高效液相色谱基础

高效液相色谱基础
1、 基础理论 1、 液相色谱系统组成
溶剂瓶——真空脱气——混合器——泵—— 进样器——色谱柱——检测器——数据采集 2、 分离过程 分离过程是待测化合物在固定相和流动相中的连续分配平衡的过程。待 测样品经流动相通过柱，不同组分的分配系数不等，则被流动相携带移 动的速度不等，分配系数大的组分在色谱柱中停留的时间长，反之则 短，从而使不同组分得到分离。 3、 液相色谱种类 反相色谱(RPC)：是药物分析中最常用的方法。 正相色谱(NPC)：在建立HPLC方法时，应首先试用RPC，如RPC不适合 则改用NPC。 理由：样品不为RPC保留。 样品为RPC强烈保留。 RPC不能达到适当的分离度。 样品含位置异构体、立体异构体或非对映异构体，NPC有较大 的选择性。 样品溶于非极性溶剂，不溶于极性溶剂-水混合物。 样品在水溶液中会分解。 离子对色谱 分子排阻色谱（SEC）：又称凝胶色谱、尺寸排阻色谱。利用被分离物 质由于分子大小不同导致在填料上渗透程度的不同使不同分子量的组分 得到分离。填料为带有一定孔径的惰性填料：分子筛、葡聚糖凝胶、微 孔聚合物、微孔硅胶或玻璃珠等。是分离蛋白质、多肽、核酸的重要方 法。 离子交换色谱：固定相上结合了带电官能团，能滞留带相反电荷的离 子。主要用于无机盐、生物来源样品（氨基酸、肽、蛋白质、寡核苷酸 及核酸）和某些有机金属化合物。 手性色谱法： 间接法：手性衍生化，采用对映体纯的手性衍生化试剂与手性样品 分子反应生成非对映异构体，用常规HPLC分离。 直接法：手性流动相添加剂。较少应用。 手性固定相：已成为主要方法。将手性物质化学键合或涂布在担
Ｒ＝ (tR2-tR1)/ (W1+W2)/2 2、 流动相 溶剂：水最好用超纯水，或者用双蒸水。缓冲盐也要用高纯度的，缓冲 液要用溶剂过滤器过滤。有机相：一定要用HPLC级的。水最好用新鲜 的，放置过夜后要过滤。流动相最好新鲜配制。 溶剂瓶：仪器配备的专用溶剂瓶，可用普通试剂瓶。应定期用酸、水和 溶剂清洗。普通试剂瓶用了一段时间后应扔掉，更换新的。 过滤器：流动相先经过滤器过滤后再进入色谱系统，过滤器使用一段时
半峰宽（Ｗ或Ｙh/2） 峰宽(W或Ｙ) 理论塔板数（n）与理论塔板高度（Ｈ） 相平衡参数 分配系数（Ｋ）K=Cs/Cm 容量因子（k）：达到分配平衡后组分在固定相中的量（Ｗs）与在流动 相中的量（Ｗm）的比。 选择性因子(α)：相邻两组分的分配系数之比或容量因子之比。 分离参数 分离度（Ｒ）:相邻两峰间的距离与平均峰宽的比值。Ｒ≥１.5称为完全 分离。
间后也要清洗。安捷伦HPLC使用的玻璃过滤器可用酸泡过后再用超纯 水清洗干净。 流动相的脱气：
溶于流动相的空气会在泵内产生气泡，导致流量不稳，如有大量气 泡，泵就不能正常工作，有时还会停止工作。安捷伦1100解决办法：打 开Purge阀，用充分脱气的流动相以5ml/min速度冲洗管道。另外，流动 相内溶有空气还会增加检测器的噪音，色谱图上出现毛刺。 脱气方法：氦脱气、真空脱气、超声脱气、加热。加热回流是最有 效的脱气方法，氦脱气法次之，超声脱气法效果最差，只能除去30%的 溶解气体。实际工作中可联合使用两种方法，我们使用抽真空和超声相 结合，可大大提高脱气效率。
体上形成手性固定相。手性固定相与被分析的对映体相互作用形成非对 映异构配合物。其结合强度不同，故保留不同，得以分离。
4、 基本概念和几个重要参数 色谱图：样品被流动相冲洗，通过色谱柱，流经检测器，所得到的信 号-洗脱时间曲线。 基线：监测器中只有流动相通过或有组分通过而不能为检测器所检出 时，所得流出曲线。 噪音 漂移 色谱峰 定性参数： 保留时间（tR） 保留体积（VR） 柱效参数： 区域宽度：标准偏差（σ）
6、 检测器 最常用的是紫外线检测器。一般采用可变波长（VWD）或二极管 阵列检测器（DAD）。光源通常为氘灯，工作波长190-350nm。 光源发射的混合光经聚焦，通过入口狭缝，由凹面镜反射后，经光 删分光，选定一定波长的单色光，经流通池，在光二极管（或光电管）
