Chapter 5 - RNA-Seq

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RNA-seq(转录组学)的分析流程和原理

RNA-seq(转录组学)的分析流程和原理在开始详细讲解RNA测序之前，我们先来了解一下它的基本步骤：1.建库：提取RNA，富集mRNA或消除rRNA，合成cDNA和构建测序文库。

2.测序：然后在高通量平台（通常是Illumina）上进行测序（每个样本测序reads在DNA测序中，读数是对应于单个DNA片段的全部或部分的碱基对（或碱基对概率）的推断序列。

深度为10-30 Million reads。

）3.分析：先比对/拼装测序片段到转录本，通过计数、定量，样本间过滤和标准化，以进行样本组间基因/转录本统计差异分析。

大致了解这个过程之后，我们就先从建库开始了解建库的难点在于提纯出mRNA, 一般在我们抽离出的RNA中rRNA占比很大，其他还会有tRNA、microRNA等。

我们需要从抽离出的RNA中提取出mRNA，并建立cDNA文库。

这里以应用最广泛的Illumina公司的Truseq RNA的建库方法为例来进行介绍。

首先，利用高等生物的mRNA通常有poly(A)尾的（使mRNA更稳定，翻译不容易出错）特点，用带有poly(T)探针的磁珠与总RNA进行杂交，这样磁珠就和带poly(A)尾巴的mRNA结合在一起了。

接下来，就回收磁珠，把这些带poly(A)的mRNA从磁珠上洗脱下来。

再用镁离子溶液（或者超声波）进行处理，把mRNA打成小段。

然后，利用这些被打断的mRNA片段，以随机引物进行逆转录，得到第一链cDNA。

再根据第一链cDNA合成出ds-cDNA。

对cDNA在平末端进行3’端加A碱基（腺苷酸）（adapter接头上带了T碱基头，为了和adapter配对）在双链cDNA的两端加分别上Y型接头再经PCR扩增经筛选的目的基因，就得到可以上机的测序文库了。

这个建库方法对RNA的完整度有较高的要求。

也就是说，只有在mRNA大部分是完整的状态下，才能得到比较好的效果。

因为带Poly(T)的磁珠，它所吸附的是带有Poly(A)的那些序列。

rna-seq测序原理

rna-seq测序原理
RNA-seq测序是一种可以用于研究基因组学、组学、转录组学等领域的测序技术。

它可以用来研究基因的表达模式、基因的功能和蛋白质的表达，以及物种特异性的基因组变异。

RNA-seq是一种高通量的测序技术，可以同时测量数以万计的基因，并识别基因组中的差异，从而获得更多的信息。

它可以被用来研究物种之间的差异，以及物种内部基因表达的变化。

RNA-seq的原理是利用涉及多种步骤的流程，即从RNA
到DNA的反转录编码，然后经过克隆和序列测定，最后分析
和解读。

首先，将RNA制备好，然后进行反转录编码，将RNA转换成DNA，从而产生cDNA（反转录聚合酶）库。

然后，将cDNA库进行克隆，以获得可复制和测序的cDNA片段。

最后，将这些cDNA片段进行序列测定，并通过相应的
软件和算法来解读序列，最终得到RNA-seq的结果。

RNA-seq测序技术具有高通量，高灵敏度，低成本等优点，可以更有效地研究基因组学、转录组学和组学等领域，为基因组学、转录组学和组学研究提供有价值的信息。

第五章 RNA的转录Chapter 5 RNA Transcription

在有些病毒中，RNA也可以指导合成RNA。
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RNA转录的一般特点 1、转录的不对称性
（1）以双链DNA中的一条单链作为转录模板 (杂交实验所证实)
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转录的不对称性
（2）用于转录的DNA链为模板链（template strand），也称反义链（anti-sense strand）
（2）ρ因子对终止子的作用
•ρ因子与RNA结合（终止子上游的某一处，RNA的5’端） •ρ因子沿RNA从5’→3’移动（ATP水解供能）
（终止子处的较长时间的延宕给ρ因子追赶的机会） •ρ因子与 RNApol 相互作用而造成转录的终止
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终止子
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转录
复制
模板链转录(不对称转录) 两条链均复制
NTP RNA聚合酶 mRNA, tRNA, rRNA 不需要
dNTP DNA聚合酶子代双链DNA(半保留) 需要
连续
片段
A-U, G-C
A-T,G-C
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二、原核生物RNA的转录 RNA transcription in Prokaryotes
合成的RNA中，如只含一个基因的遗传信息，称为单顺反子；如含有几个基因的遗传信息，则称为多顺反子。
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3、转录的单向性
RNA转录合成时，只能向一个方向进行聚合，所依赖的模板 DNA 链的方向为 3'→5'，而RNA链的合成方向为5'→3'。
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RNA seq名词解释

RNA-seq 名词解释诺禾致源转录调控研究部2014.03.21基本概念RNA-seq：基于二代测序技术，研究特定细胞在某一功能状态下所有RNA的功能，主要包括mRNA和非编码RNA。

能够全面快速地获得某一物种特定组织或器官在某一状态下的几乎所有转录本序列信息，已广泛应用于基础研究、临床诊断和药物研发等领域。

Q20,Q30：Phred 数值大于20、30的碱基占总体碱基的百分比，其中Phred=-10log10(e).gene：具有编码蛋白质或决定某一性状作用的一段核酸序列。

