刺激响应共负载药物_基因微载体的制备

Vol.34高等学校化学学报No.32013年3月 CHEMICAL JOURNAL OF CHINESE UNIVERSITIES 720~725 doi:10.7503/cjcu20120563

刺激响应共负载药物/基因微载体的制备

陈丽娜1,2,王　颖1,2,朱　莹3,孙一新1,2,王幽香1,2

(1.教育部高分子合成与功能构造重点实验室,2.浙江大学高分子科学与工程学系,3.浙江大学医学院附属第二医院国际保键中心,杭州310027)摘要　合成了聚乙烯亚胺接枝二茂铁(PEI⁃Fc)两亲聚合物,采用水包油法制备包埋疏水性抗癌药阿霉素(DOX)的载药胶束,并利用胶束表面正电荷的PEI 链段有效缔合DNA,获得尺寸合适㊁表面带正电荷的阿霉素与基因共负载微载体.在磷酸盐(PBS)缓冲溶液中,共负载微载体能够缓慢释放出DOX.在硝酸铈铵存在下,二茂铁从疏水性转变为亲水性,使载药胶束完全解离,由于PEI⁃Fc 与DNA 之间的静电作用,使基因超分子组装体稳定存在,显示出很好的氧化响应特性.细胞培养结果表明,表面带正电荷的共负载微载体易被HepG2细胞内吞,并可转染,且随着DOX 的释放逐渐杀死HepG2肝癌细胞,为安全稳定㊁具有刺激响应的药物与基因共负载微载体的制备提供了可行的途径.

关键词　刺激响应;阿霉素;基因;共负载;超分子组装

中图分类号　O631.3 文献标志码　A

收稿日期:2012⁃06⁃11.

基金项目:国家自然科学基金(批准号:21074110,51273177)和浙江省科技计划项目(批准号:2010C31025)资助.

联系人简介:朱　莹,女,博士,主任医师,主要从事生物医用材料的基础及临床研究.E⁃mail:zhuying007@

癌症治疗是最具有挑战性的课题之一.外科手术是临床治疗癌症的主要手段之一,但其对多重瘤或者转移瘤患者起的作用十分有限[1].化学疗法是现今治疗癌症的最有效方法,然而化疗药物治疗癌症亦有很多局限性,如患者易产生多药耐药性㊁药物对正常组织的高毒副作用等[2,3].近年的研究发现,将抗癌药物与治疗基因同时输送到肿瘤细胞中,构建高效安全的药物基因复合载体,实现基因和抗癌药物的有效传递,达到基因疗法和化学疗法的协同作用,可有效解决癌细胞的多药耐药性,减少抗癌药物对人体正常细胞的毒副作用,具有巨大的发展潜力和应用价值[4~10].其中的关键问题是制备高效安全的药物基因共传递载体,而通过制备阳离子化核⁃壳胶束,则可实现疏水性抗癌药物与基因的共同负载.

聚乙烯亚胺(PEI)具有较强的浓缩DNA 的能力和 质子海绵效应”,是常用的非病毒聚阳离子基因载体[11~13].在PEI 上引入一些疏水基团可以制备阳离子化核⁃壳胶束,并且降低聚合物与质粒DNA 之间的相互作用,增加复合物与细胞膜的作用,有利于细胞内吞和降低细胞毒性.二茂铁(Fc)是一种具有芳香性夹心结构的金属仔键型有机配合物,具有易受环境影响的可逆氧化还原电子对.当Fc 被氧化成二茂铁正离子时,由疏水基变成亲水基,常作为结构单元设计合成具有氧化还原活性的材料.本文通过合成聚乙烯亚胺接枝二茂铁(PEI⁃Fc)两亲性聚合物,采用水包油法制备了包埋DOX 的载药胶束,并利用胶束壳层带正电荷的PEI 链段与带负电荷的DNA 之间的静电作用,有效缔合DNA 分子,制备了具有氧化还原刺激响应的DOX 与DNA 共负载微载体,研究了此共负载微载体的基本特性,采用体外细胞培养评价共负载纳米粒子的细胞内吞㊁毒性和基因转染的效果.

1　实验部分

1.1　试剂与仪器

支化聚乙烯亚胺(bPEI,分子量为2.5×104)和二茂铁甲醛,Sigma⁃Aldrich 公司;盐酸阿霉素(Doxo⁃rubicin⁃HCl,DOX⁃HCl),北京中硕医药科技开发有限公司;鱼精蛋白脱氧核糖核酸(钠盐,高级纯)和

N ⁃2⁃羟乙基哌嗪⁃N ⁃2⁃乙磺酸(Hepes),上海生物工程技术服务有限公司;质粒pEGFP,Clonetech 公司;细胞用DMEM 高糖培养基,GIBCO 公司;胎牛血清(FBS),杭州四季青生物工程材料有限公司;

