运动疗法对卒中大鼠c_fos表达的即时影响

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Effect of Hedyotic Diffusa Extract on Expression of Bcl-2and Bax in Human Colon Cancer HT-29Cells

PENG Jun,LIN Jiu-mao,WEI Li-hui,et al

(Fujian Academy of Integrative Medicine,FUTCM,Fuzhou,Fujian 350108,China)

ABSTRACT:Objective To investigate the effect of Hedyotic diffusa extract on the proliferation of human colon cancer HT-29cells and expression of Bcl-2and Bax in vitro.Methods The human colon cancer HT-29cells were cultured in vitro and intervened by Hedyotic diffusa extract at different concentra -tions.After 24hours,morphologic change of cells was observed under phase contrast microscope,cell viability was determined by MTT assay,and mRNA and protein expression levels of Bcl-2and Bax were measured by RT -PCR and Western Blot.Results The density of HT -29cells decreased obviously,the cells became smaller,and the proliferation of HT-29cells was inhibited by Hedyotic diffusa extract in dose dependent man -ner.The expression of Bax increased with the increase of the drug concentration,and the expression of Bcl-2decreased with the increase of the drug concentration.Conclusion Hedyotic diffusa extract can significantly inhibit the proliferation of HT-29cells,and induce cells apoptosis by up-regulating the expression of Bax and down-regulating the expression of Bcl-2.

KEY WORDS:Hedyotic diffusa;colon cancer;HT-29cells;Bcl-2;Bax

脑卒中发生后应早期进行康复训练，然而究竟何时可进行运动疗法训练尚无明确的时间点，我们的实验旨在观察运动疗法对卒中大鼠c-fos 表达的即时影响，探讨运动疗法治疗脑卒中的介入时机。

1材料与方法1.1

实验动物及分组

成年雄性SD 大鼠30只，

由福建中医药大学动物实验中心提供，体重（200±

20）g ，动物房温度控制在18～26℃，光暗周期12h 。将大鼠随机分为空白组、模型组、运动组，每组10只。

1.2主要试剂及设备

c-fos 试剂盒（武汉博士

德生物技术有限公司，BA0207）；玫瑰红（Singa 公

司）；1mmoL ／L NaOH 溶液、1mmoL ／L HCl 溶液、

10%水合氯醛溶液、0.9%氯化钠溶液、4%多聚甲

运动疗法对卒中大鼠c-fos 表达的即时影响

张学君，林

栋，吴

强

（福建中医药大学针灸学院，福建福州350108）

摘要：

目的

观察运动疗法对脑卒中大鼠c-fos 表达的即时影响。

方法

将30只SD 大鼠分成空白组、模型组、运动组，每组10只，通过光化学法造成大鼠局灶性缺血模型，采用免疫组化法观察大鼠缺血1d 的c-fos 表达水平及运动疗法干预后c-fos 表达的变化。结果

大鼠局灶性缺

血1d 的c-fos 表达升高；运动疗法干预后大鼠c-fos 的表达与运动前比较无明显变化。

结论

运

动疗法对脑卒中大鼠缺血1d 的c-fos 表达影响不显著。

关键词：运动疗法；脑卒中；c-fos 中图分类号：R247

文献标志码：A

文章编号：1004-5627（2010）05-0026－03

收稿日期：2010-07-01

基金项目：福建省卫生厅资助课题（WZY0908）

作者简介：张学君（1981—），男，医学硕士，主要从事针灸治疗脑病的研究。

Journal of Fujian University of TCM October 2010，20（5）

福建中医药大学学报2010年10月第20卷第5期26

表1

3组c-fos 值比较（x ±s ）

组别空白组模型组运动组

n 101010

c-fos 值

—

24.00±5.031）24.40±4.141）

注：与空白组比较，1）P ＜0.01。

醛溶液、0.01mmoL ／L PBS 缓冲液、0.02mol ／L 柠檬酸修复液、3％H 2O 2为自配溶液。主要设备：数码显微图像采集与分析系统（麦克奥迪实业集团中国有限公司，Motic 5000C ＋Moticmed ）。