intron：内含子，是真核生物细胞DNA中的间插序列。

这些序列被转录在前体RNA中，经过剪接被去除，最终不存在于成熟RNA分子中。

术语内含子也指编码相应RNA内含子的DNA中的区域。

exon：外显子，是真核生物基因的一部分，它在剪接(Splicing)后仍会被保存下来，并可在蛋白质生物合成过程中被表达为蛋白质。

外显子是最后出现在成熟RNA中的基因序列，又称表达序列。

既存在于最初的转录产物中，也存在于成熟的RNA分子中的核苷酸序列。

术语外显子也指编码相应RNA外显子的DNA中的区域。

intergenic：基因间区，指基因与基因之间的间隔序列，不属于基因结构，不直接决定氨基酸，可能通过转录后调控影响性状的区域。

UTR：Untranslated Regions, 非翻译区域。

是信使RNA（mRNA）分子两端的非编码片段。

5'-UTR从mRNA起点的甲基化鸟嘌呤核苷酸帽延伸至AUG起始密码子，3'-UTR从编码区末端的终止密码子延伸至多聚A尾巴（Poly-A）的前端。

transcript：转录本，是由一条基因通过转录形成的一种或多种可供编码蛋白质的成熟的mRNA。

一条基因通过内含子的不同剪接可构成不同的转录本。

isoform：同一个基因经可变剪切或内含子选择机制产生不同的转录本，这些不同转录本即称isoform。

现代分子生物学第三版课后习题及答案(整理版)

朱玉贤-现代分子生物学第三版课后习题及答案（整理版）现代分子生物学课后习题及答案（共10章）第一章绪论1．你对现代分子生物学的含义和包括的研究范围是怎么理解的？答：分子生物学是从分子水平研究生命本质的一门新兴边缘学科，它以核酸和蛋白质等生物大分子的结构及其在遗传信息和细胞信息传递中的作用为研究对象，是当前生命科学中发展最快并正在与其它学科广泛交叉与渗透的重要前沿领域。

狭义：偏重于核酸的分子生物学，主要研究基因或DNA的复制、转录、表达和调节控制等过程，其中也涉及与这些过程有关的蛋白质和酶的结构与功能的研究。

分子生物学的发展为人类认识生命现象带来了前所未有的机会，也为人类利用和改造生物创造了极为广阔的前景。

所谓在分子水平上研究生命的本质主要是指对遗传、生殖、生长和发育等生命基本特征的分子机理的阐明，从而为利用和改造生物奠定理论基础和提供新的手段。

这里的分子水平指的是那些携带遗传信息的核酸和在遗传信息传递及细胞内、细胞间通讯过程中发挥着重要作用的蛋白质等生物大分子。

这些生物大分子均具有较大的分子量，由简单的小分子核苷酸或氨基酸排列组合以蕴藏各种信息，并且具有复杂的空间结构以形成精确的相互作用系统，由此构成生物的多样化和生物个体精确的生长发育和代谢调节控制系统。

阐明这些复杂的结构及结构与功能的关系是分子生物学的主要任务。

2．分子生物学研究内容有哪些方面？答：分子生物学主要包含以下三部分研究内容：A.核酸的分子生物学，核酸的分子生物学研究核酸的结构及其功能。

由于核酸的主要作用是携带和传递遗传信息，因此分子遗传学（moleculargenetics）是其主要组成部分。

由于50年代以来的迅速发展，该领域已形成了比较完整的理论体系和研究技术，是目前分子生物学内容最丰富的一个领域。

研究内容包括核酸/基因组的结构、遗传信息的复制、转录与翻译，核酸存储的信息修复与突变，基因表达调控和基因工程技术的发展和应用等。

遗传信息传递的中心法则（centraldogma）是其理论体系的核心。

ncRNA(非编码RNA)的知识

ncRNA(非编码RNA)的知识z2010-07-31 10:36:54| 分类：Biology | 标签：rna |举报|字号订阅目录一、核糖核酸（RNA）二、转运RNA(tRNA)三、信使RNA(mRNA)四、核糖体RNA（rRNA）五、小核RNA（snRNA）六、RNA干扰（RNAi）七、反义RNA（atRNA）八、核仁小分子RNA（snoRNA）九、细胞质小分子RNA(scRNA)十、不均一核RNA（hnRNA）十一、干扰mRNA的互补RNA(miRNA)十二、非编码RNA（ncRNA）十三、短发夹RNA(shRNA)十四、短干扰RNA(siRNA)十五、核酸酶（RNase）十六、核糖核酸酶抑制剂（RNasin）十七、向导RNA（gRNA）一、核糖核酸（RNA）1 概述核糖核酸(RiboNucleic Acid ) ，简称RNA。

由至少几十个核糖核苷酸通过磷酸二酯键连接而成的一类核酸，因含核糖而得名。

RNA普遍存在于动物、植物、微生物及某些病毒和噬菌体内。

RNA和蛋白质生物合成有密切的关系。

在RNA 病毒和噬菌体内，RNA是遗传信息的载体。

RNA一般是单链线形分子，也有双链的如呼肠孤病毒RNA；环状单链的如类病毒RNA，1983年还发现了有支链的RNA分子。

在RNA病毒中，RNA是遗传物质，植物病毒总是含RNA。

近些年在植物中陆续发现一些比病毒还小得多的浸染性致病因子，叫做类病毒。

类病毒是不含蛋白质的闭环单链RNA分子，此外，真核细胞中还有两类RNA，即不均一核RNA （hnRNA）和小核RNA（snRNA）。

hnRNA是mRNA的前体，snRNA参与hnRNA的剪接（一种加工过程）。

自1965年酵母丙氨酸tRNA的碱基序列确定以后，RNA序列测定方法不断得到改进。

目前除多种tRNA、5SrRNA、5.8SrRNA 等较小的RNA外，尚有一些病毒RNA、mRNA及较大RNA的一级结构测定已完成，如噬菌体MS2RNA含3569个核苷酸。

转录组研究新技术RNASeq及其应用

转录组研究新技术RNASeq及其应用一、本文概述随着生物信息学和分子生物学的快速发展，转录组研究已成为解析生命活动重要机制的关键手段。

近年来，新一代测序技术（Next-Generation Sequencing，NGS）的崛起，特别是RNA测序（RNA Sequencing，RNA-Seq）技术的广泛应用，极大地推动了转录组学研究的深度和广度。

