拟南芥WRI1基因的克隆及其植物反义载体的构建

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拟南芥AtERF1蛋白的原核可溶性表达及多克隆抗体的制备

拟南芥AtERF1蛋白的原核可溶性表达及多克隆抗体的制备张钰;李亚会;屠唯一;陈晨;高菊芳【摘要】转录因子AtERF1属于ERF/AP2家族的B3亚家族,参与植物的防卫反应.根据密码子简并原理,用基因全合成的方法合成了满足大肠杆菌密码子嗜好的编码拟南芥AtERF1蛋白的碱基序列,并将其克隆到原核表达载体pET-29b.将表达载体AtERFl-pET-29b转入大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG成功诱导表达了分子量约30kD的AtERF1蛋白,该蛋白主要以可溶性蛋白的形式存在.以该蛋白为抗原免疫家兔,制备出的多克隆抗体经免疫双扩散测定效价达1:16,Westem blot检测表明该抗血清与AtERF1蛋白识别良好.AtERF1抗体的制备为进一步从生化水平上研究AtERF1的功能奠定了良好基础.【期刊名称】《上海师范大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2013(042)004【总页数】6页(P378-383)【关键词】原核表达;拟南芥;AtERF1蛋白;密码子优化;多克隆抗体【作者】张钰;李亚会;屠唯一;陈晨;高菊芳【作者单位】上海师范大学生命与环境科学学院,上海200234;上海师范大学生命与环境科学学院,上海200234;上海师范大学生命与环境科学学院,上海200234;上海师范大学生命与环境科学学院,上海200234;上海师范大学生命与环境科学学院,上海200234【正文语种】中文【中图分类】Q7860 引言ERF(ethylene responsive factor)是植物所特有的一类转录因子．ERF家族成员在结构上有共同的特点:每个成员都含有一个大约由60个氨基酸组成的非常保守的DNA结合域，含有ERF结合域的转录因子在植物中广泛存在，并且参与植物的生长发育及生理生化反应的信号转导［1］．植物防卫信号传递途径方面的研究表明:针对不同的病原物的诱导防卫反应相应地受到不同的信号传递途径的调控．水杨酸(salicylic acid，SA)、乙烯(ethylene，ET)和茉莉酸(jasmonic acid，JA)在防卫信号传递途径中起着重要的作用［2］．大量证据表明:依赖于SA、ET或JA的信号传递途径之间存在着一定的交叉作用(cross—talk)．绝大部分情况下，依赖于ET 的信号传递途径与依赖于JA的信号传递途径间存在着协同促进的作用．外源ET 和JA都能够迅速诱导AtERF1表达，两者之间存在协同促进作用［3］．而且，AtERF1的超表达能够恢复ein2和ein l突变体的防卫反应能力．通过AtERF1转基因拟南芥的转录组分析和野生型拟南芥在ET和JA处理下的转录组分析，说明AtERF1在体内能够调控那些应答ET和JA的基因的表达．总的试验结果表明:AtERF1是ET和JA信号途径中的下游成分，而且在2个防卫反应基因调控信号途径交织点处起着重要的作用．AtERF1基因的超表达，增强了拟南芥对灰霉(Botrytis cinerea)、核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)、Erysiphe orontii的抗性［4］．但是AtERF1蛋白究竟调控哪些目的基因行使功能，目前尚不十分清楚．原核表达系统的优点在于能够在较短时间内获得基因表达产物，而且所需的成本相对比较低廉．在本研究中，利用密码子优化法人工合成了满足大肠杆菌密码子嗜好的编码AtERF1蛋白的DNA序列［5］，并以此为基础构建了原核表达载体AtERF1-pET29b，将其转入大肠杆菌BL21(DE 3)，经IPTG诱导后在原核细胞中成功表达了AtERF1蛋白，该蛋白以可溶蛋白的形式存在．利用SDS-PAGE法纯化了AtERF1蛋白，并作为抗原免疫家兔，制备出了效价高，特异性强的多克隆抗体，这些工作为进一步用生化手段研究该转录因子的DNA结合位点和下游基因奠定了基础．1 材料与方法1．1 试剂和材料1．1．1 质粒与菌株原核表达载体pET-29b(Novagen产品)由陶黎明教授赠送，大肠杆菌感受态菌株DH5α及BL21(DE3)由上海师范大学植物功能基因实验室提供．1．1．2 生物学试剂T4 DNA连接酶、限制性内切酶Nde I、Xho I和Dream Tag DNA聚合酶购自Fermenant公司;硝酸纤维素膜、dNTPs、PCR产物回收试剂盒、Tris、SDS、TEMED及IPTG等常用分子生物学试剂购自北京鼎国生物技术有限公司;辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔IgG、ECL化学发光检测试剂盒、PVDF膜购自艾比玛特生物医药(上海)有限公司;引物由Invitrogen公司合成．1．2 方法1．2．1 原核表达载体AtERF1-pET-29b的构建AtERF1蛋白由268个氨基酸残基组成，根据其氨基酸序列，利用密码子优化软件设计出一条满足大肠杆菌密码子嗜好的碱基序列，并引入Nde I和Xho I两个限制性酶切位点．经优化处理的编码AtERF1基因序列由Invitrogen公司全基因合成后克隆至pMD-18T载体上，上述重组质粒AtERF1-pMD-18T用NdeI，Xho I 于37℃ 消化5 h，经琼脂糖凝胶电泳，回收的AtERF1片段与同样用NdeI，Xho I酶切的pET-29b载体进行连接，转化入感受态E．coli DH5α中，涂布于含卡那霉素(50mg/L)的LB固体培养基上．挑取单菌落培养后抽提质粒，进行PCR和双酶切鉴定．酶切正确的质粒转化BL21表达菌感受态，涂布于含卡那霉素(50mg/L)的LB固体培养基上．挑取单菌落培养后进行PCR鉴定，含目的基因片段的BL21表达菌-70℃保存备用．鉴定引物为:1．2．2 目的蛋白的诱导表达及可溶性分析将含目的基因片段的BL21表达菌复苏培养，至OD600为0．5～1．0，取1 mL 菌液放入离心管中(未经IPTG诱导)．将含剩余菌液的试管转移至20℃ 振荡培养，当培养液温度降至20℃时，加入IPTG，至终浓度为0．5 mmol/L进行蛋白诱导，在1、2、3、4、5 h分别收集1 mL菌液．未诱导和诱导不同时间的菌液4℃高速离心1 min，收集细菌沉淀．每管细菌沉淀加入100μL超声缓冲液(20 mmol/L Tris，pH 8．0，0．5 mmol/L NaCl)重悬，超声1～2 min破碎细胞．吸取50μL全细胞匀浆于新的离心管，与50μL 2×SDS上样液混合后置于100℃煮沸5min，吸取10μL样品用12% 聚丙烯酰胺凝胶电泳检测目的蛋白的表达情况;剩余的匀浆15000 r/min离心10 min，上清与沉淀分别与等量SDS上样液混合后置于100℃煮沸5 min，吸取10μL电泳检测目的蛋白的溶解状况．PAGE胶用考马斯亮兰染色液染20 min后，再用脱色液脱色干净．1．2．3 多克隆抗体制备及效价鉴定抗原准备:将IPTG诱导过夜的细菌裂解液上清进行SDS-PAGE电泳，转移至硝酸纤维素(NC)膜上．每只兔约需200μg抗原，依据标准分子量参照估计AtERF1蛋白条带的含量，转移足够数量的NC膜．将蛋白转移完毕的NC膜浸在丽春红溶液中1～2 min，显示出AtERF1蛋白条带，立即用双蒸水洗去丽春红，至清晰显示出AtERF1蛋白条带．小心剪下AtERF1蛋白条带处NC膜，尽量避免非目的蛋白的污染．将剪下的NC膜放置在加有灭菌PBS的1．5 mL离心管中，用灭菌PBS 洗去丽春红，至无色．用眼科剪将NC膜剪成非常细小的碎片，加入0．5 mL灭菌PBS，用组织匀浆器研磨，-70℃冻存备用．免疫方案:取1 mL碾碎的包含抗原的NC膜对成年健康家兔进行背部多点皮下注射，10 d后用相同的碾碎的样品注射家兔．相同的实验再重复两次，每次间隔10 d．最后一次注射一周后，耳缘静脉取血测定抗体效价．效价满意后在麻醉状态下对被免疫的兔子进行颈动脉取血，血液放37℃ 温育1 h，然后放4℃ 过夜，析出的血清加叠氮钠，分装后-20℃保存．效价测定:用免疫双扩散法测定抗体效价．用生理盐水配制1%琼脂，倒平皿凝固后打梅花型孔，在中央孔中加入100μL IPTG诱导过夜的细菌裂解液上清作为抗原，周围5孔分别加入100μL 1∶2、1∶4、1∶8、1∶16和1∶32稀释的兔抗血清．置湿盒37℃过夜，观察沉淀线出现的情况．1．2．4 Western blot检测抗体的特异性将表达的AtERF1蛋白进行SDS-PAGE电泳后，经电转仪转移到PVDF膜上．将膜用含5%脱脂奶粉的TBST溶液封闭1．