土壤微生物生物量的测定方法氯仿熏蒸

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土壤微生物生物量的测定方法

1土壤微生物碳的测定方法（熏蒸提取----仪器分析法）

1.1 基本原理

新鲜土样经氯仿熏蒸后（24h），土壤微生物死亡细胞发生裂解，释放出微生物生物量碳，用一定体积的0.5mol/LKSO溶液提取土壤，借用有机碳自动分析42仪测定微生物生物量碳含量。根据熏蒸土壤与未熏蒸土壤测定有机碳的差值及转换

系数（K），从而计算土壤微生物生物量碳。EC1.2 实验仪器

自动总有机碳（TOC）分析仪（Shimadzu Model TOC—500,JANPAN）、真空干

燥器、烧杯、三角瓶、聚乙烯熟料管、离心管、滤纸、漏斗等。1.3 实验试剂1）无乙醇氯仿（CHCL）；32）0.5mol/L硫酸钾溶液：称取87g KSO溶于1L蒸馏水中423）工作曲线的配制：用0.5mol/L硫酸钾溶液配制10ugC/L、30ugC/L、50ugC/L、

70ugC/L、100ugC/L系列标准碳溶液。（其实一般情况下，

仪器会自带的标曲，一般不用自己做的）

1.4 操作步骤

1.4.1 土壤的前处理（过筛和水分调节略）

1.4.2 熏蒸

称取新鲜（相当于干土10.0g，这个可以根据自己土样的情况而定）3份分别放入25ml小烧杯中。将烧杯放入真空干燥器中，并放置盛有无乙醇氯仿（约2/3）的15ml烧杯2或3只，烧杯内放入少量防暴沸玻璃珠，同时放入一盛有NaOH溶液的小烧杯，以吸收熏蒸过程中释放出来的CO，干燥器底部加入少量2水以保持容器湿度。盖上真空干燥器盖子，用真空泵抽真空，使氯仿沸腾5分

钟。关闭真空干燥器阀门，于25℃黑暗条件下培养24小时。

1.4.2 抽真空处理

熏蒸结束后，打开真空干燥器阀门（应听到空气进入的声音，否则熏蒸不完1 / 7

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全，重做），取出盛有氯仿（可重复利用）和稀NaOH溶液的小烧杯，清洁干燥器，反复抽真空（5或6次，每次3min，每次抽真空后最好完全打开干燥器盖子），直到土壤无氯仿味道为止。同时，另称等量的3份土壤，置于另一干燥器中为不※（注意：熏蒸后不可久放，应该快速浸提）熏蒸对照处理。

1.4.4 浸提过滤聚乙烯

离心管从干燥器中取出熏蒸和未熏蒸土样，将土样完全转移到80ml，考虑到土

样的原因，此部（土水比为1:4中，加入40ml 0.5mol/L硫酸钾溶液

的硫酸钾溶液，当然这个加入量要16ml4g分熏蒸和不熏蒸土均为，即，4g土：

，用中速定量滤纸过滤。同30minTOC仪器的进入量决定）300r/min振荡根据

（但使℃冷冻保存土壤提取液最好立即分析，或—203时作个无土壤基质空白。注意这部分很重要，有研究结果表明：提取液如果不立即分（用前需解冻摇匀）

℃，否则将影响浸提液的效果，其次，过滤时不要用普通的20析，请保存在—

定性或定量滤纸，以免长久杂质会堵塞仪器的管路，建议使用那种一次性塑料元）。注射器，配一个0.2um的滤头，一个才1

1.4.5 TOC仪器测定（这个

要根据仪器自己的性能决定，但是一般情吸取上述土壤提取液10ul

况下，在测定土壤滤液时候，要对其进行稀释，如果不稀释，一方面超过原来

）分析仪上，注入自动总有机碳（TOC仪器的标曲，另一方面可能堵塞仪器。）

不同的型号则操作程序测定提取

液有机碳含量。由于总有机碳分析仪型号较多，Model 仪（Shimadzu 的用有机碳分析验里差存在较大异，这以本实室使TOC---500,JAPAN）为例。1.5 计算CHCL3CK)*TOC仪器的稀释倍数*E原来的水土比/0.45

