时,必须注意刀片与中轴成直角,两切面平行,否则制成的切片细胞是斜的. 雌,雄蕊一般不需分割.(3)取材时间可根据切片要求有所区别.如:在进行植物发育的研究过程时,需要找到细胞分裂相,一般在晴天的早晨9:00-10:00时取材,此时植物细胞分裂活动较明显.(4)取材不易过老,否则制片有难度(过老的材料须在滑走切片机上进行);对纵切的材料适当多取材,如根尖,茎尖等,因为切到材料正中的概率较低.(二)固定将已切好的材料尽快地浸入相当于材料10-15倍体积的固定液中.借助固定液的作用,使细胞的新陈代谢瞬时停止,并保持细胞或组织的形态构造及其内含物的状态不发生变化.从而达到使组织变硬从而便于切片,增强内含物的折光度,令细胞易于着色的目的,同时具有防腐作用.以新鲜配制固定液效果较好.固定的时间依材料的种类,性质,大小等而定.材料固定完毕,保存于加盖的容器内,贴上标签.良好的固定剂,应是穿透力强,使细胞立刻致死,原生质全部凝固;不发生任何变形,增强折光率,并且不妨碍染色.常用固定液:简单固定液以一种化学药品配制的固定液.⑴乙醇为凝固型固定剂.常用无水乙醇或95%乙醇.⑵甲醛为非凝固性固定剂.具强烈刺激性气味.纯净的甲醛为无色透明液体.固定用的浓度为4%-10%.⑶醋酸为凝固型固定剂.为无色透明的液体,刺激性极强,低温下凝结成冰,故又名冰醋酸.2. 混合固定液:由几种试剂,适量配制而成.混合遵循原则:①优缺点互补;②膨胀与收缩相互平衡;③强氧化剂与还原剂应分别配置.常用混合固定液有下列几种:⑴ FAA 固定液(福尔马林-冰醋酸-乙醇) 广泛适用于根,茎,叶,花药,子房的组织切片,所以又称为万能固定液.一般固定时间不低于24 h.该固定液优点是在较低温度下(10℃左右)适用于材料的长期保存,可兼作保存液.并且固定的材料,不妨碍染色,但用于细胞学上的固定效果较差.⑵纳瓦兴(Navaschjn's)固定液 1912年首创.适用于细胞学与组织学研究的切片观察.但渗透慢,不能长期保存;主要用于显示分裂相.(三)抽气植物材料内部多由于含有空气,导致固定液不能完全深入.材料投入固定液后需要立即抽气.以便让固定液有效透入材料组织中,并排除材料内气泡的干扰.一般抽气时间为20-30 min.抽过气的材料在停止抽气,应沉入底部.(四)洗涤固定液中的成分有可能会妨碍染色或发生沉淀或结晶,影响观察;有的还会继续作用,使材料变质等.因此,在使用材料时,需根据固定液的种类,用水,缓冲液或70%乙醇洗去渗入细胞内部的固定液.如:用FAA固定的材料在脱水时用70%乙醇反复洗涤数次.如用水洗涤,可将材料自固定液中取出,放入指形管,加入半管水,用纱布将管口扎紧,置于水槽内,进行流水冲洗.流水冲洗时间一般为12-24 h.(五)脱水材料经洗涤后含有部分水分,会使材料分解.而且透明剂与水是不相混合的,不利于材料的透明和包埋等后期处理.因此需用脱水剂逐渐除去材料中的水分,以便让石蜡渗透进细胞.所以,脱水是制片的关键环节.脱水剂要求能与水混合,而且能与其他有机溶剂互相替代.脱水必须在有盖的玻璃器皿中进行,防止吸收空气中的水分;在更换高一级的脱水剂时,最好不要移动材料,以免损坏材料. (六)透明透明剂要具有既能与脱水剂相混合又能和石蜡相混合的性质,可以将材料中的脱水剂置换出来,使石蜡能顺利进入材料中.二甲苯是目前应用最广的透明剂,作用迅速,但易使材料变脆..(七)浸蜡是指逐步清除材料中的透明剂,以使石蜡充分渗透于材料内部的过程.这样,材料的各部分都能保持原来的结构与位置,切片不致发生破裂或其他变形.浸蜡是一个渐进的过程,常用的正丁醇.每次浸蜡的时间,视材料大小而调节.(八)包埋材料经过足够时间的浸蜡后,需包入蜡块,以备切片.操作方法:根据切片材料大小,确定所需纸盒的尺寸,用表面光滑的磅纸预先叠好纸盒.(九)切片即将包埋好的材料块用切片机切成所需厚度的切片带.(十)贴片是用黏贴剂把切片平铺贴在载玻片上,以便于染色和观察.常用的粘片剂有下列二种:(1) 明胶黏片剂(2) 蛋清黏片剂(十一) 染色即根据植物细胞中不同的化学性质,用染料分别进行染色,以利于观察切片中细胞与组织的形态与构造及其内含物等.染色基本程序为脱蜡,染色,分色封片.染色方法可分为下列几类:①单染只用一种染料染色.②双重染色两种染料染色,如番红--固绿;苏木精---曙红.③多重染色多种染料染色,如番红—固绿—桔红G;酸性品红—苯胺蓝—桔红G等.(十二) 封藏封藏于中性树胶中,使材料能在显微镜下清晰地显示出来,并能长期保存.方法:将含材料的载玻片放在吸水纸上(切片一面向上),迅速地在切片的中央滴一滴树胶(必须在二甲苯干燥前进行),用右手持小镊子轻轻地夹住盖玻片的右侧,稍微倾斜使其左侧与封藏剂接触,然后再缓慢地放下,避免产生气泡.。