1.3模型制备大鼠仰卧固定于实验台上，10％

水合氯醛腹腔注射麻醉（0.35mL ／100g ），颈部脱毛，安尔碘消毒颈部皮肤，沿下颈正中切开，分离出左颈总动脉。左颈总动脉注射光敏剂玫瑰红（20mg ／kg ）。将大鼠俯卧位固定于脑立体定位仪上，于头颅正中偏左侧沿矢状线切开皮肤3cm ，分离骨膜，暴露颅骨，在前囟后1.8mm 、正中线向左旁开2mm 处，用中央有1个8mm ×5mm 小孔的黑色避光纸遮避周围组织，用冷光源探头照射已暴露的颅骨，时间30min ，使之发生光化学反应，造成大脑局灶性缺血模型。术后创面敷少许庆大霉素，缝合伤口并归笼饲养。模型成功的判断标准采用Bederson 方法进行肢体功能的神经缺损评定。0分：无任何神经功能缺失；1分：左前肢屈曲（即提尾悬空实验阳性）；2分：侧推抵抗力下降（即侧向推力实验阳性），伴前肢屈曲，无转圈行为；3分：同2级行为，伴自发性旋转。本研究模型组动物神经功能评分均大等于2分，可以认为实验造模成功。

1.4运动疗法运动组大鼠在造模成功后1d 进

行运动疗法训练，空白组大鼠不接受任何处理，模型组大鼠仅完成造模过程，不进行运动疗法训练。运动疗法采用滚筒式训练，用1个长30cm ，直径

60cm 的圆形网状仪器，底座有固定架，一端有一手摇柄，手摇按10r ／min 转动训练。将大鼠放入该

器内可训练大鼠的抓握、旋转、行走等运动，20

min ／次。1.5

大鼠脑取材及组织的制备

运动训练结束

后，以10%水合氯醛腹腔麻醉大鼠，切开胸腔，暴露心脏，剪开右心耳，从左心室依次灌注37℃的生理盐水250mL 至流出液清晰，动物肝脏及肠系膜呈苍白，继续灌以4℃多聚甲醛500mL ，待动物出现四肢肌肉抽搐表示灌注成功。断头、迅速剥取脑组织，放入4％多聚甲醛中固定24h 后，参照《大鼠脑立体定位图谱》［1］，取前额2mm 至视交叉部位的脑片进行脱水、浸蜡、包埋、切片、烤片、烘片、脱蜡等常规步骤。

1.6

c-fos 的免疫组织化学反应脱蜡后的切片放入0.01mol ／L 磷酸盐缓冲液（pH 7.2～7.4）漂洗3次，每次3min ；用0.02mol ／L 柠檬酸修复液高

压修复3min ，自然冷却；将玻片排列在湿盒中，滴加3％H 2O 2，室温下静置10min ；用0.01mol ／L PBS 漂洗3次，每次3min ；按1∶200稀释c-fos 一抗：

BA0207，将溶液滴加到切片上，移入4℃冰箱孵育12h ；用0.01mol ／L PBS 漂洗3次，每次5min ；切片滴加PV-6001（辣根酶标记羊抗兔IgG 多聚体，

二抗），37℃孵育2h ，0.01mol ／L PBS 漂洗3次。将玻片甩干后，滴加0.05%DAB ，在显微镜下观察显色后蒸馏水漂洗，苏木素复染，晾干后用中性树胶封片。对照实验以PBS 代替一抗，同步进行上述免疫组织化学染色，其结果均为阴性。

1.7细胞计数在Motic 5000C ＋Moticmed 数码

显微图像采集与分析系统对3组样本的大脑皮层梗死区周围定位后，每只大鼠大脑皮质切片同一部位随机选取5个视野，运用Motic Images Ad -

vanced 6.0医学图像分析系统进行阳性表达计数。1.8统计学处理采用SPSS 13.0版本软件进行

数据分析，实验结果用x ±s 表示，采用单因素方差分析，P ＜0.05为具有显著性差异。

2结果

实验结果见表1。

3讨论

3.1

本课题观察运动疗法对脑卒中大鼠c-fos 表

达的即时影响，选取的时间点为缺血后1d ，结果显示大鼠局灶性缺血1d 后c-fos 表达升高；1次运动疗法干预后，大鼠c-fos 的表达与运动前比较无明显变化。脑缺血数分钟后即会引起基因表达的增多，那些反应最快的基因称为即刻早期基因（immediately earlygenes ，IEGs ），c-fos 基因是即刻早期基因家族中最重要成员之一。c-fos 基因是参与细胞最早功能活动的基因，被认为是研究中枢神经系统最有代表性的即刻早期基因。脑缺血引起的脑损害包括了细胞凋亡与坏死，缺血性损伤的严重程度决定了濒死神经元的命运，非常严重的缺血会导致神经元的直接坏死，而轻中度损伤蛋白质合成未被完全抑制，可诱导c-fos 等基因的

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