5 h，清洗后加入按1∶200稀释于TBST中的兔多克隆抗体，在摇床放置1 h，以TBST清洗一抗1 h，每15 min换一次清洗液．再加稀释于TBST中的HRP标记的羊抗兔IgG(1∶10000)，在摇床放置1 h，TBST清洗二抗1 h，每15min换一次清洗液．洗膜后加ECL工作液，在可见光下室温孵育膜数分钟，将印迹膜用保鲜膜包被粘贴固定于X光片曝光暗盒．然后转入暗室将X光胶片压在膜上曝光数秒，显影定影于X光胶片上．2 结果与分析2．1 AtERF1蛋白原核表达载体的构建www．arabidopsis．org 网站上列出的AtERF1的蛋白的氨基酸序列，共含268个氨基酸残基．根据此序列设计出满足大肠杆菌密码子嗜好的碱基序列，并引入Nde I和Xho I两个限制性酶切位点，碱基序列长度共816bp(图1)．图1 AtERF1蛋白编码序列的优化经密码子优化的序列由Invitrogen公司全基因合成后克隆至 pMD-18T载体上，将AtERF1-T载体经限制性内切酶Nde I和Xho I消化后，电泳结果表明AtERF1基因序列已成功克隆入pMD18-T(图2-A)．利用T载体上的M13通用引物进行测序分析，结果表明该816bp的片段序列与优化的序列吻合．为了获得大量的AtERF1蛋白，采用了原核表达的载体pET-29 b进行蛋白表达实验．用限制性内切酶Nde I和Xho I将AtERF1-T载体中的 AtERF1片段切下后，将其克隆入pET-29 b，转化E．coli DH 5α感受态后的重组质粒，用限制性酶切鉴定可以看到一条大约816 bp的条带(图2-B)，测序结果表明目的基因AtERF1位于正确的读码框中，获得了原核表达质粒 AtERF1-pET29 b．将构建好的AtERF1-pET29 b 质粒和空载体pET29 b质粒转化入表达菌株E．coli BL21(DE3)感受态中，PCR鉴定显示AtERF1-pET29 b含有目的基因片段(图2-C1)，而含空载体的菌落中不含目的基因片段(图2-C2)．图2 AtERF1蛋白表达载体的构建M:λ-DNA/Eco1301(Styl);A1:AtERF1-T质粒酶切产物;B1:AtERF1-pET29b质粒酶切产物;C:含原核表达载体BL21菌落PCR鉴定;C1:AtERF1基因PCR产物;C2:空质粒pET29b作负对照2．2 AtERF1蛋白的原核表达AtERF1蛋白的分子量约30 kD，按照材料与方法中所述步骤进行蛋白诱导表达实验，SDS-PAGE电泳结果显示，诱导4 h及5 h后，其全细胞裂解液中在35 kD～25 kD处可见清晰的AtERF1蛋白的条带(图3，箭头所指 )．图3 AtERF1蛋白的诱导表达M:Prestained Protein Ladder;1:AtERF1-pET29b，不加 IPTG;2～6:AtERF1-pET29b加IPTG 诱导1h(2)、2h(3)、3h(4)、4h(5)和5h(6)，表达蛋白大小约30kD2．3 AtERF1蛋白的可溶性分析将诱导过夜的全细胞裂解液离心后的上清液进行SDS-PAGE电泳，发现在35kD～25 kD处可见清晰的AtERF1蛋白的条带(图4条带1)，说明表达的AtERF1蛋白以可溶的形式存在．图4 AtERF1蛋白的可溶性分析M:Prestained Protein Ladder;1:AtERF1-pET29b加IPTG诱导过夜，上清;2:AtERF1-pET29b加IPTG诱导过夜，沉淀;3:AtERF1-pET29b，不加IPTG，上清;4:AtERF1-pET29b，不加IPTG，沉淀2．4 AtERF1蛋白抗体制备和分析将IPTG诱导过夜的细菌裂解液上清进行SDS-PAGE电泳，转移至硝酸纤维素(NC)膜上．每只兔约需200μg抗原，依据标准分子量参照估计AtERF1蛋白条带的含量，转移足够数量的NC膜．用眼科剪将NC膜剪成非常细小的碎片，加入0．5 mL灭菌PBS，用组织匀浆器研磨，-70℃冻存备用．每次取1 mL碾碎的包含抗原的NC膜对成年健康家兔进行背部多点皮下注射，共四次．最后一次注射一周后，耳缘静脉取血用免疫双扩散法测定抗体效价．抗血清经1∶2、1∶4、1∶8、1∶16稀释后均能与AtERF1蛋白形成明显的沉淀线(图5)，表明抗体效价达到要求．对家兔在麻醉状态下颈动脉放血，血液经37℃温育后，4℃放置过夜析出多克隆抗血清．为了进一步分析获得的抗体对AtERF1蛋白的识别，用Western blot技术检测抗体，杂交后经HRP标记的羊抗兔抗体显色试剂盒显色，用X光胶片显影，在胶片上可在约30 kD处看到清晰的AtERF1蛋白条带，这表明多克隆抗体与AtERF1蛋白识别良好(图6)．图5 多克隆抗体效价测定图6 AtERF1表达蛋白的Western blot检测M:Prestained ProteinLadder;1:AtERF1-pET29b，不加 IPTG，沉淀;2:AtERF1-pET29b，不加IPTG，上清;3:AtERF1-pET29b加IPTG诱导过夜，沉淀;4:AtERF1-pET29b加IPTG诱导过夜，上清3 讨论遗传密码有64种，但是绝大多数生物倾向于利用这些密码子中的一部分．那些被最频繁利用的称为最佳密码子，那些不被经常利用的称为稀有或利用率低的密码子．因此重组蛋白的表达可能受密码子利用的影响，尤其是在异源表达系统［6］．本研究利用基因全合成的方法，将拟南芥AtERF1基因序列优化为满足大肠杆菌密码子嗜好的序列，并逐步构建到原核表达载体pET29b．诱导表达结果显示，构建的原核表达载体AtERF1-pET29b经IPTG诱导后，AtERF1蛋白以可溶的形式得到了高效稳定的表达．对获得的多克隆抗血清经Western blot技术检测，结果显示制备的抗体与目的蛋白识别良好．ERF转录因子分别与细胞发育、激素、抗病、低温及干旱、高盐等信号传递有关［7］．AtERF1基因的超表达，增强了拟南芥对灰霉(Botrytis cinerea)、核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)、Erysiphe orontii的抗性［4］，然而对于ERF转录因子AtERF1作用位点及下游基因的研究并不清楚．染色质免疫共沉淀(Chromatin Immunoprecipitation，Ch Ip)的方法可以用来在体内鉴定转录因子直接调控的下游基因，但是这些方法都需要特异性很高的蛋白抗体［8］．本研究制备的抗体与目的蛋白AtERF1特异性较强，可用于AtERF1作用位点及其直接调控的下游基因功能的研究，有助于生化水平上深入研究AtERF1在花药发育中的分子机理．参考文献:［1］RIECHMANN JL，HEARD J，MARTIN G，et al．Arabidopsis transcription factor:genome wide comparative analysis among eukaryotes ［J］．Science，2000，290:2105-2110．［2］刘强，张贵友，陈受宜．植物转录因子的结构与调控作用［J］．科学通报，2000，45(14):1465-14741．［3］LORENZO O，PIQUERASR，SÁNCHEZ-SERRANO J J，et al．ETHYIENE RESPONSE FACTOR1 integrates signals from ethylene and jasmonate pathways in plant defense［J］．Plant Cell，2003，15(1):165-178．［4］BERROCAL-LOBO M，MOLINA A．Ethylene response factor 1 mediates Arabidopsis resistance to the soilborne fungus Fusarium oxysporum［J］．Mol Plant Microbe Interact，2004，17:763-770．［5］FUGLSANG A．Codon optimizer:a freeware tool for codon optimization［J］．Protein Expr Purif，2003，31:247-249．［6］SORENSEN H P，MORTENSEN K K．Soluble expression of recombinant proteins in the cytoplasm of Escherichia coli［J］．Microb Cell Fact，2005，4:1．［7］黄泽军，黄荣峰，黄大昉．ERF转录因子及其在植物防卫反应中的作用［J］．植物病理学报，2004，34(3):193-198．［8］DASP M，RAMACHANDRAN K，VANWERT J，et al．Chromatin immunoprecipitation assay［J］．Biotechniques，2004，37(6):961-969．。

