感受态细胞的制备(DH5α大肠杆菌)
个人总结 DH5α感受态的制备和转化
1.感受态的制备（1）挑取E.coli DH5α受体菌单菌落于50 ml 2×YT培养基的250ml锥形瓶中，250rpm，37℃震荡培养2.5小时左右（测其OD600在0.5-0.6最好）；（2）倒入，灭菌冰上预冷的50ml离心管中，盖严；（3）冰浴20-30分钟，使菌液冷却到0℃（要是有事，此步可暂停，冰浴久一点）；（4）4℃，4000rpm（3500rpm最好，4000会使离心管变形，而且菌体离的过紧）离心10min 收集菌体；（5）弃上清，倒置1min；（6）加10ml预冷的0.1mol/L的CaCl2悬浮菌体（先加2ml悬浮，再加8ml。
直接加够10ml不容易吹散悬浮）；（7）冰浴25分钟；（8）4℃，4000rpm离心10min；（9）弃上清，加入1.5ml预冷的0.1mol/L的CaCl2小心悬浮；（10）分装（EP在预冷前先做好标记）100 μL或者200μL一管。
可以-70℃保存备用，也可以放置于冰上后在冰箱4℃保存一两天再用，转化效果不会有大的影响。
注意：加入CaCl2后细胞比较脆弱，操作一定要轻柔，不能弹不能摔。
整个操作都要在冰上，手不要直接接触管底。
2.转化可用新做的感受态进行转化，也可用-70℃保存的进行转化（1）分装的100或者200μL感受态细胞+重组质粒，冰浴30min；（2）42℃静置90s（可用干浴器）；（3）冰浴2-3min；（4）加入800μL37℃预热的2×YT培养基，37℃，200rpm震荡培养45min（中间不要暂停，培养时45度角倾斜）；（5）3000rpm离心3-4min，倒掉上清，残余的大概100μL左右进行悬浮后涂板；（6）37℃倒置培养过夜，第二天查看板上菌落生长情况。
注意：要是转化质粒，转0.5μL或者1μL就行了，质粒的转化效率很高。
涂板的时候不用离心，直接吸取50μL涂板。
转化连接产物的时候由于连接效率不一定高，所以要离心之后弃上清剩余100μL再悬浮后全部涂板。
大肠杆菌感受态细胞制备
实验一 大肠杆菌感受态细胞的制备和转化一、实验目的1．了解和掌握大肠杆菌感受态细胞的制备方法的原理和操作要点。
2．了解和掌握质粒DNA转化大肠杆菌细胞的原理和方法。
二、实验原理在基因工程操作中，感受态细胞的制备和质粒的转化是一项基本技术，外源 DNA感受态是细菌细胞具有的能够接受外源DNA 只有转化到大肠杆菌细胞内才能得到扩增。
的一种特殊生理状态。
大肠杆菌的感受态可用 CaCl2 处理而诱导产生。
将正在生长的大 肠杆菌细胞在 0℃下加入到低渗的氯化钙溶液中，便会使细菌细胞膜的透性发生改变， 此时的细胞呈现出感受态。
制备好的大肠杆菌感受细胞迅速冷冻于70℃可保存相当一段 时间而不会对其转化效率有太大影响。
在 0℃下外源 DNA（质粒）可吸附到感受态细胞表面，短时间的热刺激（42℃，90 秒），诱导细胞吸收DNA。
转化了质粒DNA的大肠杆菌随后在培养基中 37℃培养 1小时，可使质粒编码的抗生素抗性基因得到表达，因此，转化了质粒的大肠杆菌细胞可 在含有相应抗生素的培养基上涂布生长。
而没有转化的细胞则无法生长。
三、实验仪器、材料和试剂1．仪器：超净工作台、冷冻高速离心机、灭菌锅、恒温摇床、冰箱、超低温冰箱(70 ℃)、50ml 离心管、1.5ml 离心管、试管、培养皿、冰浴、加样器及吸头。
以上玻璃仪器和离心管须在用前灭菌，灭菌条件：120℃，15 分钟。
2．材料：大肠杆菌DH5a或其他菌株。
3．试剂：（1）LB 液体培养基：（见质粒DNA提取）（2）LB 固体培养基：15g/1L（琼脂粉 LB 液体培养基）（3）0.1 mol/L CaCl2（4）0.1 mol/L CaCl214%（v/v）甘油以上溶液均需灭菌后使用，灭菌条件同上。
（5）LB 固体培养基平板（LB plate）：培养基熔化后待其温度低于 50℃时加入氨苄青霉 素至终浓度为 100μg/ml，混匀后立即倒入培养皿（直径 9cm），待凝固后，于 4℃倒置保存。
感受态细胞的制备(DH5α大肠杆菌)