石蜡切片的基本操作流程

石蜡切片的基本操作流程石蜡切片是一种常用的组织学技术，用于制备组织切片，以便进行显微镜观察和研究。

以下是石蜡切片的基本操作流程：1. 组织固定：首先，将待切片的组织标本进行固定，以保持组织结构的完整性和稳定性。

常用的固定剂包括福尔马林、酒精和乙醛等。

固定时间的长短取决于组织的大小和类型，一般为数小时至数天。

2. 组织去水化：固定后的组织需要去除固定剂并脱水，以防止切片过程中的破损和变形。

通常采用逐渐增加乙醇浓度的脱水步骤，常见的乙醇浓度为70%、80%、90%和100%。

3. 组织浸渍：脱水后，组织需要进一步浸渍到石蜡中，以增加组织的硬度和支持性。

首先将组织放入浸渍剂中，如甲醛或乙醇中的苯麻油，然后逐渐增加石蜡浓度，常见的石蜡浓度为50%、70%和100%。

4. 组织包埋：在组织浸渍后，将组织放入包埋模具中，然后倒入熔化的石蜡，使其完全包裹住组织。

包埋完成后，将模具放入冷却台或冷冻器中，使石蜡迅速固化。

5. 石蜡切片：将冷却固化的石蜡块从模具中取出，使用切片机将其切割成薄片。

切片机通常配有刀片、切片夹和切片盒等工具，切片时需要注意切片的方向和角度，以获取最佳的切片效果。

6. 切片染色：切片完成后，可以对切片进行染色，以便更好地观察和分析组织结构和细胞形态。

常用的染色方法包括血液染色、组织染色和免疫组化染色等。

7. 切片封片：染色后，将切片放置在载玻片上，并使用透明的封片剂将其覆盖。

封片剂可以保护切片，防止切片脱落和变形，并提高显微镜观察的清晰度。

8. 切片观察：最后，将封片的切片放置在显微镜下进行观察和分析。

可以使用不同的显微镜镜头和放大倍数来观察组织细节和细胞结构，同时可以使用图像分析软件对切片图像进行处理和测量。

总体而言，石蜡切片的基本操作流程包括组织固定、去水化、浸渍、包埋、切片、染色、封片和观察等步骤。

每个步骤都需要严格控制条件和操作技巧，以确保获得高质量的组织切片用于研究和诊断。

石蜡切片-小鼠心脏组织-心衰模型-实验步骤

石蜡切片操作流程及步骤：1、样品4℃过夜[1,2]。

2、清洗水槽及过滤网[3]。

3、打开机器开关，调节水池温度21℃、展片水池温度45℃、烘片温度55℃[4]。

4、固定包埋组织块[5]。

5、调节出水水流大小[6]。

6、调节切片厚度5um、10 um[7]。

7、将包埋组织块下调至与刀片位置同一平面，前后距离使其与刀片距离恰好接触[8]。

8、开始切片带出现完整的组织切横切面将其随水流传送至水池中[9-13]。

9、选择较好的切片，用载玻片将其从21℃水池中捞出。

每个石蜡取5-6张片子[14-15]。

10、放到展片水池中展开、载玻片编号[16]。

11、55℃烘干，无水滴后可收片。

心得体会及注意事项：1、包埋组织块冻存温度过低会冻坏，不冻存石蜡粘性大不容易切片。

2、操作期间应放入冰中储存，自备冰块。

3、水槽中石蜡会堵塞上水滤网影响出水速度。

4、展片水池水要在展片前达到预设温度。

5、要固定牢固，固定不牢切片时容易破坏样品。

6、以中间水柱恰好达到刀片位置最佳，水流过小切片不易冲下，水流过大会导致切片破坏。

7、5 um染色效果更佳，根据不同组织染色要求调节切片厚度。

8、若前后位置调节不精确可使距离稍大，随后手动摇轮慢慢靠近，每次前进距离为提前设定距离5um或10 um。

9、切片期间不出现严重的黏附，粘连，裂片，不要轻易停止，切片要匀速.10、切片过薄会迅速升温从0℃升至21℃或更高，若随意停止，石蜡黏附性增加会导致粘刀片等问题影响继续操作。