拟南芥ERA―1蛋白的原核表达及多克隆抗体制备-最新年精选文档

拟南芥ERA―1蛋白的原核表达及多克隆抗体制备ERA（Eecherichia coli ras-like protein，简称ERA）基因最早在大肠杆菌中发现，因其蛋白序列与真核生物的大鼠肉瘤（Ras）蛋白相似度高，所以命名为ERA[1]。

但随后的研究表明，ERA与Ras蛋白序列相似性主要集中于N端的GTP酶结构域，而其C端与包括Ras在内的其他小GTP酶不具有同源性，因而把它列为一类新的小GTP酶。

对大肠杆菌ERA功能的研究表明，该基因是大肠杆菌生存繁殖所必需的[2]。

大肠杆菌ERA表达量降低突变体表现为细胞分裂异常、细胞增长呈丝状、拟核数目增多，表明ERA在染色体分离后，胞质分裂前发挥重要作用[3-4]。

另有研究表明，ERA的C端能与核糖体16S RNA结合，对核糖体小亚基的组装成熟起重要作用[5-6]。

细菌的ERA蛋白序列具有高度保守性，不同种类细菌的ERA蛋白可以互补大肠杆菌ERA的功能[7-8]。

真核生物的ERA基因起源于原核生物，真核生物的ERA蛋白序列?c原核生物具有高度相似性，大多分布于线粒体或叶绿体中[9]。

人类ERA同源蛋白ERAL1定位于线粒体[10]，能与线粒体12S rRNA结合，参与核糖体小亚基的组装[11]。

ERAL1功能缺陷细胞从G1期进入到S期受阻，进而引发细胞凋亡[12]。

拟南芥ERA家族有2个成员ERA-1及ERA-2，亚细胞定位研究表明ERA-1定位于叶绿体，而ERA-2定位于线粒体[13]。

目前植物中ERA的功能尚未见报道，为了方便研究ERA-1在拟南芥叶绿体中的功能，将拟南芥ERA-1基因在大肠杆菌中表达，获得重组ERA-1蛋白经过纯化后免疫家兔制备多克隆抗体。

ERA-1多克隆抗体的成功制备，为后续研究ERA-1的生物学功能提供了条件。

1材料与方法1.1材料野生型拟南芥、era-1-1纯合突变体、ERA-1过表达株系（ERA-1OE-1、ERA-1OE-13、ERA-1OE-4、ERA-1OE-5）均为Columbia-0生态型背景，由笔者所在实验室保存。