3⁃(4,5⁃二甲基噻唑⁃2)⁃2,5⁃二苯基四氮唑溴盐(MTT),Bio Basic 公司.日本Shimadzu 公司UV⁃2550型紫外⁃可见光谱仪;英国Malvern 公司Zeta⁃sizer 3000HS 型光散射粒径分布仪;美国Brookhaven 公司90plus /BI⁃MAS 动态光散射粒径分析仪;日本NEC 公司JEM⁃1200EX 型透射电子显微镜(TEM);德国Bruker 公司DMS500型核磁共振波谱仪(1H NMR);美国PerkinElmer 公司LS 55型荧光光谱仪;美国Becton Dickinson 公司FACSCalibur 型流式细胞仪;美国Bio⁃Rad 公司

550型荧光酶标仪,Zeiss Axiovert 200型荧光显微镜.1.2　PEI⁃Fc 两亲聚合物的制备及表征参照文献[14]方法制备PEI⁃Fc 两亲性聚合物,分别配制25mg /mL PEI 甲醇溶液和62mg /mL 二茂铁甲醛甲醇溶液.在电磁搅拌下,将二茂铁甲醛溶液缓慢滴加到PEI 溶液中,室温反应2h 后,透析㊁纯化并冻干获得产物.测定PEI⁃Fc 的1H NMR 谱图;采用芘荧光探针光谱法测定PEI⁃Fc 的临界胶

束浓度[15].

1.3　PEI⁃Fc 载药胶束的制备及表征

配制浓度为2mg /mL 的PEI⁃Fc 空白胶束水溶液.参照文献[16,17]方法制备包埋DOX 的载药胶束.配制浓度为1mg /mL 的DOX 氯仿溶液.在电磁搅拌下,将2mL DOX 氯仿溶液逐滴加入5mL 空白胶束溶液中,待氯仿挥发后采用450nm 微孔滤膜过滤,即可制得2mg /mL 载药胶束.采用紫外⁃可见光谱测定胶束的载药量与包封率;采用Zeta⁃sizer 3000HS 型光散射粒径分布仪测定粒径及表面电位;采用透射电子显微镜观察微观形貌.

1.4　药物与基因共负载微载体的制备及体外药物释放实验

在pH =7.4,NaCl 浓度为20mmol /L 条件下,将上述包埋DOX 的载药胶束加入到等体积的DNA 溶液中,旋涡混合并静置30min,调节载药胶束的浓度制备不同N /P 比(N /P 表示PEI⁃Fc 中含有的胺基与DNA 分子中含有的磷酸根基团的摩尔比)的共负载微载体.参考文献[18]方法,取5mL 上述载药胶束和共负载微载体分别加入截留分子量为3.5×103的透析袋中,置于10mL 磷酸盐(PBS)缓冲溶液中,于37℃恒温振荡,每隔一段时间,取出1mL 透析液,同时加入1mL 新鲜的PBS 溶液.采用紫外⁃可见光谱测定透析液中DOX 的释放量,比较载药胶束和共负载药物基因微载体的药物释放曲线.

1.5　响应特性测试

取0.2mg /mL 载药胶束及相同载药胶束浓度的N /P =10的共负载微载体,加入10mg /mL 硝酸铈铵氧化剂(氧化剂的终浓度为2mg /mL),混合均匀后静置2h,采用光散射粒径分布仪测定载药胶束溶液和共负载微载体粒径变化.

1.6　细胞培养和细胞毒性测试

采用HepG2细胞(人肝癌细胞)进行体外细胞培养,所用培养基为含质量分数为10%FBS 和1%青霉素⁃链霉素的DMEM 高糖培养基,细胞培养环境为37℃,5%(体积分数)CO 2的潮湿空气的培养箱.将HepG2细胞种植到24孔板中,种植密度为1×105细胞/孔.分别加入含DOX 终浓度为5μg /mL 的游离DOX⁃HCl 水溶液㊁载药胶束溶液和N /P =10的共负载微载体继续置于培养箱中孵育4h 后,取细胞悬液采用流式细胞仪测定粒子内吞率.

参照文献[19]方法,采用MTT 法测定共负载微载体的细胞毒性.在96孔培养板中种植5×103细胞/孔的HepG2细胞,分别加入不同浓度的游离DOX⁃HCl 溶液㊁载药胶束溶液和N /P 比为10的共负载微载体以及对应的空白PEI⁃Fc 胶束,在培养箱中孵育不同时间后,用荧光酶标仪检测570nm 处吸光度,激发波长为470nm,计算细胞活性.

将HepG2细胞以5×104细胞/孔的种植密度种植到24孔板中,加入含2μg pEGFP 的N /P =10的PEI /DNA,PEI⁃Fc /DNA 粒子和PEI⁃Fc /DOX /DNA 共负载微载体,孵育48h 后,取细胞悬液采用流式细胞仪测定粒子的转染率.127　No.3　陈丽娜等:刺激响应共负载药物/基因微载体的制备