RNA-Seq技术以其高分辨率、高灵敏度和高定量的特性，在基因表达分析、非编码RNA研究、基因结构变异分析等领域展现出强大的潜力。

本文旨在全面介绍RNA-Seq技术的基本原理、实验流程、数据分析方法，以及其在生命科学各领域中的实际应用，以期为相关研究人员提供有益的参考和启示。

二、RNASeq技术概述RNA测序（RNASeq）是一种革命性的技术，极大地推动了转录组学的研究进程。

该技术基于下一代测序（Next Generation Sequencing, NGS）平台，可以对生物样本中的RNA进行全面、精确的测序和分析。

RNASeq不仅提供了转录本的序列信息，还能够揭示转录本的表达水平、剪接方式、变异情况以及基因结构等重要信息。

RNASeq的实验流程通常包括样本制备、文库构建、测序和数据分析等步骤。

在样本制备阶段，需要提取高质量的RNA，并通过一系列的处理步骤去除杂质和降解的RNA。

文库构建是RNASeq技术的核心，其目标是将RNA片段化、反转录成cDNA，并构建成适合测序的文库。

测序阶段则利用NGS平台对文库进行高通量测序，获得大量的序列数据。

数据分析是RNASeq技术的另一个关键环节。

通过对测序数据的处理和分析，可以鉴定出转录本、评估基因表达水平、发现可变剪接事件、识别基因融合以及探索非编码RNA等。

RNASeq技术还可以与表观遗传学、蛋白质组学等其他组学技术相结合，从多个层面揭示生命活动的复杂性和多样性。

RNASeq技术的应用范围非常广泛，涵盖了基础生物学研究、疾病机理探索、药物研发等多个领域。

非编码rna基因名词解释

非编码RNA（Non-Coding RNA，ncRNA）是指在细胞中转录而成的，但不编码蛋白质的RNA分子。

相对于编码蛋白质的mRNA（messenger RNA），ncRNA在过去被认为是"噪音"或"废物"，但随着研究的深入，发现它们在细胞生物学中扮演着关键的角色。

以下是一些与非编码RNA相关的术语的解释：1.miRNA（MicroRNA）：▪微小RNA，长度约为20-25个核苷酸，能够通过与mRNA结合，调控目标基因的表达。

它参与了许多生物学过程，如细胞周期调控、细胞分化和凋亡。

2.siRNA（Small Interfering RNA）：▪小干扰RNA，与miRNA相似，也是长度约为20-25个核苷酸的RNA分子，主要通过RNA干扰途径抑制目标基因的表达。

它可以用于实验室研究中的基因沉默。

3.lncRNA（Long Non-Coding RNA）：▪长非编码RNA，相对于miRNA和siRNA，lncRNA更长，一般指超过200个核苷酸。

lncRNA具有多样的功能，包括调控基因表达、染色体结构和细胞周期等。

4.piRNA（Piwi-Interacting RNA）：▪Piwi相互作用RNA，是一类长度约为24-31个核苷酸的小RNA，主要与Piwi蛋白相互作用，参与调控生殖细胞发育和维护基因组稳定性。

5.snRNA（Small Nuclear RNA）：▪小核RNA，主要存在于细胞核中，与蛋白质结合形成小核糖核蛋白颗粒，参与剪接体的形成和催化。

6.snoRNA（Small Nucleolar RNA）：▪小核仁RNA，主要存在于细胞核仁中，参与核仁的形成和核糖体RNA的修饰。

7.circRNA（Circular RNA）：▪环状RNA，是一类闭环结构的RNA分子，其结构相对稳定，具有较长的半衰期。

circRNA参与多种生物学过程，包括调控基因表达和作为miRNA的“海绵”调节miRNA的活性。

RNA-SEQ原理及应用ppt课件

ppt课件
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有关ncRNA的一些知识：
非编码RNA(ncRNA)主要包括有以下几种：转运RNA(tRNA)，核糖体RNA(rRNA)，小核RNA(snRNA)，核仁小分子RNA(snoRNA)，细胞质小分子RNA(scRNA)，不均一核RNA(hnRNA)及小RNA (microRNA,miRNA)等。
• 其中，total exon reads指映射到某个基因上的reads数，mapped reads指map到所有基因的总的reads数。
• RPKM不仅对测序深度作了归一化，而且对基因长度也作了归一化，使得不同长度的基因在不同测序深度下得到的基因表达水平估计值具有了可比性，是目前最常用的基因表达估计方法。
小结：1、了解RNA-seq及其基本原理； 2、比较基因表达不同分析方法的优缺点； 3、了解RNA-seq的应用。Fra bibliotekppt课件
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• 2、转录本变异研究
在发现序列差异方面，如融合基因鉴定、编码序列多态
性研究等，RNA-seq也具有很大的潜力。
ppt课件
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• 3、非编码区域功能研究转录组学研究的一个重要方面就是发现和分析ncRNA。
ncRNA按其功能可分为看家ncRNA和调节ncRNA。前者通常稳定表达,发挥着一系列对细胞存活至关重要的功能, 主要包括转移RNA(tRNA)、核糖体RNA(rRNA)、小核 RNA(snRNA) 及小核仁 RNA(snoRNA)等；后者主要包括长链 ncRNA(lncR NA)和以microRNA为代表的小ncRNA(small ncRNA), 在表观遗传、转录及转录后等多个层面调控基因表达。
近年来对酿酒酵母栗酒裂殖酵母拟南芥水稻小鼠人和人体白色念珠菌的转录组测定结果都显示出大量的新转录区域并且其中许多转录水平都低于已知的cdna基由于rnaseq相对于传统的测序方法具有明显的优势所以被广泛运用到差异基因表达分析新转录本发现可变剪切研究等方面