11、若一个样本操作时间过长应取下放入冰块一段时间再继续操作。

12、原则没有大问题匀速不要随意停。

13、换新刀片（刀片上有黏附石蜡会导致切片裂开，最好换至新刀片）。

14、尽量清理水池多余无用切片及碎石蜡，但是要小心不要碰坏样品切片。

15、每个载玻片取2-3个组织最佳。

16、展片不足会有褶皱影响染色结果，展片时间过长会导致组织裂开。

宫颈石蜡切片样本FISH实验流程

宫颈石蜡切片样本FISH实验流程一．玻片预处理1.室温，二甲苯10分钟2次2.室温，100%乙醇5分钟3.室温，100％乙醇、85％乙醇、70％乙醇各2分钟4.室温，去离子水3分钟，用无绒纸巾吸取多余的水分5.两种选择：（1）90℃，去离子水煮10-15分钟。

因片子组织不一样，选择不同的时间。

注意不要因水沸腾太厉害，导致脱片。

在水煮中途，要观察是否出现脱片。

（2）50%酸性亚硫酸钠30分钟。

6.37℃，蛋白酶消化：取0.4ml蛋白酶K储存液（20mg/ml）溶于40ml 2×SSC(pH7.0) 得到蛋白酶K工作液（200µg/ml）7.室温，2×SSC 5分钟2次8.室温，甲醛固定10分钟（甲醛＝1ml市售甲醛＋39ｍｌＰＢＳ＋0.18g MgCL2）9.室温，70%乙醇、85％乙醇和100％乙醇各3分钟。

10.自然干燥玻片二．变性杂交杂交仪变性（模拟杂交仪变性）杂交1．56℃，烤片2-5分钟2．探针准备：杂交液7μl，去离子水1μl，探针2μl，加入到0.5ml离心管中混匀，离心１～３秒，备用。

3．将10µl探针混合物滴加于玻片杂交区域，立即加盖盖玻片，用橡皮胶封边4．准备杂交仪器，共变性条件，83℃ 5分钟，杂交条件，42℃ 16小时三、玻片洗涤与观察1．46度，2*ssc 10分钟2. 46度，0.1%NP-40/2×SSC 5分钟3．室温，70％乙醇3分钟4．暗处自然干燥玻片5．室温，将15µl DAPI复染剂滴加于玻片杂交区域，立即盖上盖玻片，15分钟后观察。

结果判断：标本为石蜡标本制片：阈值建立采集20例正常人宫颈石蜡标本。

阈值测定：每例分析至少100个细胞，统计出现2个以上TERC信号细胞数目的百分比。

阈值= 平均数（M）+ 3X标准差（SD）结果判断：每例样本计数病变位置的上皮细胞（至少100个），以下为阳性：•大于阈值•小于阈值，但是病变组织出现3个以上异常细胞聚集。

