G6PD缺乏高铁血红蛋白法检查分子生物学设计性实验

高铁血红蛋白还原实验 ——G6PD缺乏症检查
4.孵育后混匀，取血0.1ml，加PH 7.4 磷酸盐缓冲 液10ml，混匀，2min后在波长635nm处测定吸光 度（设为SA） 5.空白对照，用未加亚硝酸纳葡萄糖的血液，同 样孵育后取0.1ml,加PH 7.4 磷酸盐缓冲液10ml， 2min后测定吸光度为B。然后加入亚硝酸钠葡萄 糖混合溶液1滴，混匀，5min后再测其吸光度为 ST，此为高铁血红蛋白对照
红细胞减少
大量血红蛋白释放
形成酱油 样尿
胆红素增加
实验检查结果： 红细胞大量破坏 单核吞噬细胞系 统产生胆红素增加 超过肝摄取、转化和 排泄的能力 未结合胆红素浓度增加 （血浆胆红素、未结合胆红素含量增高、结合 胆红素浓度改变不大） 当超过 34.2mmol/L时出现显性黄疸 肝对胆红素的摄取、转化和排泄增多 进入胆道系统肠肝循环 尿胆原和尿胆 素增多
高铁血红蛋白还原实验 ——G6PD缺乏症检查 计算：
高铁血红蛋白还原率（%） = [1 – (SA-B)/(ST-B)]×100%
式中：SA-B、ST-B分别为还原后和还原前高铁 血红蛋白的吸光度； SA-B/ST-B为还原后剩 余高铁血红蛋白的比值。
高铁血红蛋白还原实验 ——G6PD缺乏症检查
3. 从生化代谢解释患儿的临床表现和实验检查 结果。 实验检查结果： 红细胞和血红蛋白含量减少 原因：G6PD缺陷 不能通过磷酸戊糖途径 提供足够的NADPH以维持还原型谷胱甘肽 红细胞脆性增加，易于破裂 红细胞在遇到 蚕豆中的某些强氧化剂时，细胞膜破坏 红细胞减少
实验检查结果： 形成原尿后， 超过肾小管和 集合管的重吸 收作用 尿蛋白量 增加
5. 患者瘦小与该病症是否有关，为什么？ 无关，因为蚕豆病不属于慢性消 耗性疾病
1. 根据上述患儿的临床表现和实验室检 查，初步判断患儿是何种疾病？ 蚕豆病起病急遽，大多在进食新鲜蚕豆后 1～2天内发
生溶血，最短者只有2小时，最长者可相隔9天。如因 吸入花粉而发病者，症状可在数分钟内出现。潜伏期 的长短与症状的轻重无关。 本病的贫血程度和症 状大多很严重。症状有全身不适、疲倦乏力、畏寒、 发热、头晕、头痛、厌食、恶心、呕吐、腹痛等。巩 膜轻度黄染，尿色如浓红茶或甚至如酱油。一般病例 症状持续2～6天。最重者出现面色极度苍白，全身衰 竭，脉搏微弱而速，血压下降，神志迟钝或烦躁不安， 少尿或闭尿等急性循环衰竭和急性肾功能衰竭的表现。
实验检查结果： 潜血：潜在的出血，也就是由肉眼下或是显微 镜下无法观察到有红血球的存在，但如果用试 纸检验时却有反应，当红血球被破坏时，其内 含的血红素会释放出来，所以，尿液试棒才能 侦测到血红素的反应。 尿液下没有见红细胞可能是因为红细胞本身的 寿命已到，也可能是喝了大量水，尿液稀薄红 血球破裂。
2.请设计实验进一步明确诊断 要求：实验名称，实验方法，主要 试剂和仪器，实验操作流程及注意事项， 结果如何分析。
G6PD缺乏症的检查方法：

高铁血红蛋白还原实验 高铁血红蛋白还原实验 变性珠蛋白小体生成实验（可做为G6PD缺乏的筛选实验） G6PD活性测定 G6PD荧光斑点实验（特异性较好、方法简单） 抗坏血酸-氰化物实验

PCR/SSCP片段结合寡核苷酸探针斑点杂交技术 PCR/SSCP分析法 DNA序列分析 探针技术
G6PD 基因定位于 X 染色体长臂 2 区 8 带ⅶ因子及 18Kb，中国人 红-绿色盲基因 之间（Xq28）,长 18Kb，中国人 G6PD 基因 绿色盲基因之间（Xq28） Xq28 目 前依法显得突变种类很多，但能引起题目 中所诉临床症状 G1376Ｔ和 G6PD 的突 变点可能是 G1376Ｔ和 G1388A 点突变 G6PD 基因含 （ 13 个外显子和 12 个内 含子，编码 515 个氨基酸。G6PD 个氨基 酸。G6PD cDNA1388、 cDNA1388、 cDNA1376 同属第 12 外显子，相距仅 12 个核 突变结果使 459 和 463 位的精氨酸 分别被亮氨酸和组 苷酸， 氨酸替代）
注意事项： 1. 对于贫血患者应将红细胞比容调整在0.35~0.40 （35%~40%） 2. 草酸盐抗凝剂具有还原性，不宜使用。 3. 试剂的比例要准确，否则易产生假阳性或假阴性。 4. 标本不应有凝块或溶血，以免影响测定结果。
高铁血红蛋白还原实验 ——G6PD缺乏症检查
结果分析： 高铁血红蛋白还原实验（MHb）正常人还原率>75%(比色 法） 蚕豆病患者MHb还原率31%~74%（杂合子遗传者） 还原率<30%（纯合子型） 患者如存在高铁血红蛋白（HbH）、不稳定血红 蛋白、高脂血症、巨球蛋白血症等均可造成假阳 性。NADPH-MHb还原酶缺乏（罕见）也可出现 阳性结果
临床表现：
面色苍白 红细胞大量破坏 血压降低 心率、脉搏加 快 胃肠血流量 不足
溶血性贫血
白细胞、巨噬细 胞、血小板增多
血红蛋白量减 少
胃肠道平滑 肌痉挛收缩
炎症反应 体温升高
Baidu Nhomakorabea
O2供应不足
呼吸急促、微弱
恶心、呕吐
4. 要想探讨该病发生的分子基础，可以用哪些 技术检测什么目的基因？
可使用技术：
扩增G6PD基因第10、11、12、13外显子639bpDNA片 段结合寡核苷酸探针斑点杂交技术