ViralSEQ Lentivirus Physical Titer Kit说明书

ViralSEQ™ Lentivirus Physical Titer KitCatalog Numbers A52597 and A52598Pub. No. MAN0026127 Rev. A.0Note: For safety and biohazard guidelines, see the “Safety” appendix in the ViralSEQ™ Lentivirus Titer Kits User Guide(Pub. No. MAN0026126). Read the Safety Data Sheets (SDSs) and follow the handling instructions. Wear appropriate protective eyewear, clothing, and gloves.Product descriptionThe Applied Biosystems™ ViralSEQ™ Lentivirus Physical Titer Kit is a TaqMan™-based RT-qPCR kit. The kit measures viral count based on highly sensitive viral RNA quantitation from the supernatants of cell-based, bioproduction systems. Viral titers of 104 to 1011 viral particles (VP) per mL can be quantitated using a standard curve generated from the synthetic RNA control included with the kit. Lentivirus quantitation by RT-qPCR is accurate, sensitive, and reproducible.The ViralSEQ™ Lentivirus Physical Titer Kit is compatible with the PrepSEQ™ Nucleic Acid Sample Preparation Kit (Cat. A50485), which offers both a manual and automated sample preparation workflow. For real‑time PCR, the ViralSEQ™ Lentivirus Physical Titer Kit has been validated on the Applied Biosystems™ 7500 Fast Real-Time PCR System and the Applied Biosystems™ QuantStudio™ 5 Real‑Time PCR System. Data analysis is streamlined using AccuSEQ™ Real‑Time PCR Software that provides accurate quantitation and security, audit, and e-signature capabilities to help enable 21 CFR Pt 11 compliance.For more information about reagent use, see the ViralSEQ™ Lentivirus Titer Kits User Guide (Pub. No. MAN0026126).Treat samples with DNase I, RNase‑free (1 U/µL)DNase I, RNase‑free (1 U/µL) treatment is used to digest double-stranded DNA.Thaw all reagents on ice. Invert the DNase I, RNase‑free (1 U/µL) several times to mix, then centrifuge briefly. All other reagents should be vortexed, then centrifuged briefly before use.1.Set up the DNase I, RNase‑free (1 U/µL) reactions in a MicroAmp™ Optical 96-Well Reaction Plate (0.2 mL).[1]Mix gently by pipetting 3-5 times when adding.2.Mix the reactions by gently pipetting up and down 5 times, then seal the reaction plate with MicroAmp™ Clear Adhesive Film.3.Centrifuge the plate at 1,000 x g for 2 minutes.4.Load the reactions onto the VeritiPro™ 96-well Thermal Cycler, then start the DNase I treatment.Set cover temperature: 105℃Set reaction volume: 18 µL[1]Do not hold for more than 5 minutes. Proceed immediately to DNase I inactivation.5.Centrifuge the plate at 1,000 x g for 2 minutes.CAUTION! The plate is in contact with the heated lid. Remove carefully.6.Gently remove the MicroAmp™ Clear Adhesive Film, then discard.IMPORTANT! Do not touch wells when removing the MicroAmp™ Clear Adhesive Film. Contamination can lead to inaccurate results.7.Add 2 µL of 50mM EDTA to each reaction well. Mix by gently pipetting 5 times with a P10/P20 pipettor set to 10 µL.8.Seal the reaction plate with MicroAmp™ Clear Adhesive Film, then centrifuge the plate at 1,000 x g for 2 minutes.9.Load the reactions onto the VeritiPro™ 96-well Thermal Cycler, then start the DNase I inactivation.Set cover temperature: 105℃Set reaction volume: 20 µL[1]Do not hold for more than 5 minutes.10.Centrifuge the plate at 1,000 x g for 2 minutes.CAUTION! The plate is in contact with the heated lid. Remove carefully.IMPORTANT! Do not vortex.Place the plate on ice until use.Prepare the serial dilutionsThaw the Physical Titer RNA Control (2 ✕1010 copies/µL) on ice. Vortex at medium speed for 5 seconds, briefly centrifuge, then place on ice until use.bel nonstick 1.5‑mL microfuge tubes: NTC, SD1, SD2, SD3, SD4, SD5, and SD6 [used for limit of detection (LOD)].2.Add 35 µL of RNA Dilution Buffer (RDB) to the NTC (no template control) tube. Place the tube on ice.3.Perform the serial dilutions.When dispensing RNA, pipette up and down gently. After each transfer, vortex for 7 seconds, then centrifuge briefly.Table 1 Standard curve dilutions (ViralSEQ™ Lentivirus Physical Titer Kit)Store the standard curve dilution tubes at 4°C or on ice. Use the dilutions within 6 hours for RT-qPCR.Prepare the kit reagents and premix solutionThaw all kit reagents on ice. Vortex the reagents for 5 seconds, briefly centrifuge, then place the reagents on ice until use.bel a microcentrifuge tube for the Premix Solution.2.Prepare the Premix Solution according to the following tables.IMPORTANT! Use a separate pipette tip for each component.Table 2 Premix Solution[1]Includes 10% excess to compensate for pipetting loss.3.Vortex the Premix Solution for 10 seconds to mix, then briefly centrifuge.Store the Premix Solution at 4°C or on ice until use.Prepare the PCR reactionsPlace the plate containing DNase I-treated samples on a MicroAmp™ 96-Well Base, then gently remove the MicroAmp™ Clear Adhesive Film. Gently pipette up and down 3 times to mix the samples.1.Dispense the following into the appropriate wells of a MicroAmp™ Fast Optical 96-Well Reaction Plate, 0.1 mL, gently pipetting at thebottom of the well.Figure 1 Recommended plate layout2.Seal the plate with MicroAmp ™Optical Adhesive Film.3.Vortex the reaction plate for 10 seconds, then centrifuge at 1,000 x g for 2 minutes.Note: Ensure there are no bubbles in the reaction wells. If present, tap the well gently to remove bubbles, then re-centrifuge.Proceed immediately to “Start the run (QuantStudio ™ 5 Real ‑Time PCR Instrument)”.Create a ViralSEQ ™ templateCreate a new template in the (Home) screen of the AccuSEQ ™Real ‑Time PCR Software v3.1.1.ClickCreate New on the home screen.Create New ExperimentpaneFactory default/Admin Defined Templates —List of existing default or Admin Defined templates. These templates can beused as templates for new experiments.My Templates —List of templates available to the user that is signed in. These templates can be used as templates for newexperiments.Create New —Used to create an experiment or template with nopre-existing settings.Create My Template —Used to create a new template (stored locally in My Templates).Create Admin Defined Template —Used to create a new template (Administrator only).2.Select Create My Template or Create Admin Defined Template .3.Edit the Experiment Properties as required.a.In the Template Name field, modify the template name. For example, LV Titer template.b.