石蜡切片流程

石蜡切片流程一、引言石蜡切片是生物学、医学和材料科学等领域中常用的一种实验技术，用于制备样品的薄片，以便进行显微观察和分析。

本文将介绍石蜡切片的流程及其关键步骤。

二、材料准备1. 石蜡：选择适合的石蜡材料，常见的有硬质石蜡和软质石蜡。

2. 样品：根据需要选择合适的样品，可以是生物组织、细胞、材料等。

3. 切片刀：选择切割尖锐且锋利的切片刀，常见的有玻璃刀片和钢刀片。

4. 切片机：使用专业的切片机设备，保证切片的精准度。

三、石蜡切片流程1. 固定样品：将样品进行固定处理，常用的方法有福尔马林固定、乙醛固定、冷冻固定等。

固定的目的是保持样品的形态结构和生物活性。

2. 除去水分：将固定后的样品通过醇溶液逐渐去除水分，一般采用浓度逐渐降低的醇溶液，如75%乙醇、50%乙醇、30%乙醇等。

3. 渗透石蜡：将去水后的样品用石蜡进行渗透处理。

首先将样品置于较低融点的石蜡中，然后逐渐转移到较高融点的石蜡中，这样可以保证样品逐渐与石蜡融合。

4. 包埋：将渗透后的样品放入石蜡模具中，待石蜡凝固后，取出石蜡块。

5. 切片：使用切片机将石蜡块切割成薄片，切片的厚度根据需要进行调整，一般为4-10微米。

6. 切片处理：将切好的薄片浸泡在温水中，使其展平，并将薄片转移到载玻片上。

7. 固定薄片：将载玻片放入烘箱中，以适当的温度和时间使薄片与载玻片充分固定。

四、注意事项1. 操作环境：保持实验室的清洁和安静，避免灰尘和噪音对实验结果的影响。

2. 刀片处理：在使用切片刀前，先将其清洗干净并消毒，以防止样品污染。

3. 温度控制：石蜡切片的各个步骤中，温度的控制非常重要，可以根据不同的样品选择适当的温度。

4. 切片厚度：不同的样品需要不同的切片厚度，要根据实验需要进行调整。

5. 质量控制：在每个步骤结束后，要对样品的质量进行严格检查，确保切片的质量。

6. 保存条件：切好的石蜡切片应妥善保存，防止受潮或受到外界环境的污染。

五、总结石蜡切片是一种常用的实验技术，通过固定、去水、渗透石蜡、切片等步骤，可以制备出精细的样品薄片，用于显微观察和分析。

石蜡切片的制作过程

石蜡切片的制作过程（一）花药切片制片法1．取材2．固定：FAA液中固定24h，并保存在其中。

3．脱水：经70％乙醇、85%乙醇，每级3~4h，含1%伊红的95％乙醇中3~4h（可以过夜），无水乙醇2次，每次1~2h。

4．透明、加蜡：5级氯仿透明，每级3~4h，纯氯仿2次，每次2h，加碎蜡，然后置36℃温箱中1~2d5．浸渗、包埋：50%、70%蜡各3h，再经纯蜡A、纯蜡B、纯蜡C三杯，每杯1h，包埋。

6．修蜡块、切片：粘蜡块时组织块直立于台木上，并用单面刀片切除先端石蜡，浸水软化后放在切片机上坐横切片，切片厚12μm。

7．展片、粘片、烘片：蜡片先镜检，每张载玻片上放2个蜡片，展片后将材料平放在摊片盘上，放置36℃温箱中烘干。

8．脱蜡、透明：二甲苯脱蜡、透明各1次。

9．染色（番红-固绿双重染色）：在已脱蜡的材料上滴注无水乙醇、95%乙醇、85%乙醇、70%乙醇、50%乙醇、30%乙醇、蒸馏水各4~5s，苯胺番红染色5~10min，用蒸馏水洗去浮色。

10．脱水、透明：各级乙醇脱水（30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇、85%乙醇、95%乙醇），苯胺固绿复染30~40s，再经95%乙醇，无水乙醇，1/2无水乙醇+1/2二甲苯、二甲苯2次，各约4~5s，最后置二甲苯缸中。

11．封片、烘片：加拿大树胶封片。

封片后将材料平放在摊片盘上，放置36℃左右的温箱内烤数天即可烤干。

最后，将干燥好的切片上的浮色擦净，并在玻片的左端粘上标签，注明组织切片的名称、染色方法、固定方法、年月日。

制片日程（二）花芽纵切片制片法1．取材2．固定：FAA液中固定24h，并保存在其中。

3．整染：经70％乙醇、50%乙醇各2~4h，转入爱氏苏木精稀释液（爱氏苏木精原液1份，加入50%乙醇及乙醇各半的混合液1份）中整染2~3d。

4．水洗、反蓝：蒸馏水浸洗，勤换水至无浮色渗出，再转入自来水中，换1~2次水，至样品由紫色变深蓝色为止，共需时约1d。

石蜡切片-流程

微树芯石蜡切片前处理: 固定及软化将取下的微树芯或者大块材料迅速放入新配置的FAA溶液中进行固定。

固定时间需要加长至1周左右，固定时间不能太久，否则FAA中的乙酸和甲醛可能会破坏细胞结构。

将固定后的微树芯或者用凿子采取的材料块切成包含3–5年木质部、形成层、韧皮部区域的小块，放入乙醇甘油(70%乙醇:甘油=1:1)中进行软化，软化时间应大于1周。

通过软化，可使材料变软，浸蜡后容易切片。

但甘油软化会使甘油长期存在于材料中而影响染色效果，因此相应增加染色时间, 在番红溶液中的染色时间增加至3 h。

微树芯石蜡切片制作脱水在低浓度乙醇溶液(30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇、85%乙醇)中的脱水时间以1.5–2.0 h为宜, 而在高浓度乙醇溶液(95%乙醇、100%乙醇I、100%乙醇II)脱水时间应尽量控制在1 h左右。