感受态细胞的制备（DH5α大肠杆菌）一、准备工作1、实验器械4℃离心机（50ml离心管），37℃恒温箱，37℃摇床，紫外通风橱（提前一天预约）；0.22μm的滤器2个，10ml注射器2个；冰盒；高压灭菌的1.5mlEP管30个，与离心机配套的50ml离心管6个（高压灭菌），高压灭菌的500ml锥形瓶2个，高压灭菌的100ml 玻璃瓶2个，高压灭菌的1ml枪头和200μl枪头各一盒。
2、试剂配制① LB平板② TYM培养基：分别称取胰蛋白胨4g，NaCl 1.46g，酵母提取物1g，MgSO4 0.62g，至于250ml烧杯中，加入120mlDDW，摇晃，使其全部溶解，用浓NaOH调节PH值为7.5，最后定容至200ml，转入至500ml锥形瓶，高压灭菌，4℃保存。
③ TfBⅠ：分别称取乙酸钾0.294g，MnCl2 0.99g，KCl 0.146g，CaCl2 0.111g，置于200ml 烧杯中，加入15ml甘油和85mlDDW，摇晃，使其全部溶解。
然后在安全橱中用孔径为0.22μm的滤器过滤混合液，置于高压灭菌的100ml玻璃瓶中，4℃保存，使用前必须预冷。
④ TfBⅡ（每次现用现配）：分别称取MOPS 0.046g，CaCl2 0.167g，KCl 0.015g，置于50ml烧杯中，加入3ml甘油和17mlDDW, 摇晃，使其全部溶解。
然后在安全橱中用孔径为0.22μm的滤器过滤混合液，置于高压灭菌的100ml玻璃瓶中，4℃保存，使用前必须预冷。
二、实验步骤1、将DH5α甘油菌从-80℃冰箱中拿出来放在冰上，用枪头吸蘸取或取少部分菌液加到无抗生素的LB平板边缘，在火上稍微烧一下枪头，在平板侧壁上冷却枪头，同时使其顶端变圆变钝。
划线接种，倒置放入37℃恒温箱过夜。
注：①尽量在菌液融化前挑取，反复冻融对菌体有损伤。
②吸取菌液后，尽可能快把甘油菌放回-80℃冰箱。
2、次日早上，观察是否长出单个菌落，菌落大小合适时，将平板放入4℃保存。
工程菌DH5α感受态细胞的制备及质粒pUC18转化的研究论文
毕业论文题目：工程菌DH5α感受态细胞的制备及质粒pUC18转化的研究（教务处制表）工程菌DH5α感受态细胞的制备及质粒pUC18转化的研究摘要：工程菌DH5α是实验室经常用到的一种宿主菌,同时质粒pUC18也是一种常用的优良表达载体，两者常被用于基因克隆和原核表达研究的工具。
本实验采用老师保存的实验室菌种，通过质粒提取试剂盒（碱裂解法）提取质粒pUC18和氯化钙法将工程菌DH5α制备成感受态细胞，然后将质粒转化入感受态的工程菌DH5α细胞中。
结果表明：提取的质粒通过琼脂糖凝胶电泳显示为pUC18，而经pUC18转化的工程菌DH5α具有抗氨苄青霉素的能力，并由于E.coli DH5a在使用pUC18质粒载体转化时，可与载体编码的β－半乳糖苷酶氨基端实现α－互补，最后接种于加入氨苄青霉素、呈色底物X-gal和诱导物IPTG的LB培养基上，经蓝白斑筛选，筛选阳性克隆。
关键词：工程菌DH5α；碱裂解法；质粒pUC18；蓝白斑筛选Theresearch for the preparation of the engineering culture DH5αcells and the transformation of the plasmid pUC18Abstract:Theengineering strain DH5αis often used as one of the host bacteria in laboratory , and plasmid pUC18 is also a kind of the commonly excellent expression vector, both are often used to the study of gene cloning and prokaryotic expression as the tool.The laboratory cultures are preserved by the teacher in this study,the plasmid pUC18areextracted by plasmid extraction kit (caustic pyrolysis) and the engineering bacterium DH5αareprepared as competent cells by calcium chloride method , and then translates plasmid into the feeling state of engineering bacterium DH5α cells.The resul t s showed that the extract of plasmid is pUC18 by agarose gel electrophoresis,so that the engineering bacterium DH5α that including the plasmid pUC18 has the ability of resistance to ampicillin, and as a result,when pUC18 plasmid vector has finished the transformation,the E.coliDH5αcan realize α-complementation with the amino terminal of theβ-galactosidase that was produced by the plasmid pUC18,finally,the transformant was inoculated to the LB culture mediumthat contains ampicillin, color substrate X - gal and inducer IPTG,the transformantsarepositive clones if they can survive andbescreened out by the blue and white spot screening.Keywords: Engineering bacterium DH5α;Alkaline lysis method;Plasmid pUC18;Blue and white spot screening目录1 前言 ............................................................................................... 错误！未定义书签。
大肠杆菌热击感受态细胞的制备、注意事项和转化
大肠杆菌感受态细胞制备和转化大肠杆菌感受态细胞制备原理：大肠杆菌自然条件下极难进行转化，其关键原因是转化因子吸收较为困难。
在转化试验中，通常先采取人工方法制备感受态细胞，代表性方法之一是Ca2+诱导法。
感受态形成后，细胞生理状态会发生改变，出现多种蛋白质和酶，负责供体DNA结合和加工等。
细胞表面正电荷增加，通透性增加，形成能接收外来DNA分子受体位点等。
Ca2+诱导DNA对大肠杆菌细胞转化：①在0℃CaCl2低渗溶液中，细菌细胞发生膨胀，同时CaCl2使细胞膜磷脂层形成液晶结构，促进细胞外膜和内膜间隙中部分核酸酶解离开来，诱导大肠杆菌形成感受态。
②Ca2+能和加入DNA分子结合，形成抗DNA酶（DNase）羟基-磷酸钙复合物，并黏附在细菌细胞膜外表面上。
当42℃热刺激短暂处理细菌细胞时，细胞膜液晶结构发生猛烈扰动，并随之出现很多间隙，为DNA分子提供了进入细胞通道。
一、受体菌培养从LB平板上挑取新活化E. coli DH5α单菌落,接种于3-5ml LB液体培养基中,37℃下振荡培养12小时左右,直至对数生长后期。
将该菌悬液以1:100-1:50百分比接种于100ml LB 液体培养基中,37℃振荡培养2-3小时至OD600 ＝0.5左右。
（OD600值在0.4到0.6之间）二、感受态细胞制备 ( CaCl2 法)1、将培养液转入离心管中,冰上放置10分钟,然后于4℃下3000g离心10分钟。
2、弃去上清,用预冷0.05mol/LCaCl2 溶液10ml轻轻悬浮细胞,冰上放置15-30分钟后,4℃下3000g离心10分钟。
3、弃去上清,加入4ml预冷含15%甘油0.05mol/LCaCl2 溶液,轻轻悬浮细胞,冰上放置几分钟,即成感受态细胞悬液。
4、感受态细胞分装成200μl小份,贮存于-80℃可保留半年。
大肠杆菌感受态过程中注意事项：1、细菌生长状态：不要用经过数次转接或储于4℃培养菌，最好从-80℃甘油保留菌种中直接转接用于制备感受态细胞菌液。