(Optional ) Enter information in the Comments field.c.In the Setup tab, select:•Experiment Type —Quantitation-Standard Curve •Chemistry —TaqMan ® Reagents•Ramp Speed —Standard-2hrs •Block Type —96-Well 0.1mL Blockd.(Optional ) Select Is Locked to lock the template. If locked, users are unable to edit the template.4.ClickAnalysis settings to change the default C t Settings and Flag Settings.a.In the C t Settings tab, click Edit Default Settings .b.Deselect Automatic Threshold , then enter 0.200.c.Ensure that Automatic Baseline is selected.d.Click Save Changes .e.Deselect Default Settings , then click Applyto save any changes before closing the window.2C tSettingsFlag SettingsEdit Default SettingsbuttonDefault Settingscheckbox Apply buttonf.In the Flag Settings tab, deselect the following flags.•CQCONF —Low Cq confidence •EXPFAIL —Exponential algorithm failed •NOAMP —No amplification •NOSIGNAL —No signal in wellNote: Use the scrollbar on the right to scroll down the list of flags.g.Click Apply to save any changes before closing the window.5.Click Next .Template name cannot be changed after this step.The qPCR Method screen is displayed.Edit the run method and optical filter selectionThis section provides general procedures to edit the run method and optical filter selection in the qPCR Method. To edit the default run method, see the AccuSEQ™ Real‑Time PCR Software v3.1 User Guide (Pub. No. 100094287).1.Set the reaction volume to 25 µL.2.Edit Step 1 of the Hold Stage to 45℃ for 30 minutes.3.Set Step 2 of the Hold Stage to 95℃ for 10 minutes.4.Set Step 1 of the PCR Stage to 95℃ for 15 seconds.5.Edit Step 2 of the PCR Stage to 60℃ for 45 seconds.6.Set the cycle number to 40.7.Ensure that Data Collection occurs after Step 2.123Figure 2 Lentivirus Physical Titer Run MethodReaction volume- set to 25µLStageCycle number- set to 40 cycles8.(Optional) Click (Optical Filter Settings) to view the default filter settings.•The default optical filter selection is suitable for the ViralSEQ™ Lentivirus Physical Titer Kit.•The ViralSEQ™ Lentivirus Physical Titer Kit requires the QuantStudio™ 5 System to be calibrated for FAM™, VIC™, and ROX™.•For more information about system dyes and their calibration and optical filter selection, see QuantStudio™ 3 and 5 Real‑Time PCR Systems Installation, Use, and Maintenance Guide (Pub. No. MAN0010407).9.Click Next.Assign plate and well attributesNote: This section provides general procedures to set up the plate.For specific instructions for each assay type, see the corresponding chapter in this guide. Do not change Targets for default assay templates.TargetsSamplesPlate setup toolbarSelect Item to highlight (Sample, Target, or Task).Select Item. For example, Sample 1. Sample 1 replicates arehighlighted.Define& setup Standard(View Legend)(Print Preview)View (Grid View or Table View)1.In Plate Setup screen, click or click‑drag to select plate wells in the (Grid View) of the plate.2.Assign the well attributes for the selected wells. Each well should have a Sample Name under Samples, as well as the appropriateTargets under Targets. Reporters should be FAM™ dye for Lentivirus Physical Titer, and VIC™ dye for internal positive control (IPC).a.To add new Samples or Targets, click Add in the appropriate column on the left of the screen, then edit the new Name andother properties as required. The new sample or target is then selectable within the wells of the plate.b.For each sample (e.g. DNase-treated lentivirus sample, standard curve dilution, or NTC), two targets should be included.•Select the FAM™ dye reporter for Lentivirus Physical Titer detection.•Select the VIC™ dye for IPC detection.c.Select NFQ-MGB as the quencher for both targets.d.For standard curve dilution samples (SD1 to SD5), the Task for Lentivirus Physical Titer target should be indicated as “S” forStandard, with the appropriate copy number written under Quantity. For instance, the quantity for SD1 is 1E9 copies. Change the Task by clicking on the field and using the drop-down menu. Copy numbers can be indicated using scientific notation (e.g.“1E9”) and the program will convert it to numerical format.e.For DNase-treated samples and SD6, set the Task for Lentivirus Physical Titer target to U for Unknown.f.For NTC wells, set the Task for Lentivirus Physical Titer target to N for NTC.g.For IPC wells, set the Task for Lentivirus Physical Titer target to U for Unknown.h.To change sample names, click the name in the Name column, then type the new name. To change Reporters and Quenchers,click the dye, then select from the dropdown list.When a Sample or Targetname are edited, two entries are added to the Audit trail (one for Delete, and another for Create).23AddbuttonCheckbox—Select Targets and Samples to go in the selectedwell.Textbox—Click the name to edit.Scrollbar—Use to scroll to additional properties.•Use the plate setup toolbar (above the plate) to make edits to the plate.–Click View to show/hide the Sample Name, Sample Color, or Target from the view.•To add consecutive samples (with the same Target ), select a well, then click ‑drag the dark blue box to the right.3.