透明乙醇与石蜡互不相溶, 用二甲苯作为媒介将脱水后组织中的乙醇置换出来, 称为透明。

微树芯透明最适的时间为乙醇:二甲苯=1:1、二甲苯I、二甲苯II各1 h。

浸蜡用石蜡取代透明剂, 二甲苯浸入组织在切片时起支持作用称为浸蜡。

先用二甲苯:石蜡=1:1的混合液进行浸蜡, 时间延长至48–72 h。

浸蜡时温度应该控制在37℃左右, 温度过高可能会使组织变脆而不易切片。

然后在高于石蜡熔点2℃下换成用纯石蜡浸蜡3次。

浸蜡完成后即可包埋。

（首先, 采用低熔点(52–54℃)与高熔点(60–62℃)比例为2:1, 并加入5%的蜂蜡进行熬制的石蜡, 除去所有的气体和杂质, 反复使用效果更好。

其次, 在浸蜡过程中必须注意温度的控制, 二甲苯和石蜡混合浸蜡时温度控制为37℃, 而在纯蜡中, 温度一般控制在高于石蜡熔点2℃的条件下。

）切片将包埋好的蜡块用刀片修成规整的正方体或长方体, 以少许热蜡液将其底部迅速贴附于小木块上, 夹在轮转式切片机的蜡块钳内, 使蜡块切面与切片刀刃平行, 旋紧。

调整切片厚度为8–12μm, 切出10–25 cm蜡带后, 用毛笔轻托轻放在光面纸或者玻璃板上。

石蜡切片以及染色体制作

波恩氏固定液：苦味酸饱和液（0.9-1.2% ）75ml 冰醋酸5ml 40% 甲醛（也就是100%畐尔马林）25ml一.石蜡切片的主要流程为：1）取材与固定：将两年龄的各种样本的性腺组织放入干净的EP管中，然后倒入波恩氏固定液，固定3〜4个小时；2 ）脱水：组织经固定后，去除固定液，然后逐级脱水，70%^80%^90%^纯酒精（I）-纯酒精（II），每级脱水处理40分钟左右；3）透明：脱水后，用二甲苯置换组织中的酒精，纯酒精（II） -1/2纯酒精+1/2二甲苯-二甲苯（I）-二甲苯（II），同样的每级处理40分钟左右。

4）浸蜡：将已透明的样本放入放置在60摄氏度左右的恒温箱的液体石蜡中，浸蜡4小时左右；5）包埋：用牛皮纸折叠成合适大小的小盒，然后将熔化的石蜡和样本材料倒入盒中，用在酒精灯上略热的镊子将样本材料安放整齐，直至冷却；6）切片：首先用单面刀片把石蜡块修整好，然后将其固着在台木上，最后固定在石蜡切片机上开始切片；7）贴片：将切片机切下的蜡带按载玻片大小分割成小段粘贴在载玻片上，为使粘贴牢固先在在玻片上滴一小滴蛋白甘油，涂抹均匀，然后再滴一滴干净的水在上面，将分割好的蜡带轻轻的放在上面，然后移到烫板上；8）染色：以粘贴牢固的切片脱蜡下降至水（每级处理2~5分钟）T苏木精中染色4分钟左右T水洗T氨水中蓝花” 1~分钟，蒸馏水漂洗一次T0.2%署红水溶液半分钟左右T70%的酒精过一下T95% 的酒精浸几下T纯酒精（I）2分钟T纯酒精（II）2分钟T 1/2纯酒精+ 1/2二甲苯2分钟T二甲苯2分钟；9）封片保藏：将染色好的切片封藏于中性树胶中。

透射电镜技术材料准备的主要流程为：1）用干净的镊子和剪刀剪取合适大小的性腺组织，用3%的戊二醛固定4~5小时；2）用磷酸缓冲液清洗几次后用锇酸固定；3）系列丙酮对其梯度脱水后用Epo n812包埋；4）超薄切片机60~70 nm厚度超薄切片，然后用醋酸双氧铀 -枸掾酸铅染色；5）利用日本H -600透射电子显微镜对其进行观察；6）参照刘筠等采用的鲤科鱼类的分期标准对其进行性腺分期。

石蜡切片流程

1.试剂的配制：（1）10%福尔马林液量取40%的甲醛溶液25ml,将其溶于75ml双蒸水中，混合均匀后室温保存。

（2）不同浓度的乙醇溶液 70%、80%、90%、100%乙醇，95%以下的各级乙醇用95%的乙醇加蒸馏水稀释而成。

例如,配制70%的乙醇，就量取70ml95%乙醇然后加蒸馏水至95ml即成。

（3）伊红溶液称取伊红10g，将其加入到1000ml的双蒸水中，用玻璃棒搅起泡沫后过滤，在过滤好的伊红溶液中加入10滴冰醋酸，室温保存备用。

（4）苏木精溶液 A液：称取苏木精1g,加入无水乙醇10ml，充分混匀后备用。

B液：称取20g硫酸铝钾，将其溶于200ml蒸馏水,混合均匀后备用。

将B液加热至完全溶解，稍冷后将A液混入到B液中加热，待稍冷却时加入0.5g氧化汞，再继续加热1min,染液变成紫色，注意在加氧化汞时应该少量逐渐加入，要防止染液溅出。