大肠杆菌感受态细胞的制备原理、步骤以及重组质粒转化
大肠杆菌感受态细胞的制备原理、步骤以及重组质粒转化一、目的1.了解感受态细胞生理特性及制备条件，掌握大肠杆菌感受态细胞制备方法。
2.掌握质粒DNA 转化大肠杆菌的方法，了解转化的条件和利用半乳糖苷酶基因插入失活选择重组质粒DNA 的原理。
二、原理（一）大肠杆菌感受态细胞制备的原理所谓感受态，是指细菌生长过程中的某一阶段的培养物，只有某一生长阶段中的细菌才能作为转化的受体，能接受外源DNA而不将其降解的生理状态。
感受态形成后，细胞生理状态会发生改变，出现各种蛋白质和酶，负责供体DNA 的结合和加工等。
细胞表面正电荷增加，通透性增加，形成能接受外来的DNA 分子的受体位点等。
本实验为了把外源DNA（重组质粒）引入大肠杆菌，就必须先制备能吸收外来DNA分子的感受态细胞。
在细菌中，能发生感受态细胞是占极少数。
而且，细菌的感受态是在短暂时间内发生。
目前对感受态细胞能接受外来DNA 分子的本质看法不一。
主要有两种假说：1、局部原生质体化假说――细胞表面的细胞壁结构发生变化，即局部失去细胞壁或局部溶解细胞壁，使DNA 分子能通过质膜进细胞。
证据有：（1）发芽的芽孢杆菌容易转化；（2）大肠杆菌的原生质体不能被噬菌体感染，却能受噬菌体DNA 转化；（3）适量的溶菌酶能提高转化率。
2、酶受体假说――感受态细胞的表面形成一种能接受DNA 的酶位点，使DNA分子能进入细胞。
证据是：（1）蛋白质合成的抑制剂如氯霉素，可以抑制转化作用；（2）细胞分裂过程中，一直有局部原生质化，但感受态只在生长对数期的中早期出现；（3）分离到感受态因子，能使非感受态细胞转变为感受细胞。
目前对感受态细胞的转化理论尚未有统一结论，但是许多实验室一直进行探索，试图从实验中获得明确回答。
有人根据pBR322 质粒DNA对E・co li K――12X1776菌株的转化结果，认为：近来，在许多研究室都发现CaCl2对受体菌处理，可提高转化效率几十倍，通常把细胞悬浮在pH6.0 的100mmol/L CaCl2中，在冰浴条件下，放置过夜，转化率转高，但一过24小时，转化率测恢复为原来的水平。
超级感受态细胞DH5α的制备
制备和转化感受态大肠杆菌的Inoue方法：制备超级感受态细胞采用Inoue的方法（1990）制备大肠杆菌感受态细胞很好时甚至能达到Hanahan方法（1980）的转化效率。
但在标准的实验室条件下，达到l×108~3×108个转化克隆/ug质粒DNA的转化效率更为常见。
与Hanahan方法相比，这一方法的优点在于并不过分地讲究细节，但是重复性更好，而且更有预见性。
这一方法与其他方法有所不同的是细菌在18℃进行培养而不是通常的37℃。
否则这个方法也就没有什么特别之处，而不过是一个司空见惯的标准程序。
没有人知道为何在低温进行细菌培养会影响转化效率。
也许是18℃时合成的菌膜成分和物理性状更有利于攫取DNA，也许是低温使有利于高效转化的生长时相延长了。
在18℃进行细菌培养并非易事，大多数实验室缺乏在夏天和冬天能够准确保持18℃的摇床。
将摇床置于4℃冷室，用温控器加温至18 ℃是一个解决问题的方法。
也可使培养物的温度维持在20~23℃，这样做并不会造成转化效率降低，这一温度在很多实验室其实是室温。
在这一温度范围，细菌生长得很慢，倍增时间大约为2.5~4h。
如此缓慢的生长可能会导致培养失败，尤其是在晚间较迟的时候，这时细菌的OD600吸收值似乎永远不能达到理想的0.6。
解决这个问题的方法是晚上就进行培养，第二天一早收获细菌。
分子克隆中常用的很多大肠杆菌品系都适用于这种方法，如XL-Blue、DH1、JM103、JM108/109、DH5a 和HB101。
材料注息：标记〈！〉试剂的正确操作，请参见附录12。
缓冲液和溶液贮存液、缓冲液和试剂成分请见附录1。
使用时将贮存液稀释至适当浓度。
二甲亚砜DMSO 〈！〉二甲亚砜的氧化产物据推测为二甲硫醚，是转化的抑制物（Hanahan 1985）。
为避免上述问题，应购买高质量的DMSOInoue转化缦冲液（见步骤1)用前置于冰上预冷至0℃。
核酸和寡核苷酸质粒DNA (重组质粒〉构建方法采用本章方案17和22所提供的方法。
dh5a感受态细胞的制备