(Optional ) Double ‑click a well to enter comments for the selected well.4.Select ROX ™dye from the Passive Reference drop-down list (bottom left of screen).5.Click Save to save the template.This template can then be used to create experiments.Start the run (QuantStudio ™ 5 Real ‑Time PCR Instrument)Ensure that the plate is loaded in the QuantStudio ™5 Real ‑Time PCR Instrument.™A message stating Run has been started successfully is displayed when the run has started.Review the resultsAfter the qPCR run is finished, use the following general procedure to analyze the results. For more detailed instructions see theAccuSEQ ™Real ‑Time PCR Software v3.1 User Guide (Pub. No. 100094287).1.In the AccuSEQ ™Real ‑Time PCR Software, open your experiment, then navigate to the Result tab.ResulttabAnalysis SettingsPlot horizontal scrollbar Analyze button2.In the Result Analysis tab, select individual targets, then review the Amplification Curve plots for amplification profiles in thecontrols, samples, and the standard curve. Ensure that threshold is set to 0.200 with an automatic baseline.3.In the Result Analysis tab, review the QC Summary for any flags in wells.4.In the Result Analysis tab, review the Standard Curve plot. Verify the values for the Slope, Y ‑intercept, R 2, and Efficiency are withinacceptable limits.Note: The Standard Curve efficiency should be between 90-110% and the R 2>0.99. If these criteria are not met, up to two points,not in the same triplicate, can be removed from the standard curve data, and the analysis repeated.5.In Table View, ensure that C t values are within the standard curve range.•Samples with C t values that exceed the upper limit of quantitation (109 copies) of the standard curve should be diluted and re-run.•Samples with C t values that exceed the lower limit of detection (LoD of 10 copies) and IPC shows no signs of PCR inhibition,suggests the absence of lentivirus.6.(Optional ) Outliers can be excluded from the results. To exclude, select the well, then click Omit/Include , then reanalyze by clickingAnalyze .7.(Optional ) Select File 4Print Report to generate a hard copy of the experiment, or click Print Preview to view and save the report asa PDF or HTML file.8.Export the results.a.Navigate to the Report tab.b.Check all boxes under Contents .c.Select Export Data in One File .d.Select the XLS format, then click Export .Calculate the titer (VP/mL)1.Download the Physical Titer Calculation Tool .a.Go to .b.Search for the ViralSEQ ™Lentivirus Physical Titer Kit.c.Download the tool from the Documents section.2.Open the tool, then follow the instructions in the tool to calculate the titer.Calculate lentivirus titers from qPCR dataTo determine the number of lentivirus RNA copies per mL in the original sample, the copy numbers obtained from the qPCR must be multiplied by the dilution factor of the sample during extraction and DNase I treatment. Since there are 2 copies of RNA/target per lentivirus particle, the number of viral particles per mL (VP/mL) is 0.5x the number of lentivirus RNA copies.Viral particles per mL =qPCR copies x sample dilution factor x 0.5Volume of sample used (mL)For help in determining the qPCR copy numbers, see the QuantStudio ™Design and Analysis Desktop Software User Guide (Pub. No. MAN0010408).For example, if the following parameters were used,•10 µL of lentivirus culture was extracted with the KingFisher ™Flex Purification System with 96 Deep-Well Head and eluted in 200 µL •10 µL of this eluate (20x dilution) was treated with DNase I, RNase ‑free (1 U/µL) in a total volume of 20 µL.• 5 µL of the DNase-treated sample (4x dilution) was used for the qPCR reaction.Lentivirus sample10 μL Sample Extraction Elute: 200 μL DNaseI Treat Total: 20 μL reaction RT-qPCRTotal: 25 μL reactionUse 10 μL (1:20 dilution)Use 5 μL (1:4 dilution)then, the calculation would be:Viral particles per mL =qPCR copies x (20x4) x 0.50.01 (mL)Note: qPCR can only determine the number of physical particles in a virus culture. To determine the numbers of infectious units,cell-based transduction experiments must be carried out. The titers of physical particles are often higher than infectious titers by 10-1000fold, depending on the purity of the lentivirus preparation and the levels of infectious particles within the culture.Limited product warrantyLife Technologies Corporation and/or its affiliate(s) warrant their products as set forth in the Life Technologies' General Terms and Conditions of Sale at /us/en/home/global/terms-and-conditions.html . If you have any questions, please contact Life Technologies at /support .Life Technologies Ltd | 7 Kingsland Grange | Woolston, Warrington WA1 4SR | United KingdomThe information in this guide is subject to change without notice.DISCLAIMER : TO THE EXTENT ALLOWED BY LAW, THERMO FISHER SCIENTIFIC INC. AND/OR ITS AFFILIATE(S) WILL NOT BE LIABLE FOR SPECIAL, INCIDENTAL, INDIRECT,PUNITIVE, MULTIPLE, OR CONSEQUENTIAL DAMAGES IN CONNECTION WITH OR ARISING FROM THIS DOCUMENT, INCLUDING YOUR USE OF IT.Important Licensing Information : These products may be covered by one or more Limited Use Label Licenses. By use of these products, you accept the terms and conditions of all applicable Limited Use Label Licenses.©2022 Thermo Fisher Scientific Inc. All rights reserved. All trademarks are the property of Thermo Fisher Scientific and its subsidiaries unless otherwise specified. Vortex-Genie is a trademark of Scientific Industries. Windows and Excel are trademarks of Microsoft Corporation. TaqMan is a registered trademark of Roche Molecular Systems, Inc., used under permission and license./support | /askaquestion 23 August 2022。