完全冷却后呈深紫色，将烧杯口用纱布盖好，隔夜后过滤。

在过滤后的液体内按每96ml中加4ml冰醋酸，放置1周后成熟，即可用于染色，保存期为1-2个月。

此染液在加醋酸后，对核染色具有选择性，所以很适合于脱落细胞的核染色，由于染液内已加有氧化剂，故不可长期储存。

（5）组织切片专用盐酸酒精在100ml的70%乙醇内加入0.5-1ml的浓盐酸，室温保存备用。

2.实验步骤（1）取材不同需求取材方式有所不同，本例以小鼠结肠为例，截取新鲜结肠1cm左右。

（2）固定将取好的结肠组织块放入10%的福尔马林液中，固定时间为24h。

在投入固定液30min后要将组织块取出进行修整。

即用锋利的手术刀片将不规则的组织块切去。

修整好的组织块再继续投入到固定液内固定。

(3)冲洗固定后的组织块用流水冲洗，以除去组织内残留的固定液。

将固定好的组织块分别用纱布包好，流水冲洗12h。

(4)脱水组织块经流水充分冲洗后，浸泡在70%的乙醇中1h，脱水流程如下：70%的乙醇浸泡1h→80%的乙醇浸泡1h→90%的乙醇浸泡1h→95%的乙醇（I）浸泡1h→95%的乙醇（II）1h→100%的乙醇（I）30min→100%的乙醇（II）30min。

石蜡切片制片流程(番红固绿滴染)

石蜡切片制片流程（番红固绿滴染）1.鲜样FAA（18：1：1）抽气固定24h以上。

2.易碎的材料可用甘油酒精软化剂（1：1）软化1周以上（乙二胺软化剂容易导致颜色变深）。

3.70%酒精浸泡1h。

4.80%酒精浸泡1h。

5.95%酒精浸泡1h。

6.吸水纸迅速吸干，100%酒精浸泡1h。

7.100%酒精浸泡1h。

8.含1/2酒精+二甲苯的溶液浸泡1h。

（若有浑浊，即脱水不完全，需要重新从95%酒精再脱水一次）。

9.纯二甲苯浸泡1h。

10.纯二甲苯浸泡1h。

11.加入约1/4二甲苯体积的碎蜡，放置约半小时，再加入1/4体积碎蜡（也可一步到位）。

12.视混合物熔点而定，40-50℃液体状态渗蜡1-2d。

13.视石蜡熔点而定，50-65℃（高于熔点3-5℃），含1/2二甲苯+石蜡的蜡锅浸蜡2h。

14.含1/3二甲苯+2/3石蜡的蜡锅浸蜡2h。

15.纯石蜡锅浸蜡2d以上。

16.包埋（若材料大、中间有空气可调高温度再抽气）（新蜡不易凝固，可在新蜡锅抽气再用老蜡包埋）。

17.空气中冷却（急剧冷却容易收缩不均而变形），削块成棱台形蜡块。

18.切片（8-20µm，若太薄易碎则调高厚度）。

19.40℃水中展片，用涂有粘片剂的载玻片捞片（展片时间不宜太短，易产生褶皱）（捞片的展片效果优于滴水展片，气泡少），40℃烘干。

20.40-50℃烤片2-3d（比石蜡熔点低5℃左右），让蜡带充分贴在玻片表面。

21.铅笔做好标记，二甲苯浸泡脱蜡20-30min。

22.二甲苯透明10-20min。

23.取出，滴加含1/2酒精+二甲苯的溶液，放置数秒，倾去。

（需要过渡酒精至与染色剂的酒精含量相同的浓度，染色）（以50%番红酒精溶液和95%固绿为例）。

24.滴加100%酒精，放置数秒，倾去。

25.滴加95%酒精，放置数秒，倾去。

26.滴加80%酒精，放置数秒，倾去。

27.滴加70%酒精，放置数秒，倾去。

28.滴加50%酒精，放置数秒，倾去。

总结石蜡切片的流程及注意事项

总结石蜡切片的流程及注意事项Preparing paraffin-embedded tissue sections is a common technique used in histology and pathology labs to study tissues under a microscope. The process begins with fixing the tissue in formalin to preserve its structure and prevent degradation. 石蜡封埋组织切片是组织学和病理学实验室常用的技术，用于在显微镜下研究组织。

这个过程始于用福尔马林固定组织，以保持其结构并防止降解。

After fixation, the tissue is dehydrated using a series of alcohol washes to remove water from the tissue. Dehydration is a critical step in the process as it allows the tissue to be impregnated with paraffin, which will later solidify and provide support for the tissue during sectioning. 固定后，组织通过一系列醇洗涤脱水，从而去除组织中的水分。

脱水是这个过程中至关重要的一步，因为它使组织可以浸透石蜡，后者会在固化后提供支撑，以便进行切片。

Next, the dehydrated tissue is cleared by immersing it in a clearing agent, usually xylene or some other clearing agent, to remove any remaining alcohol and make the tissue transparent. This step is essential for ensuring the tissue is completely impregnated withparaffin and allows for better visualization of cellular structures during microscopy. 接下来，脱水后的组织通过浸泡在透明质剂中进行透明化，通常使用二甲苯或其他透明质剂，以去除任何残留的酒精并使组织变得透明。