dh5a感受态细胞的制备DH5α感受态细胞的制备引言：大肠杆菌（Escherichia coli）是一种常见的细菌，也是生物学实验中最常用的模式生物之一。
在分子生物学和基因工程领域，大肠杆菌被广泛用于蛋白质表达、基因克隆、DNA测序等实验中。
其中，DH5α感受态细胞是最常用的一种。
本文将介绍DH5α感受态细胞的制备方法。
一、实验前准备1.1 菌种选取首先需要选择适合自己实验需求的大肠杆菌质粒转化菌株。
DH5α感受态细胞是含有F-质粒（Fertility factor）的E. coli K12株系，具有高度敏感性和高转化效率，广泛应用于基因克隆、DNA测序等领域。
1.2 质粒DNA提取在进行质粒转化前，需要提取所需质粒DNA，并通过琼脂糖凝胶电泳等方法进行检测和纯化。
质粒DNA的提取方法有多种，如碱裂解法、酚/氯仿法等。
1.3 化学试剂准备进行DH5α感受态细胞制备的实验中，需要准备一些常用的化学试剂，如CaCl2、MgCl2、LB培养基等。
二、DH5α感受态细胞的制备方法2.1 菌株处理将DH5α感受态细胞从-80℃冰箱中取出，用无菌吸管取出适量菌液接种到含有LB培养基的50mL离心管中。
在37℃恒温振荡培养器中进行预培养，转速为200rpm，时间为8小时左右。
2.2 转化体系制备将质粒DNA加入到含有CaCl2和MgCl2的转化缓冲液中，并在室温下静置15分钟。
其中转化缓冲液的配方为：10mM Tris-HCl（pH 7.4）、100mM CaCl2、50mM MnCl2、100mM MgCl2。
2.3 转化处理将预培养后的DH5α感受态细胞进行离心处理，去掉上清液。
然后加入转化体系，并在室温下静置30分钟。
之后将样品加热至42℃水浴中进行热激处理，时间为45秒左右。
然后将样品放入冰水中进行冷激处理，时间为2分钟左右。
2.4 恢复处理将转化后的细胞加入到含有LB培养基的离心管中，并在37℃恒温振荡培养器中进行恢复处理，转速为200rpm，时间为1小时左右。
大肠杆菌感受态细胞制备及转化实验反思
大肠杆菌感受态细胞制备及转化实验反思【原创版3篇】目录（篇1）1.实验目的与原理2.实验步骤3.实验结果与分析4.实验反思正文（篇1）一、实验目的与原理大肠杆菌感受态细胞制备及转化实验旨在通过转化方法将外源基因导入大肠杆菌中，从而实现目的基因的表达。
实验原理主要基于重组 DNA 技术，通过外源 DNA 与载体 DNA 的连接，形成重组表达载体，然后将载体转化入大肠杆菌细胞内，使外源基因得以在细胞内表达。
二、实验步骤1.制备大肠杆菌感受态细胞（1）将 500 ml DH5a 的培养物在 LB 中培养至 OD 0.4-0.5（2）将培养瓶在冰浴中摇动 1-2 分钟以预冷细胞（3）将细胞置于无菌预冷离心瓶中，在 5K、4 下旋转 10 分钟（4）弃上清，并将菌液重浮于 1/10 体积 (即 50 毫升) 的冰冷的TSS 中（5）将 05 ml 样品放入预冷的无菌 Eppendorf 试管中，在液氮中快速冷冻。
在一 70C 下储存 KCM 感受态细胞2.转化实验（1）加入 20ul 5XKCM，加入 DNA 和 dd H20 至总体积为 100ul，保持冰上（2）加入 100ul 感受态细胞，混合并在冰上保持 20 分钟（3）37 热激 90 秒（4）向试管中加入 1ml 预热的 LB，在 37 温育 40-60 分钟（5）离心，剩余 50uL 菌体涂布在选择性培养基 (LB-amp/kana) 上。
三、实验结果与分析实验结果主要观察转化后大肠杆菌菌落是否具有抗生素抗性。
将涂布后的培养基在适当条件下培养，观察菌落生长情况。
若菌落生长，说明转化成功；若无菌落生长，则转化失败。
四、实验反思本次实验中，制备感受态细胞及转化过程均较为顺利，但需要注意实验过程中的无菌操作，避免因操作不当导致实验失败。
目录（篇2）1.实验目的与原理2.实验步骤及操作要点3.实验结果与分析4.实验反思与建议正文（篇2）一、实验目的与原理大肠杆菌感受态细胞制备及转化实验旨在通过转化方法将外源基因导入大肠杆菌，从而实现基因的表达和功能研究。
DH5α感受态的制备
E.coli DH5α感受态细胞的制备大肠杆菌DH5α是一种诱变菌株，主要表现对外源DNA的免疫缺乏。