神经科学专业介绍

与计算机科学的交叉
计算神经科学是神经科学与计算机科学的交叉学科，运用计算机模拟和算法研究神经网络和认知过程。
02
神经生物学基础
Chapter
神经元结构与功能
接收来自其他神经元的信号输入，将信号整合并传递给轴突。
神经元之间或神经元与效应细胞之间的连接点，实现神经信号的跨细胞传递。
神经元胞体树突轴突突触
经递质和受体组合可以产生不同的生理效应。
03
认知神经科学
Chapter
感知觉处理机制
感知觉系统的神经基础
研究视觉、听觉、触觉等感知觉系统的神经结构和功能，以及它们在信息处理中的作用。
感知觉与认知的交互作用
研究感知觉信息与认知过程之间的相互作用，以及它们在人类行为和意识中的体现。
感知觉信息的加工过程
探讨感知觉信息在大脑中的加工过程，包括信息的接收、编码、整合和识别等阶段。
Hale Waihona Puke 学习与记忆过程学习的神经机制
研究学习过程中的神经活动和结构变化，以及这些变化如何影响行为表现。
记忆的类型与神经基础
探讨不同类型记忆（如工作记忆、短期记忆、长期记忆）的神经基础和相互转化机制。
学习与记忆的调控因素
分析影响学习与记忆过程的内外部因素，如注意力、情绪、药物等。
与其他学科的交叉关系
与生物学的交叉
神经科学与生物学密切相关，生物学为神经科学提供了研究生命现象的基础理论和方法。
与心理学的交叉
神经心理学是神经科学与心理学的交叉学科，研究心理活动的神经基础和机制。
01 02 03 04
与医学的交叉
神经科学与医学的交叉主要体现在神经医学领域，研究神经系统疾病的诊断、治疗和预防。

RNA-seq数据分析指南

RNA-seq数据分析指南五月份看了一篇2016年的RNA-Seq文献综述，那篇文献特别长，花了三四天时间才看完。

当时为了做组会文献报告做了一些许总结，以ppt的形式呈现出来。

内容前言•各位同学/老师，大家好，现在由我给大家讲讲我的文献阅读报告！•A survey of best practices for RNA-seq data analysis ,我把它叫做RNA-seq数据分析指南。

这篇文章是由佛罗里达大学等单位的研究人员在1月26日发表在Genome Biology上的，该期刊的影响因子有10.8分。

这是这篇文章的通讯作者，应该挺靠谱的。

•新一代测序技术在爆炸式发展的同时，也衍生出许多其他技术创新。

RNA-Seq就是其中之一，这项技术使我们对细胞发育及其调控机制的理解，达到了前所未有的深度和广度。

RNA-seq可以获得相当惊人的数据量，而这恰恰是一柄双刃剑。

丰富的数据量蕴含着大量的宝贵信息，但这样的数据需要复杂的生物信息学分析，才能从中提取到有意义的结果。

•正因如此，数据分析可以说是RNA-seq的重中之重。

RNA-seq 有非常广泛的应用，但没有哪个分析软件是万能的。

科学家们一般会根据自己的研究对象和研究目标，采用不同的数据分析策略。

现在人们已经发表了大量的RNA-seq和数据分析方案，对于刚入门的新手来说难免有些无所适从。

这篇文章概述了RNA-seq生物信息学分析的现行标准和现有资源，为人们提供了一份RNA-seq数据分析指南，可以作为开展RNA-seq研究的宝贵参考资料。

•这份指南覆盖了RNA-seq数据分析的所有主要步骤，比如质量控制、读段比对、基因和转录本定量、差异性基因表达、功能分析、基因融合检测、eQTL图谱分析等等。

研究人员绘制的RNA-seq分析通用路线图(标准Illumina测序)，将主要分析步骤分为前期分析、核心分析和高级分析三类。

前期预处理包括实验设计、测序设计和质量控制。

RNA的种类及其作用解析

反式翻译是细菌体内一种修复翻译水平上受阻的遗传信息表达过程的机制。
端粒酶RNA
端粒酶是一种逆转录酶，是染色体端粒的RNA序列。
功能: 端粒酶是真核生物端粒复制的模板，它可以使用其部分RNA作为模板来合成端粒重复单元。在大多数真核生物中，染色体末端DNA的逐步丢失会被端粒酶所抑制。在具有端粒酶活性的细胞内，它的任务是作为反转录的模板然后加在端粒的末端以解决染色体因复制而变短的问题。这种酶在大多数细胞里是没有活性的，但在某些肿瘤细胞，转化细胞，干细胞以及生殖细胞里活性较高。
RNA的种类及其作用
——遗传学
1.RNA的种类 2.各类RNA的作用
RNA的常见种类
1.核糖体RNA（rRNA） 2.转运RNA（tRNA） 3.信使RNA （mRNA）
RNA的其他种类
1.不均一核RNA（hnRNA） 2.小核RNA（snRNA） 3.核仁小RNA（snoRNA） 4.小胞质RNA（scRNA/7s-RNA) 5.microRNA 6.转移-信使RNA（tmRNA） 7.端粒酶RNA 8.反义RNA ……各类RNA的作用来自核糖体RNA（rRNA）
1. rRNA是核糖体的组成成分 rRNA一般与核糖体蛋白质结合在一起, 形成核糖体（ribosome) 如果把rRNA从核糖体上除掉, 核糖体的结构就会发生塌陷。
2. 定位（起始翻译） 16 S的rRNA3’端有一段核苷酸序列与mRNA的前导序列是互补的, 这有助于mRNA与核糖体的结合, 进而起始翻译。
体经过Dicer酶加工后生成。不同于siRNA（双链），但是和siRNA
密切相关。
功能: microRNA通过与相应的蛋白结合，形成一个“RNA诱导的转录沉默复合体”。该复合体主要有4个作用: 1.降解靶mRNA；2. 抑制mRNA的翻译；3.在细胞核内募集组蛋白脱乙酰化酶等因子，沉默DNA的表达；4.扩增相应的microRNA。