拟南芥AtMYB61基因的克隆及表达载体构建

拟南芥AtMYB61基因的克隆及表达载体构建王云，任永兵，杨硕，韩宇，陶杨，曹树青(合肥工业大学生物与食品工程学院，安徽合肥230009)摘要：文章以拟南芥幼苗提取的总RNA为模板，利用RT-PCR技术扩增获得AtMYB61基因的全长cDNA片段，再克隆到pUCm-T载体上，菌落PCR、酶切鉴定和cDNA测序结果表明成功克隆了拟南芥AtMYB61基因。

从AtMYB61一pUCm-T载体上，用BstEII和BglII全双酶切切下目的基因片段，将此基因片段连接到植物表达载体pCAMBIA2301中。

菌落PCR和酶切鉴定结果表明成功构建了植物表达载体pCAMBIA2301一AtMYB61。

利用电转化法将重组表达载体导人根癌农杆菌中，获得了携带AtMYB61基因的根癌农杆菌株，为转基因改良植物抗逆性和进一步研究A ￡MyB61基因的抗逆分子机理奠定了基础。

关键词：拟南芥；AtMYB61基因；表达载体Cloning of Arabidopsis thaliana AtMYB61 geneand the expression vector constructionW ANG Yun， REN Yong-bing， YANG Shuo， HAN Yu， TAO Yang， CAO Shu-qing(School of Biotechnology and Food Engineering，Hefei University of Technology，Hefei 230009，China)Abstract：Tota1 RNA was extracted from Arabidopsis thaliana seedlings and used as the template to amplify the full length of eDNA of AtMYB6 1 gene by RT_PCR technology，and the gene fragment was subsequently cloned into plant pUCm-T vector．The results of bacterial colony PCR，enzyme analysisand eDNA sequencing confirmed that the Arabidopsis thaliana AtM YB6 1 gene was successfully cloned．AtMYB61 gene was cut completely from AtMYB61一pUCm-T vector by BstE 1]and BglⅡ，and the gene fragment was cloned into plant expression vector pCAMBIA2301．The results of bacterialcolony PCR and enzyme analysis showed the Successfu1 construction of plant expression vector pCAM—BIA2301一AtM YB61．In addition，the recombinant expression vector was carried into Agrobacterium tumefaciens by electrotransformation，and the strain of Agrobacterium tumefaciens carrying AtM YB6 1 gene was obtained．The study provides a basis for improving the resistance of transgenic plants and further exploring the molecular mechanism of AtM YB6 1 gene．Key words：Arabidopsis thaliana；AtMYB6 1 gene；expression vector0 引言随着一些抗逆基因的鉴定和抗逆机理不断深入研究，将外源抗逆基因导人植物的基因工程技术，在提高植物抗逆性方面具有更广泛的应用前景。

拟南芥基因克隆的策略与途径

基因功能验证试验
基因沉默
利用RNA干扰技术或CRISPR-Cas9技术对目标基因进行沉默，观察表型变化，以确定基因的功能。
互补试验
将缺失突变体与野生型植株进行杂交，以观察互补效应，验证目标基因的功能。
基因功能进化分析
序列比对
比较不同物种间目标基因的同源序列，分析序列的保守性和变异度，推测其进化和功能演化。
需要进一步完善基因克隆的策略和途径，提高克隆效率和准确性
需要加强国际合作与交流，共同推进基因克隆领域的发展
THANK YOU.
系统发育分析
根据物种间目标基因的遗传距离和系统发育关系，推断目标基因的起源和演化历程。
05
结论与展望
研究结论
拟南芥基因克隆的策略与途径研究取得了重要的阶段性成果
成功克隆了多个重要农艺性状基因，为抗逆、抗病、抗虫等育种提供了基础
深入探讨了基因克隆的策略和途径，为后续研究提供了重要的理论和实践依据
通用引物
利用已知基因的部分序列设计通用引物，通过PCR扩增得到目的基因。
特异引物
根据已知目的基因的部分序列，设计特异引物进行PCR扩增得到目的基因。
RACE技术拓展基因克隆途径
克隆延伸法
利用已知的基因序列信息，设计多段特异性引物，通过多次克隆延伸法（ RACE）得到全长目的基因。
RACE-PCR法
2023
拟南芥基因克隆的策略与途径
目录
• 引言 • 拟南芥基因克隆策略 • 拟南芥基因克隆途径 • 克隆基因的表达及功能分析 • 结论与展望
01
引言
拟南芥基因研究概述
拟南芥生物学研究的重要性拟南芥基因组的组成和特征
基因克隆的意义与价值

拟南芥基因克隆的策略与途径

RACE
利用已知的转录本序列设计引物，通过PCR扩增得到完整的转录本序列。
表达序。
基于表型的基因克隆策略
定位克隆
通过将表型与基因组连锁分析，定位到目标基因所在的染色体区间，再通过精细定位确定目标基因。
候选基因法
根据已知的生物学功能或代谢途径，筛选可能导致特定表型的候选基因，并进行克隆和验证。
03
拟南芥基因克隆的途径
克隆载体的选择与构建
质粒载体
质粒是一种可以独立复制的DNA分子，常用于克隆和表达基因。根据拟南芥基因的特点，选择适合的质粒载体进行构建。
病毒载体
病毒载体是一种高效的基因转移和表达系统，可用于拟南芥基因克隆。构建适合拟南芥的病毒载体，确保目的基因在拟南芥中稳定表达。
基因片段的获取与鉴定
鉴定新的功能基因
通过研究新的功能基因，可以更深入地了解拟南芥的生长发育机制和适应环境的能力，为作物改良和农业生产提供新的思路和方法。
研究基因的协同作用
拟南芥的生长发育受到许多基因的协同作用。研究这些基因之间的相互作用和调控机制，有助于更全面地了解拟南芥的生长发育过程。
探索基因编辑技术在农业中的应用
反向PCR
通过已知序列设计引物，从基因组DNA中扩增目标基因。
正向PCR
通过已知基因的部分序列设计引物，从基因组DNA 中扩增完整基因。
链接PCR
通过已知基因的两端序列设计引物，从基因组DNA 中扩增完整基因。
基于转录组的基因克隆策略
差异显示PCR
比较不同组织或发育阶段的转录本，找出差异表达的基因。
拟南芥基因克隆的意义与应用
拟南芥基因克隆对于研究植物生长发育、响应环境变化、抗病抗虫等方面具有重要意义，有助于揭示植物适应环境的机制和开发新的农业育种技术。