组织石蜡切片流程

组织石蜡切片流程
1．取材及固定：
用10%甲醛液固定小块组织数小时即可，时间稍长也无关系。

（福尔马林10 ml，95%酒
精90 ml。

用酒精福尔马林液这一混合液固定组织1—2小时，取出后可直接投入95%酒精，不需水洗及不经各级低度酒精，可以缩短了脱水时间。

）
2．脱水：
50%，70%，80%，90%，95%①，95%②，100%①，100%②酒精各1小时3．透明：（用二甲苯除去酒精，便于包埋）
1/2 100%酒精+1/2二甲苯(30分钟) →二甲苯Ⅰ(15分钟) →二甲苯Ⅱ(15分钟) 4．浸蜡，包埋：
纯蜡Ⅰ(20分钟至1小时) →纯蜡Ⅱ(20分钟至1小时) →包埋
5．切片：
用AO手摇切片机切片，厚度为3-5微米。

6．脱蜡：
二甲苯Ⅰ(10分钟) →二甲苯Ⅱ(10分钟) →1/2100%酒精+1/2二甲苯(5分钟) →100%酒精Ⅰ(2-3分钟) → 100%酒精Ⅱ(2-3分钟) → 95%酒精Ⅰ(1-2分钟) → 95%酒精Ⅱ(1-2分钟) → 90%酒精(1-2分钟) → 80%酒精(1-2分钟) → 70%酒精(1-2分钟) →蒸馏水(1-2分钟)
7．染色：
苏木精(10-15分钟) →自来水冲洗3分钟以上→ 盐酸酒精(8秒) →自来水冲冼(20分钟) →蒸馏水(2分钟) → 70%酒精(1-2分钟) → 80%酒精(1-2分钟) → 90%酒精(1-2分钟) → 0.5%伊红酒精溶液(3-5分钟) → 95%酒精Ⅰ(30秒) → 95%酒精Ⅱ(1-2分钟) → 100%酒精Ⅰ(2分钟) → 100%酒精Ⅱ(2分钟)→二甲苯Ⅰ(2分钟) →二甲苯Ⅱ(2分钟)
8．封片：。

生物显微技术复习题

生物显微技术复习题复习题（一）1.简述制作石蜡切片制作的基本步骤。

答：（1）取材（2）固定（3）洗涤（4）脱水（5）透明（6）透蜡与包埋（7）切片（8）贴片(展片、捞片)（9）染色（10）封片2.固定的意义和目的有哪些？答：（1）意义：在制作切片的过程中，取材后应将组织材料立即固定，才能进行制片，固定是制片极为重要的一步。

（2）目的：○1使各成分凝固和沉淀下来；○2防止自容和腐败；○3使不同成分产生不同的折光率，便于显微镜观察；○4硬化组织,便于切片；○5媒染—使细胞易于着色。

3.（1）最常用的单纯固定液是哪种？答：甲醛和乙醇。

（2）解析Bouin氏液、Zebker氏液的成分？答：○1Bouin氏液：饱和苦味酸水溶液75ml、甲醛水溶液25ml、冰醋酸5ml；○2Zebker氏液：升汞5g、重铬酸钾2.5g、蒸馏水100ml、冰醋酸5ml。

（3）Bouin氏液固定后，为了加速清除固定后组织块上的黄色，可在洗涤液中加入少量氨水或＿＿。

4.最常用的脱水剂是酒精，最常用的透明剂是二甲苯。

5.包埋前透明和染色后透明的目的各是什么？答：(1)包埋前透明:将脱水剂替换出来，使石蜡能顺利进入材料中。

（2）染色后透明:脱去组织中的水，防止封片时出现雾状膜。

6.软蜡和硬蜡的熔点范围各是多少？一般包埋时使用的石蜡的熔点是多少？答:（1）软蜡：42~45℃、45~50℃；硬蜡：52~54℃、54~60℃（2）动物材料常用的石蜡熔点为52-56ºC；植物材料为54-60ºC。

复习题（二）1.一般制作石蜡切片时切片厚度是多少？答：4~10微米。

2.为什么切片要进行染色?答：使组织或细胞的某一部分染上与其他部分不同深度的颜色或不同的颜色，产生不同的折光率，便于利用光学显微镜进行观察。

3.封固的目的是什么？常用的封固剂有哪些？主要适用于哪些情况？答：（1）封固的目的：便于保存和观察；（2）常用的封固剂：○1含水封固剂：如甘油，甘油明胶和Apath糖浆等，用于未染色的材料、脂肪染色、异染染色等。