SMBC=(E—CC2 土壤微生物生物量氮（茚三酮比色法）

土壤微生物生物氮一般占土壤全氮的2%—7%，是土壤中有机—无机态氮转化的一个重要环节，关于土壤微生物氮的测定常见的熏蒸浸提法有两种，一是全氮测定法，另一个是茚三酮比色法，如下

（茚三酮比色法）2.1 基本原理2 / 7

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Amato和Ladd（1988）研究表明新鲜土样熏蒸过程所释放出的氮，主要成分为α-氨基酸态氮和铵态氮，这两种氮形态可以用茚三酮反应定量测定，并发

现熏蒸与未熏蒸土壤提取的茚三酮反应态氮的增量，与其土壤微生物生物量碳之间存在显著的相关性。因此，人们采用熏蒸提取茚三酮比色法来测定土壤微生物生物量氮（FE-Nnin）。

.2 实验仪器 2 分光光度计、硬质试管、水浴锅、真空干燥器、烧杯、三

角瓶、聚乙烯塑料管、离心管、漏斗等

2.3 实验试剂

1）无乙醇氯仿（CHCl）；32）0.5mol/L (KSO)溶液：称取硫酸钾（KSO）87g，溶于去离子水中，稀4422释至1000ml；

3）pH5.2的乙酸锂（LiOH?HO）溶液：称取氢氧化锂（LiOH?HO）168g，加22入冰乙酸（优级纯）279ml，加水稀释到1000ml，用浓盐酸或50%氢氧化钠溶液调节pH至5.2。

4）茚三酮溶液：取150ml二甲基亚砜（CHOS）和乙酸锂溶液50ml加入4g 水62?H?2HO）搅拌至完全O ）和0.12g还原茚三酮（C 合茚三酮（CHOHO2631021894溶解；

5）50%乙醇水溶液：吸取50ml 99%乙醇于100ml容量瓶中，用蒸馏水定容；6）1mol/L的硫酸铵[(NH4)SO]标准储存液：称取4.7167g分析纯硫酸铵（称42前105℃烘2h）溶于0.5mol/L 硫酸钾溶液中，并用硫酸钾溶液定容至1000ml，摇匀，于4℃冰箱中保存。

7）0.1mol/L 的硫酸铵[(NH4)SO]标准液：吸取10ml 1mol/L的硫酸铵标准42储存液于100ml容量瓶中，用0.5mol/L硫酸钾溶液定容至100ml，摇匀。此溶液最好现配现用。

8）工作曲线的制备：分别吸取0.00ml、0.50ml、1.00ml、2.00ml、3.00ml、4.00ml、5.00ml 0.1mol/L的硫酸铵标准液于100ml容量瓶中，用0.5mol/L硫酸钾溶液

定容至100ml，摇匀，其浓度分别为0mol/L、0.25mol/L、0.5mol/L、1.0mol/L、1.5mol/L、2.0mol/L、2.5mol/L硫酸铵标准氮的系列溶液。

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2.4 操作步骤

.4.1 土壤的前处理（和1.4.1一样）22.4.2 熏蒸（和1.4.2一样）

2.4.3抽真空处理（和1.4.3一样）

2.4.4 浸提过滤

从干燥器中取出熏蒸和未熏蒸土样，将土样完全转移到80ml聚乙烯离心管中，加入40ml 0.5mol/L硫酸钾溶液（土水比为1:4，考虑到土样的原因，此部

分熏蒸和不熏蒸土均为2g，即，2g土：8ml的硫酸钾溶液）300r/min振荡30min，

用中速定量

滤纸过滤。同时作3个无土壤基质空白。土壤提取液最好立即分析，或—20℃冷冻保存（但使用前需解冻摇匀）（注意这部分很重要，有研究结果表

※，否则将影响浸提液的效果，，请保存在—20℃明：提取液如果不立即分析，

其次，过滤时不要用普通的定性或定量滤纸，以免长久杂质会堵塞仪器的管路，建议使用那种一次性塑料注射器，配一个0.2um的滤头，一个才1元）。

2.4.5 分光光度计比色测定（此处沸水浴不好控制※）