基因克隆论文植物反义表达载体论文：香石竹查尔酮合酶基因的克隆与植物反义表达载体的构建

基因克隆论文植物反义表达载体论文：香石竹查尔酮合酶基因的克隆与植物反义表达载体的构建【摘要】根据已发表的查尔酮合酶(chs)基因的序列，设计一对引物，以香石竹品种 master 的总cdna为模板,扩增出香石竹查尔酮合酶基因全阅读框架序列，以pgem-t为中间载体，序列检测的结果显示同henkel,j.等在ncbi的基因库中发表的从香石竹品种“clove pink”花瓣中提取的chs基因全开放阅读框序列一致。

将序列反义克隆到双元载体pbi-121上，并导入农杆菌中，经pcr及酶切分析鉴定，结果表明该片段的反义序列已克隆于载体中。

【关键词】查尔酮合酶植物反义表达载体基因克隆花色的形成与植物体内一类次级代谢产物类黄酮有关。

在花色形成中起最主要作用的是花色素。

花色素在花瓣中含量的增高或降低都可能改变花的颜色[1]。

查尔酮合酶(chalcone synthase,chs)是花色素合成中的一个关键酶,它催化丙二酰辅酶a的3个乙酸基和对羟基苯丙烯酰辅酶a的一个乙酸基的缩合,产生柚配基查尔酮[2]。

反义ｒｎａ（antisense rna ）技术是通过人工导入反义ｒｎａ,调控细胞内某些基因的表达,从而定向控制某些生物性状。

该项技术在基因功能研究、恶性生长控制、人工免疫及植物基本功能等方面的作用日渐显著。

反义ｒｎａ技术可以专一性地调节某一基因的活动,进一步了解这个基因的作用,这对研究未知基因的功能和表达情况提供了思路和途径,也为人类控制基因活动提供了方法。

由于反义ｒｎａ主要作用于转录水平,所以它可以避免二倍体生物同源基因互补而产生的困难。

此外,反义ｒｎａ对基因的调节不会改变目的基因的结构,在应用上更为安全。

为此,近年来利用反义ｒｎａ技术在花卉的品质改良上取得了很有价值的成果[3]。

在植物中，chs组成了一个多基因家族，具有8—10个成员，位于两个不同染色体上[4]，并且其正常表达主要集中于花组织中（花冠和花药）[5]。

拟南芥基因克隆的策略与途径

资料范本本资料为word版本，可以直接编辑和打印，感谢您的下载拟南芥基因克隆的策略与途径地点：__________________时间：__________________说明：本资料适用于约定双方经过谈判，协商而共同承认，共同遵守的责任与义务，仅供参考，文档可直接下载或修改，不需要的部分可直接删除，使用时请详细阅读内容拟南芥基因克隆的策略与途径拟南芥（Arabidopsis thaliana）是一种模式植物，具有基因组小（125 Mbp）、生长周期短等特点，而且基因组测序已经完成（The Arabidopsis Genomic Initiative, 2000）。

同时，拟南芥属十字花科（Cruciferae），具有高等植物的一般特点，拟南芥研究中所取得成果很容易用于其它高等植物包括农作物的研究，产生重大的经济效益，特别是十字花科中还有许多重要的经济作物，与人类的生产生活密切相关，因此目前拟南芥的研究越来越多地受到国际植物学及各国政府的重视。

基因(gene)是遗传物质的最基本单位,也是所有生命活动的基础。

不论要揭示某个基因的功能,还是要改变某个基因的功能,都必须首先将所要研究的基因克隆出来。

特定基因的克隆是整个基因工程或分子生物学的起点。

本文就基因克隆的几种常用方法介绍如下。

1、图位克隆Map-based cloning, also known as positional cloning, first proposed by Alan Coulson of the University of Cambridge in 1986, Gene isolated by this method is based on functional genes in the genome has a relatively stable loci, in the use of genetic linkage analysis or chromosomal abnormalities of separate groups will queue into the chromosome of a specific location, By constructing high-density molecular linkage map, to find molecular markers tightly linked with the aimed gene, continued to narrow the candidate region and then clone the gene and to clarify its function and biochemical mechanisms.图位克隆（map-based clonig）又称定位克隆（positoinal cloning），1986年首先由剑桥大学的Alan Coulson提出。

RT-PCR法克隆拟南芥中NPR1基因及其植物表达载体的构建

小气候使园林植物更容易感染多种病害，而一１．２方法
旦染病则极大地影响园林植物的观赏价值，造１．２．１引物设计
成较大的经济损失。
根据ＧｅｎＢａｎｋ上所提供的ＮＰＲ１基因的全序列
拟南芥（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａ）中的ＮＰＲ１（Ｎｏｎ— 设计引物。引物由Ｐｒｅｍｉｅｒ５和Ｏｌｉｇｏ６．０两个引物
过量表达可使植物的内源水杨酸得到高水平表达，ＧＡＧＣＴＪ，ｃＧＴｃＴｃＡｃｃＧＡｃＧＡｃＧＡＴＧ３。在上游弓Ｉ
从而能够诱发过敏性反应（Ｈｙｐｅｒｓｅｎｓｉｔｉｖｅｒｅｓｐｏｎｓｅ，物中加入了ＢａｍＨＩ酶切位点，在下游引物中加人
ＨＲ）和系统获得抗病性（Ｓｙｓｔｅｍｉｃａｃｑｕｉｒｅｄｒｅｓｉｓｔ— 了ＳａｃＩ酶切位点。
通讯作者Ｅ－ｍａｉｌ：ｄａｉｄｉｃｈｅ＠ｙａｈｏｏ．（３０１１１－ｃｎ
采用Ｉｎｖｉｔｒｉｇｅｎ公司的ＴｒｉｚｏｌＲｅａｇｅｎｔ提取拟南芥总ＲＮＡ，方法参照文献［２—３】，并加以改良。１．２．３ＲＴ—ＰＣＲ扩增
以水代替植物ＲＮＡ作为负对照，拟南芥总ＲＮＡ为模板，选用Ｔａｋａｒａ公司的ＢｃａＢＥＳＴＴＭＲＮＡ
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第３８卷第４期２００７年８月文章编号１００５—９３６９（２００７）０４—０４９１—０４
东北农业大学学报
ＪｏｕｒｎａｌｏｆＮｏｒｔｈｅａｓｔＡｇｎｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ
３８（４）：４９１－４９４
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拟南芥AAP1基因的克隆及植物表达载体的构建_崔喜艳

吉林农业大学学报2014，36（5）：564 569http：//xuebao．jlau．edu．cn Journal of Jilin Agricultural University E-mail：jlndxb@vip．sina．com 拟南芥AAP1基因的克隆及植物表达载体的构建*崔喜艳1＊＊，佟珊珊1，范贝1，王阔1，胡广宇1，刘相国21．吉林农业大学生命科学学院，长春130118；2．吉林省农业科学院农业生物技术研究所，长春130033摘要：拟南芥氨基酸透性酶1（AAP1，也叫NAT1）是植物中第一个被分离的氨基酸转运蛋白，在拟南芥主根、侧根、根毛及根表皮细胞中均有增加氨基酸含量的作用。

