免疫扩散实验(双向双扩散) PPT
生化大实验双向琼脂免疫扩散
○ ○ ○ 三孔型
○ ○
双孔型
○ ○ ○ ○ 双排孔型
○ ○○○ ○
梅花孔型
图1 双向免疫琼脂扩散孔型
三 试剂与器材
1.缓冲液：4.65gTris加水溶解，加115ml 0.1 M HCl，最后补水至1000ml，pH为8.2。 2.凝胶液：5g琼脂糖加500ml上述缓冲液， 微波炉加热煮沸溶解。注意用中小火， 以免暴沸。 3.待测样品：I号峰、II号峰、III号峰 4.羊抗人IgG抗体、羊抗人LDL抗体、羊抗 人apoA-I抗体。 5.生化培养箱、微波炉、刻度吸管、培养 皿、下口径2mm滴管等
二 实验原理
双向免疫扩散是一种定性试验。将抗原、抗体分 别加入琼脂板相对应的小孔中，使两者互相扩散， 在比例适当处形成可见的沉淀线。观察沉淀线的 位置、数量、形状，以及对比关系，可对抗原或 抗体进行定性分析，常用于: （ 1 ）抗原或抗体的纯度鉴定。也可对抗体效价进行 初步估算。 （ 2 ）用已知抗血清（或抗原）检测未知抗原（或抗 体） （3）抗原或抗体相对分子量的估计 双向免疫扩散常见孔型有三孔型、双孔型、双排 孔型、梅花孔型（见图1）
五 注意事项
1.用琼脂浇培养皿时，培养皿必须保持水平位置。
2.每个孔的加样量应保持一致，既使每个孔都被 加满，又必须不使样品溢出孔外。 3.打孔时注意不要将孔弄破。
六 复习题
医学免疫学实验《双扩凝集反应》精品课件
红细胞表面Ag A B
A、B —、—
血清中Ab 抗B 抗A
—、— 抗A、抗B
❖ ABO和Rh血型是与人类输血关系最为密切的两 个血型系统。
❖ 当一个人的红细胞上存在一种D血型物质（抗原） 时，则称为Rh阳性，用Rh（+）表示；当缺乏 D抗原时即为Rh阴性，用Rh（-）表示。
LOGO
Your site here
LOGO
沉淀反应与凝集反应
抗原（antigen, Ag）: 能够刺激机体产生抗体和致敏淋巴细胞，并能与之特
异性结合的物质。
抗体(antibody, Ab)： B细胞识别抗原后增殖分化为浆细胞所产生的可特
异性结合抗原的一组糖蛋白。
LOGO
Your site here
抗原-抗体反应的特点与影响因素
LOGO
结果判断
LOGO
Your site here
应用
❖ 测定抗体的效价 ❖ 用特异性抗体检测抗原 ❖ 检查抗原和免疫血清的特异性、纯度或浓度，比较抗
原之间的异同点
LOGO
Your site here
凝集反应 ——ABO血型鉴定
❖ 原理
颗粒性抗原(完整的病原微生物或红细胞等)与相 应抗体特异性结合，在有电解质存在的条件下，形成 肉眼可见的凝集团块。
❖ 原理
用半固体琼脂凝胶作为介质，可溶性抗原、抗体 在其中能自由扩散。将可溶性抗原和抗体分别加入琼 脂板上相对应的孔中，两者各自向四周扩散，如果抗 原和抗体相对应，则在两者比例适当处形成白色沉淀 线。
生化大实验双向琼脂免疫扩散
二 实验原理
双向免疫扩散是一种定性试验。将抗原、抗体分 别加入琼脂板相对应的小孔中，使两者互相扩散， 在比例适当处形成可见的沉淀线。观察沉淀线的 位置、数量、形状，以及对比关系，可对抗原或 抗体进行定性分析，常用于: （ 1 ）抗原或抗体的纯度鉴定。也可对抗体效价进行 初步估算。 （ 2 ）用已知抗血清（或抗原）检测未知抗原（或抗 体） （3）抗原或抗体相对分子量的估计 双向免疫扩散常见孔型有三孔型、双孔型、双排 孔型、梅花孔型（见图1）