硝基四氮唑蓝定量法
G6PD比值法 … …
高铁血红蛋白还原实验 ——G6PD缺乏症检查
实验名称：高铁血红蛋白还原实验
——G6PD缺乏症检查
高铁血红蛋白还原实验 ——G6PD缺乏症检查
实验原理：
在有足量的还原辅酶Ⅱ（NADPH)存在下，反应 液中的高铁血红蛋白能被高铁血红蛋白还原酶即细胞 色素b5（黄素酶）还原成亚铁血红蛋白。在体外，这 一还原过程还需要递氢体亚甲蓝的参与。但红细胞内 葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6PD）含量正常时，由磷酸 戊糖代谢途径生成NADPH的数量足以完成上述还原 反应。当红细胞内G6PD含量不足或缺乏时，高铁血 红蛋白还原速度减慢，甚至不能还原。高铁血红蛋白 呈褐色，在波长635nm处有吸收峰，可用分光光度计 加以测定。
分 子 生 物 学 设 计 性 实 验
——G6PD 缺 乏 高 铁 血 红 蛋 白 法 检 查 主讲：
组员：
案例：
患儿，男性，3岁，因面色苍白伴血尿1天入院。1天 前食用新鲜蚕豆后，今日出现恶心、呕吐、排尿呈酱油 样色，面色苍白。据家长反映，患者的姐姐也曾发生过 类似情况。 体格检查：体温38℃，脉搏150次/分，呼吸40次/分， 血压80/60mmHg，呼吸急促，神清，萎靡，面色苍白， 皮肤及巩膜黄染，体型较同龄人瘦小。心、肺未及异常， 肝、脾未触及，双肾区无叩击痛，神经系统检查未及异 常。实验室检查：红细胞 1.98×1012/L，血红蛋白 53g/L，血清总胆红素85.5µmol/L，结合胆红素 13.7µmol/L，未结合胆红素71.8µmol/L，尿蛋白（++）， 潜血(+)，尿胆红素(－)，尿胆素原(+)， 尿液镜下 未见红细胞。
高铁血红蛋白还原实验 ——G6PD缺乏症检查
操作： 1.在试管中加入葡萄糖20mg，109mmol/L枸橼酸钠溶 液0.2ml,静脉血1.8ml,混匀。
2.离心15min，取出，调整血细胞与血浆的比例为 1： 1 后混匀。
3.取上述抗凝血1ml,加亚硝酸钠葡萄糖混合溶液和亚 甲蓝溶液各0.05ml，颠倒混合15次，使与氧气充分接 触，加塞后放37℃水浴或孵箱中3h。
蚕豆病发病机理：
1. 蚕豆病的遗传机理 2. 蚕豆病的诱发机制 蚕豆症是一种性染色体隐性遗传,意思是女 蚕豆病属先天性酶代谢缺陷遗传病，与体内红 性的一对 X性染色体都带有疾病基因才会发 细胞缺乏葡萄糖－ 6 －磷酸脱氢酶（ G－6－PD） 病，男性只有一个 X 性染色体，所以只要这 有关。在正常情况下，人体红细胞有一种具抗氧 个X染色体异常就会发病。只有一个异常X染 化作用的物质——谷胱甘肽。 G－6－PD缺乏者， 色体的女性没有症状，但是她们所生的男孩 谷胱甘肽尤其是还原型谷胱甘肽明显减少，致使 如果得到这个异常的X染色体，就会发病。 红细胞对氧化作用十分敏感。 食入新鲜蚕豆后，蚕豆中所含的巢菜碱甙物质， 可使血液中的氧化性物质增多，导致红细胞被破 坏，从而发生以黄疸和贫血为主要特征的全身溶 血性反应。
高铁血红蛋白还原实验 ——G6PD缺乏症检查
实验试剂：
1. 0.18 mol/L亚硝酸钠和0.28mol/L葡萄糖混溶液 亚硝酸钠1.25g、葡萄糖 5.0g、蒸馏水溶解，并加至100ml储存于棕色瓶中，放4℃冰箱，可保存一 个月 2. 0.4mmol/L亚甲蓝溶液 亚甲蓝（含3个结晶水）0.15g，蒸馏水加至 100ml。先将亚甲蓝放入乳钵中，加蒸馏水少量研磨，待溶解后移到100ml 容量瓶中，在再加蒸馏水至100ml，混匀过滤，此液可贮存3个月。 3. 0.02mol/L磷酸盐缓冲液（PH7.4）磷酸氢二钠229.5mg、磷酸二氢钾 52.2mg，加蒸馏水至100ml。或用0.0667mmol/L PH 7.4磷酸盐缓冲液稀释 3倍。 4. 109mmol/L枸橼酸钠溶液（32g/L）