本研究利用ＲT－PCＲ的方法，从拟南芥中克隆了该基因，测序结果与GenBank（NM－104616.4）中已发表的拟南芥AAP1（AtAAP1）基因的同源性高达99.93%；并将AtAAP1基因与pCAMBIA3300构建p3300-AAP1植物表达载体，为过表达AtAAP1基因，提高作物氨基酸含量，从而改善作物氮素利用效率提供参考。

关键词：拟南芥；氨基酸透性酶1（AAP1）；克隆；植物表达载体中图分类号：Q785文献标识码：A文章编号：1000-5684（2014）05-0564-06DOI：10．13327/j．jjlau．2014．1886引文格式：崔喜艳，佟珊珊，范贝，等．拟南芥AAP1基因的克隆及植物表达载体的构建［J］．吉林农业大学学报，2014，36（5）：564-569．Cloning and Plant Expression Vector Construction of AtAAP1Gene from Arabidopsis thalianaCUI Xi-yan1，TONG Shan-shan1，FAN Bei1，WANG Kuo1，HU Guang-yu1，LIU Xiang-guo21．College of Life Sciences，Jilin Agricultural University，Changchun130118，China；2．Institute of Agricultural Biotechnology，Jilin Academy of Agricultural Sciences，Changchun130033，ChinaAbstract：Arabidopsis amino acid permease1（AAP1，also called NAT1）is the first separated a-mino acid transporter in plants，and AAP1gene is an important amino acid transporter to increase the content of amino acids in main roots，lateral roots，root hairs and root epidermal cells．In this study，AtAAP1gene was cloned from Arabidopsis thaliana byＲT－PCＲ．Sequence homology analy-sis showed that it had high similarity（99.93%）with Arabidopsis thaliana AAP1that has been sub-mitted to GenBank（NM－104616.4）．The plant expression vector p3300-AAP1was constructed by gene AtAAP1and pCAMBIA3300．It is the over expression of AtAAP1，which can increase amino acid content of crops，and thereby provide reference for improving nitrogen use efficiency．Key words：Arabidopsis thaliana；amino acid permease1（AAP1）；cloning；plant expression vec-tor植物种子贮藏蛋白的合成受多重因素的调节，蛋白积累很大程度上取决于氨基酸的供应。

拟南芥基因克隆的策略与途径

• CRISPR等基因编辑技术的应用：CRISPR等基因编辑技术将更广泛应用于拟南芥基因功能验证和研究，促进基因克隆技术的发展和应用。这些技术将帮助科学家们更精确地操控基因，并在验证基因功能方面提供强大的工具。
• 跨学科合作与数据共享：面对复杂的基因克隆挑战，跨学科的研究团队合作和数据共享将变得更为重要。通过整合不同领域的知识和技术，我们能够更全面地理解拟南芥的基因功能和调控机制，从而推动基因克隆技术的创新和发展。
VS
策略
首先根据目标基因序列，利用化学方法合成相应的DNA片段。将合成得到的DNA 片段进行测序验证，确保序列的准确性。之后，将合成基因亚克隆到适当的表达载体，进行后续的转基因和功能验证。此方法还可以结合基因编辑技术，如CRISPRCas9，对合成基因进行精确修饰，以研究特定基因突变的功能影响。
策略
利用已知的拟南芥测序验证后，将其亚克隆到适当的载体中进行后续操作。
通过合成生物学方法获取目的基因
优势
随着合成生物学的发展，研究者可以根据需求，人工合成特定的基因序列。这种方法不受自然资源的限制，能够根据需要定制基因。
限制酶切与连接
利用限制酶切割目标基因和载体，通过连接酶将目标基因与载体连接，构建重组质粒，进而导入宿主细胞进行扩增和表达。
基于CRISPR-Cas9系统的基因克隆策略
gRNA设计
根据目标基因序列设计特异性的导向RNA（gRNA），引导CRISPR-Cas9蛋白复合物定位并切割目标基因。
基因组编辑
THANK YOU
策略
首先通序验证，确保其与目标基因序列一致。之后，将目的基因亚克隆到适当的表
达载体，进行时期或条件下不表达的基因。适用于那些想要研究非表达基因或者进行全基因组分析的研究者。

拟南芥DND1、DND2基因及DND1启动子的克隆和载体构建

3.2.2 植物表达载体的构建 .......................................... 28 3.3 讨论........................................................... 29 3.3.1 GUS 在组织定位中的应用 ...................................... 29 3.3.2 植物双元表达载体 pORE ...................................... 29 4 AtDND1 亚细胞定位载体构建 .......................................... 30 4.1 实验材料与方法 ................................................ 30 4.1.1 实验材料 .................................................... 30 4.1.2 实验方法 .................................................... 31 4.2 结果与分析 .................................................... 33 4.2.1 基因克隆与测序 .............................................. 33 4.2.2 植物表达载体的构建 .......................................... 34 4.3 讨论........................................................... 36 4.3.1 绿色荧光蛋白 GFP 在亚细胞定位中的应用 ........................ 36 4.3.2 DND1 蛋白的亚细胞定位 ........................................ 36 5 结论............................................................... 36 致谢.............................................................. 38 参考文献 ....................................................... 39 作者简介 ....................................................... 45

拟南芥 CWINV1启动子 GUS 表达载体构建及转基因植株的鉴定

拟南芥 CWINV1启动子 GUS 表达载体构建及转基因植株的鉴定程姣;黄弈;任春梅【摘要】CWINV 是编码细胞壁蔗糖转化酶的基因。

为深入探讨 CWINV 基因的表达调控机理，构建了拟南芥 CW-INV1基因启动子的 GUS 融合表达载体并转入拟南芥，获得了转基因植株。

GUS 染色的结果进一步验证了重组表达载体的正确性和实用性。

%CWINV gene encoding the cell wall invertase.CWINV play an important role in plant growth and development, especially blooming,fruit setting,seed formation and other reproductive development period.But its function has not been e-lucidated in detail.In order to further exploring the mechanism of CWINV gene expression and regulation,the plant expres-sion vectors of CWINV1 gene promoter was constructed with GUS fused report genes,and then transformed into Arabidopsis, transgenic plants were obtained.GUS staining results further verifies the correctness and practicability of the recombinant expression vector.【期刊名称】《作物研究》【年(卷),期】2016(030)003【总页数】4页(P237-240)【关键词】拟南芥;CWINV1;载体构建;GUS 染色【作者】程姣;黄弈;任春梅【作者单位】湖南农业大学生物科学技术学院，长沙 410128;湖南农业大学生物科学技术学院，长沙 410128;湖南农业大学生物科学技术学院，长沙 410128; 作物基因工程湖南省重点实验室，长沙 410128【正文语种】中文【中图分类】Q78蔗糖转化酶是一种最常见的酶，存在于酵母、细菌和植物中，在植物中能够不可逆地催化蔗糖的水解反应，生成葡萄糖和果糖，因此，蔗糖转化酶在高等植物蔗糖代谢中起着关键的作用。