○ ○ ○ 三孔型
○ ○
双孔型
○ ○ ○ ○ 双排孔型
○ ○○○ ○
梅花孔型
图1 双向免疫琼脂扩散孔型
三 试剂与器材
1.缓冲液：4.65gTris加水溶解，加115ml 0.1 M HCl，最后补水至1000ml，pH为8.2。 2.凝胶液：5g琼脂糖加500ml上述缓冲液， 微波炉加热煮沸溶解。注意用中小火， 以免暴沸。 3.待测样品：I号峰、II号峰、III号峰 4.羊抗人IgG抗体、羊抗人LDL抗体、羊抗 人apoA-I抗体。 5.生化培养箱、微波炉、刻度吸管、培养 皿、下口径2mm滴管等
四 操作步骤
1. 制板：用移液管吸取热琼脂 20ml，平铺 于直径9cm培养皿中。 2.打孔：待琼脂凝固后，按图1梅花孔型打 孔，孔径 2mm, 孔与孔距离 3-4mm。用针 挑去孔内琼脂。 3.用微量加样器将羊抗人IgG抗体、羊抗人 LDL 抗体及羊抗人 apoA-I 抗体各 5-10ul 加 入周边孔中，中间孔加不同峰的液体。 4. 将培养皿置于生化培养箱内，于 37 ℃温 育，隔天观察结果。
双向免疫扩散试验
1.双扩散用于疾病诊断： 以IBD诊断为例，中心孔加 IBD标准阳性血清，周围孔 分别加IBD标准抗原、生理 盐水、待检抗原1.2.3.4。
2.双扩散用于抗体检测： 以免疫鸡IBD抗体检测为例， 中心孔加IBD标准抗原，周 围孔分别加IBD标准阳性血 清、IBD阴性血清、待检血 清1.2.3.4。
实验三 双向免疫扩散试验
一 目的要求
1.复习巩固免疫化学的基本知识 2.熟练掌握免疫扩散法的操作步骤 3.掌握其在抗血清效价的测定和特异性
抗体的分析中的应用
二 实验原理
A. 琼脂糖的疏散网状结构有利于大分子 的自由迁移
B. 合适比例的抗原抗体结合后聚集形成 沉淀；
C. 沉淀的产生阻止抗原抗体复合物的自 由运动；
以3mm孔径打孔器打孔一排，孔距5mm。电 泳前各孔中加入抗原液，每孔20μL。
4．电泳：250伏1.5小时（滤纸搭桥）
5．结果判定
电泳结束后，取出琼脂板，加1％鞣酸 生理盐水浸泡后30分钟，观察与测定结果。
四 结果
五 讨论
试分析沉淀峰出现云雾状或圆形的原因 及解决方案。
2. 抗原在稀释板中倍比稀释 1/1 、1/2、1/4、1/8、待测样品
首先加入
首先加入
首先加入
50ul缓冲液 50ul缓冲液 50ul缓冲液
1/1
Baidu Nhomakorabea
单向双向免疫琼脂扩散
检测未知抗原或抗体
ABC DEF
Ag Ab
A: 浓度Ag、Ab及扩散率近似； B：浓度Ag、Ab近似，扩散率Ag＞Ab ； C：浓度Ag、Ab近似，扩散率Ag＜Ab ； D：浓度Ag＞Ab，扩散率近似； E：浓度Ag＞Ab，扩散率Ag＞Ab ； F：浓度Ag＜Ab，扩散率Ag＜Ab ；
抗原性质分析
量（单位/ml）为横座标，绘制成标准曲线。
实验结果
用尺子测量并记录沉淀环直径，然后以沉淀环直径为纵座标，以标准参考蛋白量 （单位/ml）为横座标，绘制成标准曲线。
实验结果
注意事项
制备抗体琼脂板时，琼脂温度必须严格控制，温度太低琼脂会凝固，太高则会影 响抗体的活性；
加样孔内的琼脂应挑干净，切不可损坏孔的边缘，确保每孔的液面基本一致； 加样量一定要精确，并且不能逸出孔外，否则结果不好观察；
火箭免疫电泳
单向免疫琼脂扩散
实验原理