基因突变对蛋白质结构的影响

基因突变对蛋白质结构的影响蛋白质是生命的重要组成部分。

从传递信息到参与代谢反应，它们在生物体内发挥着无数的重要功能。

然而，如果一个蛋白质的结构发生变化，它可能会失去它的功能。

基因突变是一种常见的引起蛋白质结构变化的原因，今天我们将讨论基因突变如何影响蛋白质结构。

基因突变是指基因序列发生了变化。

这种变化可以是由错误的复制或移动DNA碱基对引起的，也可以是来自辐射或化学物质的损伤。

这些变化可能会影响蛋白质的结构和功能。

在这里，我们将关注两种主要的基因突变：点突变和插入/删除。

点突变是指单个DNA碱基发生了变化。

这种变化可能会导致从一种氨基酸到另一种氨基酸的变化，或者不改变氨基酸的种类。

然而，这仍可能会影响蛋白质结构和功能。

例如，如果一个亲疏水性残基被一个亲水性残基替换，那么蛋白质可能会失去它原本的折叠结构。

这种情况在出现疾病的情况下尤其常见。

插入/删除是指DNA序列中的一个或多个碱基被添加或删除。

这种突变可能会引起相当大的影响，因为它可以改变蛋白质的框架。

例如，如果一个三元序列被插入到DNA中，那么可能会导致一个氨基酸序列的完全改变。

这种情况经常出现在带有动态扩张区域的疾病中，如亨廷顿病和肌营养不良。

这些疾病都是由于一系列的三元重复导致的，这会导致插入/删除的发生。

然而，基因突变不一定会引起蛋白质的结构变化。

这取决于不同的氨基酸突变和它们在蛋白质中的位置。

例如，有些氨基酸是非常重要的，因为它们参与到维持蛋白质结构的关键积累。

如果它们被替换，那么蛋白质的稳定性和可溶性都可能会受到影响。

但其他氨基酸的变化则可能较小，可能只会影响蛋白质的功能。

虽然基因突变本身不一定会引起重大的变化，但蛋白质结构的变化仍可能导致一系列的问题。

这些问题的严重性取决于蛋白质的功能。

对于有些蛋白质来说，即使只是轻微的结构变化，也会导致功能的大大降低或完全失去。

这可能会影响许多生命体系的正常运作。

因此，基因突变可能对生物体的健康产生消极影响。

转录rna前体结构

转录rna前体结构
转录RNA前体又称为mRNA前体，是一种位于细胞核内的分子结构。

它是一条由基因转录而来的RNA链，包含了基因序列的大部分或
全部。

转录RNA前体具有一些特殊结构，例如5'帽结构、多个内含子以及3'非翻译区。

5'帽结构是转录RNA前体的起始部分，在mRNA成熟过程中起到重要的调控作用。

内含子则是转录RNA前体中的非编码序列，需要通过剪接（splicing）的机制移除才能形成成熟的mRNA。

3'非翻
译区则位于转录RNA前体的末端，含有与mRNA稳定性和转运相关的调
控序列。

转录RNA前体在转录作用完成后，需要通过一系列的加工和修饰
过程转变为成熟的mRNA分子。

这些加工包括内含子的剪接、对5'帽结构的甲基化、3'末端的聚腺苷酸化等。

转录RNA前体的转录和加工过程在细胞核内进行，最终产生成熟
的mRNA分子。

这些mRNA分子随后会通过核孔复合物进入细胞质，参
与蛋白质的合成过程。

总之，转录RNA前体具有特定的结构，经过一系列的加工和修饰
过程，最终转变为成熟的mRNA分子。

这一过程在细胞核内进行，是基
因表达过程中的重要环节。

小鼠的rps27a基因

小鼠的Rps27a基因是一种管家基因，它编码核糖体40S亚基的一个组成部分。

该基因在小鼠体内存在两种蛋白质编码转录本，这两个转录本具有不同的5'UTR（分别命名为S27a-44和S27a-45），但具有相同的3'UTR（命名为S27a）。

这些转录本在细胞内的翻译过程中发挥着重要的作用。

在小鼠成纤维细胞中，Rps27a基因的mRNA分子显示出最高的翻译能力。

这意味着该基因所编码的蛋白质在细胞内以高效率被合成。

此外，研究还发现，在S27a-45 5'UTR和S27a-44 5'UTR序列中存在抑制mRNA 翻译的寡嘧啶TOP基序。

当这些TOP基序被移除时，可以产生两个新的UTRs（S27a-45' 5'UTR和S27a-44' 5'UTR），这可能会影响mRNA的翻译效率。

总的来说，小鼠的Rps27a基因在细胞内翻译过程中扮演着重要的角色，其高效的翻译能力对于维持细胞内蛋白质合成的稳态至关重要。

hnrna snrna名词解释

1. hnRNA (前体mRNA，Heterogeneous Nuclear RNA):
-解释：hnRNA 是指在真核细胞细胞核中合成的、尚未经过剪接和修饰的原始mRNA 分子。

在转录过程中，hnRNA 是由DNA 模板合成的RNA 初级转录产物。

它包含了外显子（exon）和内含子（intron），与成熟的mRNA 相比，hnRNA 包含了更多的非编码序列。

-作用：hnRNA 是mRNA 的前体，需要经过剪接和修饰的过程，最终形成成熟的mRNA，以被翻译为蛋白质。

2. snRNA (小核RNA，Small Nuclear RNA):
-解释：snRNA 是一类小型的核酸分子，主要存在于真核细胞的细胞核内。

它们与蛋白质结合，形成小核糖核蛋白颗粒（snRNP，Small Nuclear Ribonucleoprotein），参与前体mRNA 的剪接、修饰等核内过程。

-作用：snRNA 通过与蛋白质结合形成snRNP，参与剪接体系的组装和催化剪接反应。

它们在RNA 的剪接和修饰中发挥关键作用，确保mRNA 的正确剪接和成熟。

这两类核酸分子在基因表达调控中发挥着重要作用。

hnRNA 是mRNA 的前体，包含了编码蛋白质的信息，但还需经过剪接和修饰形成成熟的mRNA。

snRNA 则是在剪接体系中发挥调控功能的一部分，保证mRNA 在剪接过程中的准确性和正常发育。