是用于基因工程的菌种，相比于正常菌种缺少了一定的免疫机制。
DH5α菌株是一种能够摄入外源DNA的受容菌，普通的大肠杆菌细胞内有一种“免疫”机制，即当外源DNA侵入时，会产生诸如限制性内切酶类的物质，将外源的DNA剪切掉，而其自身DNA因被修饰（如甲基化）所以不被限制酶识别，不会被剪切。
这样的菌是不能直接用于基因工程的，我们总不希望目的基因导入进去还来不及复制就被剪切掉。
DH5α菌株是一种经诱变的菌株，其基本特性是：Rˉ、Mˉ、AMPˉ。
Mˉ是指DH5α菌株缺乏DNA修饰，即其自身DNA不会被修饰。
Rˉ是指其缺乏“免疫”机制，不会对导入的外源DNA切割。
AMPˉ是指其对氨苄青霉素敏感。
DH5α菌株可以用于制作基因库、质粒克隆等，可用作基因工程的受体菌。
一、实验准备（一）实验材料大肠杆菌E.coli DH5α（二）试剂与耗材LB平板、LB液体培养基、50ml无菌离心管、1.5ml无菌离心管、无菌枪头、0.1M CaCl2、0.1M CaCl2+甘油、过滤器、无菌水。
（三）仪器与设备恒温培养箱、冷冻离心机、制冰机、超净工作台。
二、实验步骤（一）平板制备流程1.将超净工作台的紫外灯打开，将平皿、酒精灯、70%酒精、1000uL枪头放入超净工作台内，对超净工作台进行紫外灭菌30分钟；2.超净工作台灭菌后打开风机至3档并关闭紫外灯，风机运行5分钟后将已灭菌的固体培养基放在超净工作台上；3.准备进行无菌操作时，将70%的酒精喷洒在手套及袖口上和融化好的固体培养基（以不烫手为宜）、抗生素上，然后放入工作台中，待手套上酒精挥发完全后点燃酒精灯；4.将平皿的外包装胶袋拆开，将平皿皿底朝下摆放整齐；5.向培养基中加入一定量所需的抗生素（工作浓度为配置浓度的1/1000，例如300mL的培养基中加入300μL抗生素），轻轻摇匀，不要摇起气泡；若制备无抗平板，则此步骤省略；6.将培养皿放在火焰旁的桌面上，右手拿装有培养基的锥形瓶，左手拔开无菌透气膜；7.右手拿锥形瓶，使瓶口迅速通过火焰；8.用左手将培养皿打开一条稍大于瓶口的缝隙，右手将培养基倒入培养皿中（布满平皿底面积2/3即可），左手立即盖上培养皿的皿盖，轻轻摇匀，使培养基均匀分布在平皿上；9.等待平板冷却凝固（约需20min）后，将平板倒置，使皿盖在下，皿底在上，再将平皿用保鲜袋装好，标明倒板的日期和相应抗性后放入4℃冰箱保存。
大肠杆菌感受态细胞的制备原理、步骤以及重组质粒转化
一、目的1.了解感受态细胞生理特性及制备条件，掌握大肠杆菌感受态细胞制备方法。
2.掌握质粒DNA 转化大肠杆菌的方法，了解转化的条件和利用半乳糖苷酶基因插入失活选择重组质粒DNA 的原理。
二、原理（一）大肠杆菌感受态细胞制备的原理所谓感受态，是指细菌生长过程中的某一阶段的培养物，只有某一生长阶段中的细菌才能作为转化的受体，能接受外源DNA而不将其降解的生理状态。
感受态形成后，细胞生理状态会发生改变，出现各种蛋白质和酶，负责供体DNA 的结合和加工等。
细胞表面正电荷增加，通透性增加，形成能接受外来的DNA 分子的受体位点等。
本实验为了把外源DNA（重组质粒）引入大肠杆菌，就必须先制备能吸收外来DNA分子的感受态细胞。
在细菌中，能发生感受态细胞是占极少数。
而且，细菌的感受态是在短暂时间内发生。
目前对感受态细胞能接受外来DNA 分子的本质看法不一。
主要有两种假说：1、局部原生质体化假说――细胞表面的细胞壁结构发生变化，即局部失去细胞壁或局部溶解细胞壁，使DNA 分子能通过质膜进细胞。
证据有：（1）发芽的芽孢杆菌容易转化；（2）大肠杆菌的原生质体不能被噬菌体感染，却能受噬菌体DNA 转化；（3）适量的溶菌酶能提高转化率。
2、酶受体假说――感受态细胞的表面形成一种能接受DNA 的酶位点，使DNA分子能进入细胞。
证据是：（1）蛋白质合成的抑制剂如氯霉素，可以抑制转化作用；（2）细胞分裂过程中，一直有局部原生质化，但感受态只在生长对数期的中早期出现；（3）分离到感受态因子，能使非感受态细胞转变为感受细胞。
目前对感受态细胞的转化理论尚未有统一结论，但是许多实验室一直进行探索，试图从实验中获得明确回答。