将适量的抗体均匀混入琼脂内制成琼脂板，打孔，在孔中加入一定量的待测抗原， 抗原向四周呈辐射状扩散，与抗体相遇，在比例合适时形成白色沉淀环。
实验原理
此方法用已知的抗体测未知的抗原。由于抗体已与凝胶混合，不会再扩散，仅抗 原从小孔向四周扩散，因此称为单向琼脂扩散试验。
实验原理
沉淀线的特征与位置不仅取决于抗原抗体的特异性及相互间比例，而且与其分子 大小及扩散速度相关。
免疫双向扩散实验
双向扩散法—抗原分析
【原理】
双向扩散法是指可溶性抗原与相应抗体在琼脂介质中相互扩散而形成一定类型沉淀线的方法。沉淀线的特征与位置不仅取决于抗原抗体的特异性及相互间浓度比例，而且与其分子大小及扩散速度相关。当抗原抗体存在多种系统时，可呈现多条沉淀线以至交叉反应。【材料】
生理盐水1%琼脂管（每管约4ml）
载玻片
打孔器及打孔模板
微量加样器及塑料吸头
抗体及抗原1、2、3、4、5、6。
湿盒
【方法】
1．将已溶化的1%琼脂盐水管放56~60℃水浴箱中平衡温度备用。
2．将载玻片置于水平桌面上，倾注已溶化琼脂3.5~4ml，使成厚度约1.5mm琼脂板。3．凝固后，将打孔模板置于琼脂板下，然后用打孔器打孔，根据不同需要可制成三角型、方阵型或梅花型。本次实验采用三角型，即每一个三角型的三个孔为一组。（因本次实验所制备的琼脂板均以载玻片为底板故根据其大小只能采用三角型同时每一琼脂板也只能制成两组。否则，如采用方阵型或梅花型则因琼脂板边缘琼脂厚度不够而使周边各孔所加抗原或抗体量不足或溢出，如制成三角型三组，因各孔相距过近相互渗透扩散而难于正确判定结果）。
4．用微量加样器加抗体各10μl。各组所余两孔各按抗原1、2为一组，3、4为二组，5、6为三组，分别各加入10μl。注意每加一样品均需更换加样器塑料吸头，以防止交叉现象影响实验结果。
5．作好记录，放湿盒中，置37℃温箱，24小时后观察结果。
【结果】
说明：
（1）融合性沉淀弧，说明两孔中抗原相同，为同一性反应。
（2）两沉淀线独自形成并形成交叉，说明两孔中的抗原完全不同，为非同一性反应。（3）融合性沉淀弧出现支线，或同时有另一条或两条沉淀线，说明两孔中抗原有相同部分又有不同部分，此为部分同一性反应。
免疫学实验课件：实验三(2)琼脂免疫扩散实验
实验目的与要求
➢以牛血清白蛋白双向扩散试验为例，掌 握双向双扩散试验的原理、操作方法及 结果的判定。
实验原理：
➢ 双向双扩散试验是一种定型试验，可溶性抗原 与相应的抗体在琼脂凝胶中各自向四周扩散， 若抗原与抗体相对应，则在二者比例适当处形 成白色沉淀线;若抗原与抗体无关，则不会出 现沉淀线。
图4 抗原特异性与沉淀线形状的关系
▪ 2,相应抗原抗体所形成的沉淀线，如二者浓度相当，沉淀 线在孔中央，二者浓度不当时，则沉淀线偏向浓度低的一 侧
▪ 注意事项:
➢ 加样量பைடு நூலகம்定要精确，并且不同逸出孔外，否则 结果不好观察;
➢ 制板时，玻片要清洁，边缘要整齐，加琼脂糖 时要避免产生气泡;
➢ 打孔时注意避免产生裂缝或将琼脂与玻片脱离。
▪ 试剂与器材
➢1.2%的琼脂糖（用生理盐水配制） ➢已知抗原、待检血清、阳性血清、阴性
血清 ➢平皿或（载玻片）、酒精灯、湿盒、打
孔器、37℃恒温箱、移液器等。
操作方法
➢制板：趁热将已溶化琼脂糖倒入洁净的平板内或
（用注射器吸取3.5ml加热溶化的1.2%琼脂糖浇 注于一洁净的载玻片上，）厚度2.5-3.0mm，注 意勿产生气泡。