拟南芥基因的克隆和在油菜花中的表达

拟南芥m iR395d基因的克隆和过表达载拟南芥m iR395d基因的克隆和过表达载体构建及其在油菜中的转化
MicroRNAs (miRNAs) 是一类内生、非编码蛋白长度约为21～24个核苷酸的单链小分子RNA,在生物体内起着基因转录后的调控作用。对miRNA 作用机制研究显示, 成熟的miRNA 先与一种叫R ISC (RNA2induced silencing comp lex) 的复合物结合, 接着再特异性地与靶mRNA结合, 即与碱基互补的同源mRNA 配对结合, 引起靶mRNA的降解; 而当 miRNA与靶mRNA不完全互补时, miRNA则通过与对应的靶mRNA 的3′端非翻译区( 3′UTR) 结合阻止其转录后的翻译。由于植物中的miRNA与其靶 mRNA具有高度的碱基互补性, 因而植物miRNA可能更像siRNA的作用方式对靶基因进行降解。相反, 在动物细胞中, 大多数miRNA与其靶mRNA并不完全精确互补, miRNA则通过与对应的靶mRNA的3′ 端非翻译区( 3′UTR) 结合阻止转录后的翻译, 从而起到负调节其靶基因的表达作用。
表达载体pCAMBIA1304的T2DNA区结构的表达载体区结构
重组质粒的酶切鉴定
农杆菌EHA105菌液菌液PCR 农杆菌菌液
5.根癌农杆菌介导法转化油菜根癌农杆菌介导法转化油菜
无菌苗培养: 选取籽粒饱满的油菜种子用70%乙醇无菌苗培养选取籽粒饱满的油菜种子用乙醇表面消毒30 再用再用1 消毒5 表面消毒 s,再用 g·L - 1 HgCl2 消毒 min, 无菌水冲洗5次接种于种子萌发培养基(MS) 上, 置菌水冲洗次, 接种于种子萌发培养基 25 ℃光照培养箱中每天光照 h。预培养待无光照培养箱中, 每天光照12 。预培养: 菌苗长至第7天菌苗长至第天, 分别切取子叶和下胚轴为转化的外植体, 置于预培养基(MS +2 mg·L - 1 6 BA + 011 外植体置于预培养基黑暗预培养3 。 mg·L - 1 2, 4 D, pH 612) 中, 黑暗预培养 d。

拟南芥PR-1基因启动子的克隆与植物表达载体的构建

拟南芥PR-1基因启动子的克隆与植物表达载体的构建薛淑媛;李群;李冠【期刊名称】《生物技术》【年(卷),期】2008(18)3【摘要】根据已报道的拟南芥(Arabidopsis thaliana L.)病程相关蛋白基因(PR-1)序列设计引物,通过PCR技术从拟南芥中扩增得到水杨酸诱导表达的PR-l基因启动子片段,序列分析表明,该启动子含910bp核苷酸,与已报道的序列比较,核苷酸的同源性为99.7%。

将该启动子构建到植物表达载体pBI121上,获得病程相关蛋白基因(PR-1)启动子驱动的GUS报告基因的植物表达载体pBI-pr1p,将其转入根癌农杆菌GV3101,通过农杆菌介导转化拟南芥,获得转基因拟南芥植株,为深入研究寄主-病原物相互作用的分子机理奠定基础。

【总页数】4页(P6-9)【关键词】拟南芥;病程相关蛋白基因启动子;载体pBI-121;根癌农杆菌GV3101【作者】薛淑媛;李群;李冠【作者单位】新疆大学生命科学与技术学院生物工程研究所【正文语种】中文【中图分类】Q782【相关文献】1.小拟南芥 HDG12基因的克隆、生物信息学分析及植物表达载体的构建 [J], 梁志强;孔德真;李辉玲;裴娟;祝建波;王爱英2.拟南芥干旱胁迫诱导型启动子RD29B驱动AtCKX1基因植物表达载体的构建[J], 高喜乐;吴国江;李美茹3.拟南芥rd29A启动子的克隆及植物表达载体构建 [J], 申丽婕;于月华;刘娜;梁承娟;汪晓东;谷月好;崔雪;张振清;倪志勇4.Col生态型拟南芥AP3基因启动子克隆及植物表达载体构建 [J], 范丙友;高水平;侯小改;胥华伟;史国安;孔祥生5.拟南芥ACOS5基因启动子的克隆和表达载体构建 [J], 李亚琴;陈燕;郑帮;孙虎林;周树敏;张卫因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

拟南芥转录激活因子AtWRI1研究进展

拟南芥转录激活因子AtWRI1研究进展杨先友;黄有军;张通;黄春颖【摘要】As lipid has high economic value,studying the regulation processin oil biosynthesis is of great significance. WRI1,a transcriptional activator,plays a key role in this process. This paper focuses on its identification and structural characteristics,expression pattern,function and the regulation mechanism of AtWRII. It belongs to AP2 subtribe ofAP2/EREB family and has 7 exons. It expresses at different developmental stages of each organ,and the expressional level reaches the maximum at the oil synthesis stage of seeds. Through binding corresponding cis-function components,it activates the transcription of genes involving in glycolysis and fatty acid synthesis,and consequently promotes the oil synthesis. AtWRII is one of the downstream genes of AtLEC1 and AtLEC2. Mediated by CRL3-BPM complex, AtWRI1 is degraded via ubiquitin-26S proteasome pathway.%油脂具有较高的经济价值，研究植物油脂合成的调控过程具有重要意义。