有人根据pBR322 质粒DNA对E・coli K――12X1776菌株的转化结果，认为：近来，在许多研究室都发现CaCl2对受体菌处理，可提高转化效率几十倍，通常把细胞悬浮在pH6.0 的100mmol/L CaCl2中，在冰浴条件下，放置过夜，转化率转高，但一过24小时，转化率测恢复为原来的水平。
大肠杆菌感受态细胞的制备注意事项
大肠杆菌感受态细胞的制备注意事项一、引言大肠杆菌感受态细胞是一种重要的实验材料，用于研究细胞信号转导等生物学问题。
制备感受态细胞需要注意许多事项，本文将从实验前的准备、菌种的选取、培养条件的控制、质量检测等方面进行详细阐述。
二、实验前的准备1. 实验室环境要保持干净卫生，避免灰尘和异味对实验产生影响。
2. 实验器具和试剂要提前清洗消毒，确保无菌状态。
3. 实验人员要做好个人卫生，穿上实验服和手套，并进行必要的消毒处理。
三、菌种的选取1. 选择适合自己实验目的和条件的大肠杆菌品种。
2. 选择优质的菌株，如DH5α或BL21(DE3)等常用品种。
3. 菌株应该保存在低温下，并定期检测其纯度和活性。
四、培养条件的控制1. 培养基应该选择适合大肠杆菌生长和表达蛋白质所需营养物质组成的培养基。
2. 培养温度、pH值、氧气含量等条件应该根据不同的菌株和实验目的进行调整。
3. 需要注意的是，大肠杆菌感受态细胞的制备需要进行诱导，诱导剂类型、浓度和时间等参数也需要进行优化。
五、质量检测1. 感受态细胞的制备应该进行一系列质量检测，包括蛋白质表达水平、纯度和活性等方面。
2. 蛋白质表达水平可以通过Western blot或SDS-PAGE等方法进行检测。
3. 纯度可以通过蛋白质纯化和质谱分析等方法进行检测。
4. 活性可以通过生物活性实验或酶活性分析等方法进行检测。
六、其他注意事项1. 实验过程中要保持细心、耐心和严谨，避免操作失误影响实验结果。
2. 实验数据应该记录详细并及时处理，避免数据丢失或混乱。
3. 实验结果应该经过统计分析并与文献资料进行比较，确保结果可靠和准确。
七、结论大肠杆菌感受态细胞的制备是一个复杂而重要的实验过程，需要注意许多事项。
只有在实验前的充分准备、菌株的选择、培养条件的控制、质量检测等方面做好工作，才能获得高质量的感受态细胞，并为后续研究提供可靠的实验材料。
感受态细胞制备及转化步骤
一感受态细胞的制备（材料：DH5α菌）1.下午三点左右将大肠杆菌接种于培养管中（取冻存的大肠杆菌接种于5ml LB 培养基中或用牙签挑菌培养），以220rpm在摇床上震荡过夜培养。
2.第二天取已经摇好的的菌液50或100ul接种于盛有5mlLB培养基的培养管中，每隔20分钟观察一次（大肠杆菌大约20分钟繁殖一次），2到3个小时后培养基变浑浊，将培养管置于灯光下摇动会出现大肠杆菌的絮状条带，此时培养液的OD600nm≦0.5，细胞数小于10的8次方。
3.将培养好的大肠杆菌倒到1.5ml的eppendorf管中（将菌体混匀后再倒），以10000rpm，离心1min.倒掉上清液后将培养管中的液体混匀后继续倒到eppendorf管中并于冷冻离心机中离心，直至将培养管中的菌液全部离心完毕。
4.倒净上清液后将盛有菌体的eppendorf管置于冰上，加入100ul冰的氯化钙（0.1M）溶液，并将菌体与溶液混合均匀（用手指用力弹），置于冰上静置10min （此时勿忘将氯化钙同样至于冰上保持其冰冷）。
5.将eppendorf管置于冷冻离心机中以8000rpm，离心1min。
6.弃上清后加50ul的氯化钙溶液混合均匀，若有液体溅到eppendorf管壁上可以进行短时离心，此时已制成大肠杆菌的感受态细胞。
大肠杆菌至于冰上备用，或于-80︒C保存。
二转化（transformation）1.另取1.5ml的eppendorf管置于冰上（做好相应标记），将含有感受态细胞的菌液混匀后取10ul的感受态细胞加入到eppendorf管中，随后加入1ul的质粒混匀（用手指肚轻弹），至于冰上静置30min。
2.将离心管置于42摄氏度的水浴锅中1到2min，随后迅速置于冰上，并向离心管中加入500ul LB培养基混匀后置于摇床上震荡培养1小时（37摄氏度，220rpm，使菌体恢复正常生长状态）。
3.用移液枪从离心管中取已经摇好的菌液100ul均匀的加入到相应的选择培养基上，用刮刀将菌液均匀的涂布到培养皿上过夜培养。
大肠杆菌感受态细胞的制备和转化实验报告