2）阴阳性检测：中央孔加抗原，外周孔分别加待检血清， 要设立阴性血清和阳性血清对照。
➢ 扩散:加样完毕后，将琼脂板放湿盒中，保持一定的湿度，
免疫扩散实验
4. 抗体效价测定：用微量加样器于中央孔加 入已知抗原，于周围孔加倍比稀释的血清， 每个稀释度加1孔。加样时不要使样品外 溢或在边缘残存小气泡，以免影响扩散结 果。 5. 阴阳性定性检测：中央孔加抗原，外周孔 分别加待测血清，要设立阴性血清和阳性 血清对照。 6. 扩散：加样完毕后，将琼脂板放于湿盒内， 保持一定的湿度，置于37℃温箱中扩散 24~48小时观察结果。
双向双(相）扩散 （double diffusion in two dimension)
三、实验材料
生理盐水 1.2%琼脂（生理盐水配制） 已知牛血清白蛋白抗原、待检血清 打孔器、微量加样器、锥形瓶、搪瓷盒等
四、实验步骤
1. 制板：用吸管吸取3.5毫升加热融化的1.2%琼脂 浇注于一块清洁的载玻片上，厚度2.5~3.0mm, 注意勿产生气泡。 2. 打孔：待琼脂凝固好后用打孔器打孔，孔径和 孔距依不同疫病检疫规程而定，一般孔径 3~5mm，孔间距4~7mm。孔型多为7孔，中央 1孔，周围6孔（如下图1梅花孔）。用针头挑出 孔内琼脂。 3. 封底：将琼脂板无凝胶面在酒精灯火焰上轻轻 灼烧，用手背感受微烫即可。
图1
五、结果判定
1. 用以检测抗原或比较抗原差异时，将抗血 清置中心孔，将待测抗原或需比较的抗原 置于周围相邻孔。若出现沉淀带完全融合， 证明为同种抗原；若二者有部分相连，表 明二者有共同抗原决定簇；若二条沉淀线 相互交叉，说明二者抗原完全不同。
双向琼脂扩散试验课件
观察抗原和抗体在琼脂糖凝胶中 的扩散情况，记录结果。
记录
将观察到的结果记录在表格中，包 括抗原和抗体的扩散情况、显色程 度等。
分析
根据记录的结果，分析抗原和抗体 的亲和性、特异性等特性。
04
试验结果分析
结果解读
试验结果解读
根据试验结果，对试验数据进行分析，判断受试物是否符合标准 要求。
异常结果判断
双向琼脂扩散试验课 件
目录
• 双向琼脂扩散试验简介 • 试验材料与设备 • 试验操作流程 • 试验结果分析 • 双向琼脂扩散试验的应用 • 双向琼脂扩散试验的优缺点
01
双向琼脂扩散试验简介
定义与原理
定义
双向琼脂扩散试验是一种基于抗 原抗体反应的血清学试验，用于 检测抗原或抗体的存在。
原理
当抗原和抗体在琼脂凝胶中扩散 时，两者相遇会发生特异性结合 ，形成可见的沉淀线或沉淀环。
06
双向琼脂扩散试验的优缺 点
优点
敏感性高
双向琼脂扩散试验对微量抗原和抗体 具有较高的检测敏感性，能够检测低 浓度的抗原和抗体。
特异性好
由于采用凝胶作为介质，能够较好地 消除非特异性干扰，提高试验的特异 性。
操作简便
该试验方法操作相对简单，所需设备 较少，适合基层实验室应用。
结果直观
试验结果以白色沉淀线形式呈现，直 观易于判读。
免疫扩散实验(双向双扩散)ppt课件
免疫扩散实验(双向双扩散)
12
思考题
▪ 如何进行血清琼扩效价的测定？
免疫扩散实验(双向双扩散)
13
免疫扩散实验(双向双扩散)
2
实验原理
▪ 双向双扩散简称双扩散，此法是一种定性 试验。可溶性抗原与相应的抗体在琼脂凝 胶中各自向四周扩散，如果抗原和抗体相 对应，则在二者比例适当处形成白色沉淀 线；若抗原和抗体无关就不会出现沉淀线。 此试验可以检测抗原或抗体的纯度，滴定 抗体的效价，以及用已知抗原（抗体）检 测和分析未知抗体（抗原）。