上，测量其经流通池中流出液吸收后的透光强度I；上述单色光也导入 参比光二极管，测定其入射光强度I0。测量电子线路将两个光二极管的 信号转换成吸收度A并输入数据系统。
3、 泵 种类：螺旋柱塞泵、柱塞往复泵和隔膜往复泵。多用柱塞往复泵。 主要由柱塞杆、密封垫圈和两个单向阀组成。密封垫圈包裹柱塞杆，是 液相色谱系统中最易磨损的部件，需定期更换。单向阀：阀体是不锈钢 的，内有宝石球，防止液体反向流动。 工作原理：通常由电机带动凸轮转动，驱动柱塞杆在液缸内往复运动。
吸液：柱塞杆由泵腔内向外运动，进口单向阀打开，出口单向阀关 闭，流动相自入口单向阀进入泵腔。
A＝log I0/I 由Beer定律，吸收度A与流通池中溶质浓度C相关 A＝εCL ε为溶质克分子吸收系数，L为流通池光径长度 DAD和可变波长检测器不同，光删置于流通池后，用阵列二级管同 时测定各种波长的光强度。DAD可在一次进样后，同时采集不同波长下 的色谱图，随后可以显示任一波长下的色谱图；可提供每一色谱峰的紫 外光谱，有利于选择最佳波长，用于最终建立的HPLC方法；还能检查 色谱峰各个的位置的光谱，评价色谱峰纯度，如果色谱峰为单一成分， 其各点的光谱应重叠。但，如主成分与杂质有相同的吸收光谱，则应与 其他分析技术相结合才能判断。 荧光检测器。基于待测成分在激发下产生的荧光。具有很高的选择 性和很高的灵敏度。测定浓度可达到ng/ml范围。
净，不能有颗粒或混浊。经常清洗进样阀。 定量环一般有20μl和50μl的，进样体积至少要大于定量环体积的
三倍，才能完全更换定量环中的溶液，这样可保证极高的精密度。不必 细读注射器上的刻度，只要保证样品量足够就行。
自动进样装置可处理的样品数不等，可带温度控制系统，适用于不 稳定需低温保存的样品。能自动用溶剂清洗进样器，还可调节清洗次 数。
7、 数据采集 记录仪 积分仪 现在计算机用于HPLC中仪器控制及采集和分析数据。
5、 柱 色谱柱由不绣钢柱管和固定相组成，色谱柱两端的柱接头内装有烧 结过滤片，其孔隙小于填料粒度，防止填料漏出。按用途分为分析型和 制备型。分析柱又分为常规分析柱、窄径柱和毛细管柱。 色谱柱的性能与固定相性能和填充技术有关。不同来源的商品柱可 能有很大差异，即使同一来源的柱也有差别。使用前及使用一段时间后 要对其性能进行考察，包括柱压、柱效等。 HPLC中多数柱填料以硅胶为基质，在其表面键合有机表面层，如 C8、C18等。硅胶的缺点是在高pH 下会溶解，另外，表面呈酸性，在 分离碱性化合物时拖尾。未修饰硅胶表面的硅醇基与正十八硅烷反应， 形成C18键合相柱。随温度的增加、pH值的降低和流动相中含水量的提 高，键合在硅胶上的Si-O-Si键的水解增加，导致硅烷键合相的流失。 色谱柱使用注意事项： 过滤流动相，净化样品。 使用流路过滤器和保护柱。 避免压力和温度的急剧变化及任何机械震动。 柱温不宜过高，高温下不宜长时间使用。 流动相的pH值不能过高或过低，一般在2到8之间。缓冲盐的浓度应 尽量低，通常为0.01~0.05M。 使用完毕后要冲洗系统，禁止将缓冲液留在柱内静置过夜或更长时 间。 经常用强溶剂冲洗柱子。 柱子不用时保存在适当的溶剂中，两端密封保存。
排液：柱塞杆被推入泵腔，出口单向阀打开，进口单向阀关闭，流 动相由泵腔流向色谱柱。
低压混合 高压混合 4、 进样器 六通进样阀和自动进样器 六通进样阀： 当阀处于装样（Load）位置时，定量环与进样孔和放空孔相连，用 微量注射器将样品注入定量环，多余样品从放空孔排出。此时，流动相 从泵直接入柱。 将六通阀转子转动60ºC处于进样（Inject）位置，此时定量环与泵 和色谱柱相连，定量环内的样品由流动相带入色谱柱。 扳动阀时，动作不能太慢，更不能停留在中间位置，这时流动相受 阻，泵内压力剧增。当再转动阀到位时，过高的压力冲击在柱头磨损后，转子与定子不密封，会有 流动相漏出，进样体积不准，此时需要更换转子。日常要注意样品要干