水稻SLR1基因的克隆及其植物表达载体的构建

作者简介尉连伶（１９７３－），女，河北香河人，讲师，从事植物生理学的研究与教学工作。
收稿日期２００７! ０９! ２６
剪碎，置于１．５ｍｌ离心管中；缓慢加入液氮进行预冷，再加液氮后用研杵迅速磨碎叶片，并立即加入３００ μｌ６５ ℃预热的提取缓冲液，６５ ℃水浴约１ｈ，温浴时摇动３次；用等体积酚∶氯仿∶异戊醇、氯仿∶异戊醇各抽提１次，１２０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，转移水相到另一离心管中；加入１／１０体积的ＮａＡｃ（３ｍｏｌ／Ｌ）混匀，再加入２倍体积预冷的无水乙醇，混匀后静置２ｍｉｎ，１４０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ沉淀ＤＮＡ；用７０％冰浴乙醇２００ μｌ清洗ＤＮＡ沉淀，小心吸去乙醇，自然风干ＤＮＡ；最后溶于５０ μｌ重蒸水中，－２０ ℃保存备用。１．３水稻ＳＬＲ１基因的克隆在ＮＣＢＩ上搜索到水稻ＳＬＲ１基因ｃＤＮＡ序列，与水稻基因组ＳＬＲ１基因序列相同，设计１对引物（由上海生工公司合成）：ＳＬＲ１!Ｆ，５′!ＣＧＧＧＧＴＡＣＣＡＴＧＡＡＧＣＧＣＧＡＧＴＡＣＣＡＡ!３′；ＳＬＲ１!Ｒ，５′!ＣＧＧＧＧＴＡＣＣＡＣＴＴＴＧＣＧＡＧＣＡＣＧＣＣＧＣ!３′。在引物５′端引入ＫｐｎⅠ酶切位点。ＰＣＲ反应按标准体系进行，反应参数为：９４ ℃预变性５ｍｉｎ；９４ ℃ １ｍｉｎ，５６ ℃ １ｍｉｎ，７２ ℃ １ｍｉｎ３０ｓ，循环３０次；７２ ℃延伸１０ｍｉｎ。ＰＣＲ产物经琼脂糖凝胶电泳后用北京天为时代公司的ＤＮＡ凝胶回收试剂盒回收，并连接到ｐＧＥＭＴ载体中，通过蓝白筛选得到ｐＧＥＭＴＳＬＲ，送上海生工公司测序。１．４水稻ＳＬＲ１基因正义和反义表达载体的构建将ｐＧＥＭＴＳＬＲ和ｐＣＡＭＢＩＡ１３０１ＵＮＨＰ分别用ＫｐｎⅠ 单酶切；ＳＬＲ１基因片段通过ＤＮＡ凝胶回收试剂盒回收；植物表达载体用酚仿抽提和乙醇沉淀的方法（同“１．２”）得到。将片段和载体用Ｔ４ＤＮＡ连接酶连接，连接产物转化大肠杆菌ＤＨ５α感受态细胞。经筛选和测序后获得水稻ＳＬＲ１基因的

拟南芥NPR1基因的克隆与表达载体的构建

拟南芥NPR1基因的克隆与表达载体的构建
秦新民;李文兰;张丽珍;李惠敏;覃屏生
【期刊名称】《广西植物》
【年(卷),期】2005(025)001
【摘要】NPR1基因为植物抗病基因表达和系统获得性抗性中的一个关键基因.该文以DNA-PCR扩增的方法,从拟南芥基因组DNA中克隆出NPR1基因,通过序列分析,所克隆的NPR1基因与报道的基因序列完全一致.将其构建成植物表达载体,为今后植物抗病基因工程的开展奠定了基础.
【总页数】5页(P58-61,65)
【作者】秦新民;李文兰;张丽珍;李惠敏;覃屏生
【作者单位】广西师范大学生命科学学院,广西桂林,541004;广西师范大学生命科学学院,广西桂林,541004;广西师范大学生命科学学院,广西桂林,541004;广西师范大学生命科学学院,广西桂林,541004;广西师范大学生命科学学院,广西桂
林,541004
【正文语种】中文
【中图分类】Q789
【相关文献】
1.RT-PCR法克隆拟南芥中NPR1基因及其植物表达载体的构建 [J], 刘永光;车代弟;王金刚;龚束芳;攀金萍
2.RT-PCR克隆广谱抗病基因NPR1及其蛋白表达载体构建 [J], 刘永光;刘克锋;孙
向阳
3.RT-PCR克隆广谱抗病基因NPR1及其蛋白表达载体构建 [J], 刘永光;刘克锋;孙向阳
4.NPR1和Defensin双价抗病基因过量表达载体构建及其对沙田柚的遗传转化[J], 穆一帆;钟广炎;高峰;钟云;胡敏伦;闫化学;姜波;吴波
5.NPR1基因植物表达载体构建及对玉米的遗传转化 [J], 马力;兰磊;郝明远;高杰;王培真;于蕴吉
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拟南芥AtHEMA1基因的克隆及其表达载体的构建

拟南芥AtHEMA1基因的克隆及其表达载体的构建李潇;李翠萍;陈吉裕;苏承刚;张兴国【期刊名称】《西南园艺》【年(卷),期】2011(005)003【摘要】为探究AtHEMA1基因转化植物后对叶绿素合成机制的影响,本实验设计特异引物,以拟南芥基因组DNA为模板,采用PrimStar HS DNA聚合酶扩增AtHEMA1基因。

将AtHEMA1基因克隆至载体pVCT2101,获得植物表达载体pVCT2298。

%The AtHEMA1 gene was amplified via PCR with specially designed primers,PrimStar HS DNA polymerase and Arabidopsis thaliana gDNA,in order to research its influence on plant chlorophyll synthesis.The gene was inserted into vector pVCT2101 and the plant expr【总页数】4页(P10-12,25)【作者】李潇;李翠萍;陈吉裕;苏承刚;张兴国【作者单位】南方山地园艺学教育部重点实验室,西南大学园艺园林学院,重庆400715;南方山地园艺学教育部重点实验室,西南大学园艺园林学院,重庆400715;南方山地园艺学教育部重点实验室,西南大学园艺园林学院,重庆400715;南方山地园艺学教育部重点实验室,西南大学园艺园林学院,重庆400715;南方山地园艺学教育部重点实验室,西南大学园艺园林学院,重庆400715【正文语种】中文【中图分类】S511【相关文献】1.小拟南芥 HDG12基因的克隆、生物信息学分析及植物表达载体的构建 [J], 梁志强;孔德真;李辉玲;裴娟;祝建波;王爱英2.拟南芥CAX1基因克隆及表达载体的构建 [J], 江丽慧;伍林涛;高志宏;秦信蓉;宋金宝;熊文霞;李东;张薇3.拟南芥 AtTTG1基因的克隆及用于转化花生的 MAR 调控表达载体构建 [J], 陈湘瑜;郑国栋;黄金堂;庄伟建4.拟南芥(Arabidopsis thaliana)DWF4基因克隆、生物学信息分析及过表达载体构建 [J], 韦春;杨莉琴;秦利军5.拟南芥ACOS5基因启动子的克隆和表达载体构建 [J], 李亚琴;陈燕;郑帮;孙虎林;周树敏;张卫因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。