免疫扩散实验(双向双扩散)
9
双向免疫扩散凝胶染色图
免疫扩散实验(双向双扩散)
10
免疫扩散实验(双向双扩散)
11
注意事项
▪ 浇制琼脂板时要均匀、无气泡。 ▪ 孔要打得圆整光滑，边缘不要破裂。 ▪ 加样时应尽量避免气泡或加到孔外，以保
证结果的准确性。 ▪ 注意微量进样器每加一个样品之后，更换
枪头。
2. 打孔：待琼脂凝固好后用打孔器打孔，孔径和 孔距依不同疫病检疫规程而定，一般孔径 3~5mm，孔间距4~7mm。孔型多为7孔，中央 1孔，周围6孔（如梅花孔）。用针头挑出孔内 琼脂。
3. 封底：将琼脂板无凝胶面在酒精灯火焰上轻轻 灼烧，用手背感受微烫即可。
免疫扩散实验(双向双扩散)
5
4. 抗体效价测定：用微量加样器于中央孔加 入已知抗原，于周围孔加倍比稀释的血清， 每个稀释度加1孔。加样时不要使样品外 溢或在边缘残存小气泡，以免影响扩散结 果。
实验一_双向免疫扩散试验
实验一双向免疫扩散试验
一、实验目的
1、熟练掌握免疫扩散法的操作步骤
2、掌握抗血清效价的测定和特异性抗体的分析技术
二、实验原理
在一定条件下，抗原能与相应的抗体相互作用，发生免疫沉淀反应。免疫扩散法就是使抗原与抗体在琼脂糖凝胶中自由扩散而相遇，从而形成抗原抗体复合物，由于此复合物分子量增大并产生聚集，不再继续扩散而形成肉眼可见的带状或线状沉淀带。抗原抗体复合物的沉淀带是一种特异性的半渗透性屏障，它可以阻止免疫学性质与其相似的抗原抗体分子通过，而允许那些性质不相似的分子继续扩散，这样由不同抗原或不同抗体所形成的沉淀带各有各的位置，从而可以分离和鉴定混合系统。
利用琼脂糖凝胶作为扩散介质是因为一定浓度的琼脂糖凝胶，其内部为多孔网状。而且孔径很大，可以允许大分子物质（分子量自十几万到几百万以上）自由通过。因为大多数抗原和抗体的分子量都在20 万以上，所以它们在琼脂糖凝胶中几乎可以自由扩散。而且琼脂糖凝胶又具有良好的化学稳定性、含水量大、透明度好、来源方便、处理容易等优点，因此是免疫沉淀检测技术中最理想的扩散介质。
双向免疫扩散法测定时将加热溶化的琼脂或琼脂糖浇至玻片上，等琼脂凝固后，打多个小孔，将抗原和抗体分别加入小孔内，使抗原和抗体在琼脂板上相互扩散。当二个扩散圈相遇，如抗原和抗体呈特异性的结合且比例适当时，将会形成抗原抗体复合物的沉淀，该沉淀可在琼脂中呈现一条不透明的白色沉淀线。如果抗原与抗体无关，就不会出现沉淀线，因此可以通过该试验，用特异性抗体鉴定抗原，或反之用已知抗原鉴定抗体。
三、实验仪器和试剂
实验七 免疫双扩散检测抗GFP血清抗体
实验七免疫双扩散检测抗GFP血清抗体
[实验原理] 在溶液中的可溶性多价抗原与血清抗体相遇，当两者的比例适当时可以形成一种网状的不溶性的大分子复合物，这叫作免疫沉淀反应。当这样的抗原和相应的抗体在含有电解质的琼脂凝胶中相对扩散时，在抗原与抗体的比例适当处会形成可见的沉淀线，这叫免疫双扩散实验，是免疫沉淀反应的一种。免疫双扩散常用于动物免疫效果的检测和血清抗体效价的测定。本实验使用的粗抗原是大肠杆菌表达的GFP的抽提物，抗体是GFP免疫兔子后得到的抗血清。
[仪器、试剂和材料]
1、磷酸盐缓冲液（PBS），pH 7.4
2、1.5%琼脂，PBS配置
3、兔抗GFP血清
4、GFP粗提物
5、微波炉