石蜡切片的基本操作流程

石蜡切片的基本操作流程一、取材选取目的组织块，修剪到合适的大小；二、固定将组织块放入福尔马林固定液（10%甲醛溶液），固定时间由组织块大小而定，一般不少于24h；体积1cm3的组织块，一般为3-7天；三、冲水自来水洗几下，泡1小时；四、系列酒精脱水50%酒精，1h；70%酒精，1h；80%酒精，1h；90%酒精，1h；100%酒精（I），1h；100%酒精（II），1h；五、透明酒精：二甲苯=1：1溶液，过夜；二甲苯，1h；六、包埋二甲苯：石蜡=1：1，65-70 ℃，2h；新鲜石蜡（I），65-70 ℃，1h；新鲜石蜡（II），65-70 ℃，4h；新鲜石蜡包埋；七、切片切片厚度为5-7um；八、展片温水（40-42 ℃）展片；九、捞片将展好的片子贴于载玻片上；十、烘片42 ℃将片子上的水烘干；十一、烤片60 ℃烤片12-24h；十二、脱腊二甲苯（I）：2min；酒精：二甲苯=1：1溶液：2min；十三、水化100%酒精（I）：1min；100%酒精（II）：1min；95%酒精：1.5min；80%酒精：1.5min；70%酒精：1.5min；50%酒精：1.5min；自来水洗：2min十四、H&E染色Hematoxylin染色3-5min(2.5min时取出观察染色效果)，自来水洗3次，盐酸分化（2/3杯玻璃缸+3滴1N盐酸），10s；自来水洗蓝化，镜下观察染色效果；（伊红）Eosin染色30-50s，直接脱水（90%酒精-----100%酒精I，100%酒精II各1分------酒精：二甲苯=1：1溶液：1-1.5min）；十五、脱水90%酒精-100%酒精-100%酒精，各1min；十六、透明二甲苯：酒精：1-1.5min；二甲苯：2min；十七、封片中性树胶封片；十八、镜下观察并拍照。

石蜡切片制备方法和操作技术过程

醋酸-乙醇)、纳瓦兴(Navaschjn’s)固定液。

材料固定完毕，保存于加盖的容器内，贴上标签。
(三)抽气

植物材料内部由于含有空气，导致固定液不能完全渗入。
材料投入固定液后需要立即抽气，以便让固定液有效透入材料组织中，排除材料内气泡的干扰。

一般抽气时间为20-30min。抽过气的材料在停止抽气后，应沉入底部。
保持组织原有形态熟悉要取材的部位选择好组织的切面
• (二)固定

将已切好的材料尽快地浸入相当于材料10-15倍体积的固定液中，使细胞的新陈代谢瞬时停止，并保持细胞或组织的形态构造及其内含物的状态不发生变化，使组织变硬，便于切片、着
色，同时具有防腐作用。

常用固定液：乙醇、甲醛、醋酸、液中的成分有可能会妨碍染色或发生沉淀、结晶，影
响观察；有的还会继续作用，使材料变质等，因此需要洗
去渗入细胞内部的固定液。

根据固定液的种类，需要用到不同的洗涤液，
常用的洗涤液有：水、70%乙醇或缓冲液
• (五)脱水

材料洗涤后残留的洗涤液，可能使材料分解变形，因此需用
脱水剂除去材料中的洗涤液，使组织逐渐变硬，以便让石蜡浸

在研究细胞、组织、胚胎以及微生物形态等方面石蜡切片法是最理想的制片方法。
发展：
石蜡切片技术应用已有300多年历史：

1665年，英国人胡克用来制作薄片的小刀可以称得上最早的 “切片机”；一个世纪以后，英国植物学家John Hill设计了世界上第一台真正意义上的切片机； 1883年，剑桥大学车间制造了一台轮转式切片机； 1894年Rudolf Jung开发了第一台能重复切片的滑动式切片机；

石蜡切片机操作流程

石蜡切片机操作流程
操作规程
1、将蜡块固定于切片机头上的夹座内，调整到稍离开切片能够切到的位置上，注意蜡块组织切面与切片刀口要垂直平行。

2、再调整蜡块组织切面恰好与刀口接触，旋紧刀架，固定好机头。

3、根据需要调整切片厚度。

4、摇动切片机手轮先进行修整切片，直到切出完整的最大组织切面后，再进行切制。

5、用右手转动切片机手轮，左手用毛笔托起蜡片，协调地进行切片操作。

6、切下的蜡带，一端用镊子轻轻拉起，应尽可能将切片带拉直展开，用毛笔将蜡带从刀口向上挑起，拉下蜡带，然后轻拖铺于托盘内。

7、切片完成后，应及时清理切片机，保持切片机及切片刀干净整洁。

* 切片机使用注意事项：
1、切片机的各个零件和螺丝应旋紧，否则将会产生震动。

在每次更换蜡块时，应检查一下组织块是否夹紧，切片刀是否稳固。

2、切片刀一定要磨得十分锋利。

切片完成后应及时擦净刀口（二甲苯可以清除蜡渍）。

3、在摇动切片机时，用力要求均匀一致，不宜过重过猛，否则可因用力过重而使机身震动，造成切片厚薄不均。

石蜡切片的流程及注意事项

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1. 组织固定，使用福尔马林或派氏液将组织固定，确保组织结构和成分得到保存。