6、恒温培养箱
7、载玻片
8、自制打孔器
9、小塑料盒
10、针头、牙签
11、“枪”、“枪头”
[实验操作]
1、1.5%琼脂的配制:pH 7.4的PBS 100mL中加1.5克琼脂，微波炉中小功率加热，使琼脂完全溶化。
2、取干净的载玻片，平放于实验台（台面要水平），将融化的琼脂趁热加在载玻片上（约加4mL），使琼脂铺满整个玻片的表面（注意勿使琼脂流出玻片之外）。令其在室温下冷却凝固。
3、将载玻片放在画好的打孔式样的样板上，用自制打孔器（内径2-3毫米）在琼脂上照样板打孔，做两朵“花”。用针头小心地将打好的孔中的琼脂挑出，当心不要碰伤了孔周围的琼脂。打好孔后，把凝胶的右下角切掉一小块，作为标记。
4、GFP抗原的稀释：用上次实验得到的GFP粗提物的饱和硫酸铵沉淀，加100mL的PBS使溶解，此为抗原的原液。取出原液15mL，在一小块封口膜上用PBS做系列的倍比稀释，直到稀释为1：16。
免疫双扩散法的基本原理
免疫双扩散法的基本原理
免疫双扩散法（Immune Double Diffusion）是一种常用的免疫学实验方法，用于检测特定抗原与抗体之间的相互作用。该方法基于抗原和抗体在凝胶中扩散的原理，通过观察扩散过程中形成的免疫沉淀线来确定样品中是否存在目标抗原。
免疫双扩散法的基本原理是基于抗原与抗体之间的可逆结合。在实验中，首先将待测抗原和已知抗原分别与相应的抗体混合，形成抗原-抗体复合物。然后，将这些混合物分别加入含有琼脂糖的凝胶孔中，使其扩散。
当抗原-抗体复合物扩散到凝胶孔中时，它们会与在凝胶中预先添加的相应抗体结合。这种结合会导致免疫沉淀的形成，形成可见的沉淀线。沉淀线的长度和密度与待测抗原的浓度成正比，可以通过比较不同样品中沉淀线的形成情况来定量测定目标抗原的含量。
免疫双扩散法的优势在于其简单性和灵敏性。无需复杂的仪器和设备，只需一些基本的实验器材即可进行实验。此外，该方法可以同时检测多个样品中的抗原，因此在高通量的实验中具有一定的优势。
在实际应用中，免疫双扩散法被广泛用于医学诊断、生物学研究和药物研发等领域。例如，通过检测血清中特定抗原的含量，可以帮助医生诊断某些疾病。在疫苗研发中，该方法可以用于检测疫苗中抗原的含量和纯度。此外，免疫双扩散法还可以用于检测抗体的结
合特异性以及抗原的相互作用。
然而，免疫双扩散法也存在一些局限性。首先，该方法对于低浓度的抗原检测较为困难，因为低浓度的抗原很难与抗体有效结合形成免疫沉淀。其次，该方法的定量结果受到多种因素的影响，如温度、孔的大小和凝胶的浓度等。因此，在实验过程中需要进行严格的控制和标准化操作。
双向免疫扩散试验
2. 抗原在稀释板中倍比稀释 1/1 、1/2、1/4、1/8、待测样品
首先加入
首先加入
首先加入
50ul缓冲液 50ul缓冲液 50ul缓冲液
1/1
1/2
1/4
1/8
100ul抗原 50ul1/1抗原 50ul1/2抗原 50ul1/4抗原
3．打孔、加样火箭电泳试验示意图 待琼脂凝固后，于距玻板一长边10mm处，
实验三 双向免疫扩散试验
一 目的要求
1.复习巩固免疫化学的基本知识 2.熟练掌握免疫扩散法的操作步骤 3.掌握其在抗血清效价的测定和特异性
抗体的分析中的应用
二 实验原理
A. 琼脂糖的疏散网状结构有利于大分子 的自由迁移
B. 合适比例的抗原抗体结合后聚集形成 沉淀；
C. 沉淀的产生阻止抗原抗体复合物的自 由运动；
【实验原理】
在电场作用下，抗原在含定量抗体 的离子琼脂糖中泳动后，如二者比例合 适时，可在短时间内出现锥形的沉淀峰， 形似火箭状，故又称为火箭电泳。此沉 淀峰的高度与抗原的浓度成正比，与抗 体的浓度成反比。
+
10mm
5mm
【操作步骤】
1.琼脂糖玻板的制备 30ml 1.5％的琼脂糖悬液（0.45g琼脂糖+ 0.025M的巴比妥缓冲液）→微波炉溶解→等 温度降到56℃时→加入200μl抗体→浇制琼 脂厚度为1～2mm抗体琼脂板。
免疫扩散试验
免疫双向扩散试验
一原理
为免疫沉淀反应剂中的抗原和抗体在含有电解质的琼脂凝胶中扩散相遇，在二者比例合适的地方，生成肉眼可见的线状沉淀物，即特异性抗原-抗体复合物。
琼脂凝胶含水量为98-99%时，形成网状结构，允许分子量20kDa以下的大分子物质自由扩散。因为大部分抗原、抗体的分子量在20kDa以下，所以在琼脂凝胶中基本上可以自由扩散。因不同抗原的化学结构、分子量和带电情况不同，所以在琼脂凝胶中的扩散速度不同，因而将不同的抗原进行分离。彼此分离的抗原与它们相应的抗体在不同的部位结合，二者在比例适当的地方，因抗原-抗体复合物是不溶性的而从溶液中析出，变成肉眼可见的沉淀物，称为沉淀线。
二实验材料
正常人血清，兔抗人抗血清
三试剂配制
●0.9%的生理盐水100ml
取0.9g氯化钠加水到100ml
● 1.5%琼脂糖（每实验台配制50ml即可）
取1.5g琼脂糖用100ml生理盐水溶解，微波炉（或电炉）加热融化
●抗血清每实验台一份
●制板（是本实验的关键）
取一清洁干燥的载玻片平放于清洁且水平处，做好标记后（姓名，浓度）将已经融化并冷却到30度左右的琼脂糖用小烧杯铺于载玻片上。琼脂糖铺板后应该均匀，不能凸凹不平，注意胶的厚度。
四实验操作程序
用生理盐水配制1.5%琼脂糖
↓
加热，融化
↓
制板，厚2-3mm
↓
打孔（用吸管打孔），小孔分布形状如图
↓
10μl人血清（淡黄色）加入中央孔
（注意微量进样器的使用）
↓
不同稀释倍数（原倍、2、4、8、16、32倍）的兔抗人抗血清（色深）加入周围各孔20μl （用生理盐水在1.5ml小离心管倍比稀释即可，）
(推荐)免疫双向扩散实验
双向扩散法—抗原分析
【原理】
双向扩散法是指可溶性抗原与相应抗体在琼脂介质中相互扩散而形成一定类型沉淀线的方法。沉淀线的特征与位置不仅取决于抗原抗体的特异性及相互间浓度比例，而且与其分子大小及扩散速度相关。当抗原抗体存在多种系统时，可呈现多条沉淀线以至交叉反应。
【材料】
生理盐水1%琼脂管（每管约4ml）
载玻片
打孔器及打孔模板
微量加样器及塑料吸头
抗体及抗原1、2、3、4、5、6。
湿盒
【方法】
1．将已溶化的1%琼脂盐水管放56~60℃水浴箱中平衡温度备用。
2．将载玻片置于水平桌面上，倾注已溶化琼脂3.5~4ml，使成厚度约1.5mm琼脂板。
3．凝固后，将打孔模板置于琼脂板下，然后用打孔器打孔，根据不同需要可制成三角型、方阵型或梅花型。本次实验采用三角型，即每一个三角型的三个孔为一组。（因本次实验所制备的琼脂板均以载玻片为底板故根据其大小只能采用三角型同时每一琼脂板也只能制成两组。否则，如采用方阵型或梅花型则因琼脂板边缘琼脂厚度不够而使周边各孔所加抗原或抗体量不足或溢出，如制成三角型三组，因各孔相距过近相互渗透扩散而难于正确判定结果）。
4．用微量加样器加抗体各10μl。各组所余两孔各按抗原1、2为一组，3、4为二组，5、6为三组，分别各加入10μl。注意每加一样品均需更换加样器塑料吸头，以防止交叉现象影响实验结果。
5．作好记录，放湿盒中，置37℃温箱，24小时后观察结果。
【结果】
说明：
（1）融合性沉淀弧，说明两孔中抗原相同，为同一性反应。
（2）两沉淀线独自形成并形成交叉，说明两孔中的抗原完全不同，为非同一性反应。（3）融合性沉淀弧出现支线，或同时有另一条或两条沉淀线，说明两孔中抗原有相同部分又有不同部分，此为部分同一性反应。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
双向免疫扩散凝胶染色图
注意事项
▪ 浇制琼脂板时要均匀、无气泡。 ▪ 孔要打得圆整光滑，边缘不要破裂。 ▪ 加样时应尽量避免气泡或加到孔外，以保
证结果的准确性。 ▪ 注意微量进样器每加一个样品之后，更换
枪头。
思考题
▪ 如何进行血清琼扩效价的测定？
▪ 打孔：待琼脂凝固好后用打孔器打孔，孔径和 孔距依不同疫病检疫规程而定，一般孔径 3~5mm，孔间距4~7mm。孔型多为7孔，中央 1孔，周围6孔（如梅花孔）。用针头挑出孔内 琼脂。
▪ 封底：将琼脂板无凝胶面在酒精灯火焰上轻轻 灼烧，用手背感受微烫即可。
▪ 抗体效价测定：用微量加样器于中央孔加 入已知抗原，于周围孔加倍比稀释的血清， 每个稀释度加1孔。加样时不要使样品外 溢或在边缘残存小气泡，以免影响扩散结 果。
▪ 扩散：加样完毕后，将琼脂板放于湿盒内， 保持一定的湿度，置于37℃温箱中扩散 24~48小时观察结果。
图1
结果判定
▪ 用以检测抗原或比较抗原差异时，将抗血 清置中心孔，将待测抗原或需比较的抗原 置于周围相邻孔。若出现沉淀带完全融合， 证明为同种抗原；若二者有部分相连，表 明二者有共同抗原决定簇；若二条沉淀线 相互交叉，说明二者抗原完全不同。
免疫扩散实验（双向双扩散）
2010级生物技术第四组
实验目的
▪ 了解双向琼脂扩散的原理和用途。 ▪ 掌握抗体效价的测定方法。 ▪ 观察抗原、抗体在琼脂板中形成的沉淀线。
实验原理
▪ 双向双扩散简称双扩散，此法是一种定性 试验。可溶性抗原与相应的抗体在琼脂凝 胶中各自向四周扩散，如果抗原和抗体相 对应，则在二者比例适当处形成白色沉淀 线；若抗原和抗体无关就不会出现沉淀线。 此试验可以检测抗原或抗体的纯度，滴定 抗体的效价，以及用已知抗原（抗体）检 测和分析未知抗体（抗原）。
大家有疑问的，可以询问和交流
可以互相讨论下，但要小声点
9
结果判定
用梅花孔检测抗血清的效价，操作时将抗原置 于中心孔，抗血清倍比稀释后置于周围孔，以 出现沉淀带的血清最高稀释倍数为该血清的琼 扩效价。
若凝胶中抗原、抗体是特异性的，则形成抗原 抗体复合物，在两孔之间出现清晰致密的白色 沉淀线，为阳性反应。若在72小时内仍未出现 沉淀线则为阴性反应。实验时至少要做一阳性 对照。出现阳性对照与备检样品的沉淀线发生 融合，才能确定待检样品为真正阳性。
实验材料
▪ 生理盐水、1%琼脂（用于制作琼脂扩散试 验平板）
▪ 已知传染性法氏囊病毒抗原、待检血清 ▪ 打孔器、微量加样器、枪头、酒精灯、搪
Baidu Nhomakorabea瓷盒等
实验步骤
▪ 制板：称取1g琼脂粉，加入100ml生理盐水， 煮沸使之溶解。待溶解的琼脂温度降至60℃左 右时倒入平皿中，厚度为2-3mm。注意勿产生 气泡。