大肠杆菌感受态细胞的制备和转化实验报告大肠杆菌感受态细胞的制备和转化实验报告引言：大肠杆菌（Escherichia coli）是一种常见的细菌，广泛应用于生物学研究和基因工程领域。
在这个实验报告中，我们将讨论大肠杆菌感受态细胞的制备和转化实验。
实验目的：本实验的目的是制备大肠杆菌的感受态细胞，并将目标DNA转化到细胞内。
通过这个实验，我们可以研究细菌的基因表达和遗传变异。
实验材料和方法：1. 大肠杆菌培养基：含有适当营养物质的LB培养基。
2. 大肠杆菌感受态细胞：选择性培养基（如含有抗生素的培养基）筛选得到的细菌株。
3. 目标DNA：从其他生物体中提取的DNA片段。
4. 热激转化装置：用于将DNA转化到感受态细胞中的装置。
5. 热激转化条件：将感受态细胞与目标DNA和CaCl2在冰上混合，然后在热激转化装置中进行热冲击。
实验步骤：1. 制备感受态细胞：从大肠杆菌培养基中挑取一小部分细菌，接种到含有适当抗生素的选择性培养基中。
在37摄氏度下孵育过夜。
2. 提取目标DNA：从其他生物体中提取目标DNA片段，可以使用商业提取试剂盒或自制提取试剂进行操作。
3. 转化实验：将感受态细胞取出，进行适当的处理，如洗涤和离心。
将感受态细胞与目标DNA和CaCl2在冰上混合，并在热激转化装置中进行热冲击。
然后将细菌培养在含有抗生素的选择性培养基上。
4. 孵育和筛选：将转化后的细菌培养在含有抗生素的选择性培养基中，以筛选出成功转化的细菌。
在孵育过程中，可以使用PCR或其他方法进行确认。
结果和讨论：通过本实验，我们成功制备了大肠杆菌的感受态细胞，并将目标DNA转化到细胞内。
在筛选过程中，我们观察到在含有抗生素的培养基上生长出了抗性菌落，表明转化成功。
通过进一步的分析，如PCR检测，我们可以确认转化的目标DNA是否存在于细菌中。
这个实验的结果对于后续的基因表达研究和遗传工程应用具有重要意义。
大肠杆菌是常用的宿主细胞，可以用于大量表达外源蛋白和合成重组蛋白。
大肠杆菌感受态细胞的制备原理、步骤以及重组质粒转化
一、目的1.了解感受态细胞生理特性及制备条件，掌握大肠杆菌感受态细胞制备方法。
2.掌握质粒DNA 转化大肠杆菌的方法，了解转化的条件和利用半乳糖苷酶基因插入失活选择重组质粒DNA 的原理。
二、原理〔一〕大肠杆菌感受态细胞制备的原理所谓感受态，是指细菌生长过程中的某一阶段的培养物，只有某一生长阶段中的细菌才能作为转化的受体，能承受外源DNA而不将其降解的生理状态。
感受态形成后，细胞生理状态会发生改变，出现各种蛋白质和酶，负责供体DNA 的结合和加工等。
细胞外表正电荷增加，通透性增加，形成能承受外来的DNA 分子的受体位点等。
本实验为了把外源DNA〔重组质粒〕引入大肠杆菌，就必须先制备能吸收外来DNA分子的感受态细胞。
在细菌中，能发生感受态细胞是占极少数。
而且，细菌的感受态是在短暂时间发生。
目前对感受态细胞能承受外来DNA 分子的本质看法不一。
主要有两种假说：1、局部原生质体化假说――细胞外表的细胞壁构造发生变化，即局部失去细胞壁或局部溶解细胞壁，使DNA 分子能通过质膜进细胞。
证据有：〔1〕发芽的芽孢杆菌容易转化；〔2〕大肠杆菌的原生质体不能被噬菌体感染，却能受噬菌体DNA 转化；〔3〕适量的溶菌酶能提高转化率。
2、酶受体假说――感受态细胞的外表形成一种能承受DNA 的酶位点，使DNA分子能进入细胞。
证据是：〔1〕蛋白质合成的抑制剂如氯霉素，可以抑制转化作用；〔2〕细胞分裂过程中，一直有局部原生质化，但感受态只在生长对数期的中早期出现；〔3〕别离到感受态因子，能使非感受态细胞转变为感受细胞。
目前对感受态细胞的转化理论尚未有统一结论，但是许多实验室一直进展探索，试图从实验中获得明确答复。
有人根据pBR322 质粒DNA对E・coli K――12X1776菌株的转化结果，认为：近来，在许多研究室都发现CaCl2对受体菌处理，可提高转化效率几十倍，通常把细胞悬浮在pH6.0 的100mmol/L CaCl2中，在冰浴条件下，放置过夜，转化率转高，但一过24小时，转化率测恢复为原来的水平。
工程菌DH5α感受态细胞的制备及质粒pGEM的转化研究
工程菌DH5a感受态细胞的制备及质粒pGEM的转化研究杜祯,马海利,陈瑞芳(山西农业大学,太谷 030801)摘要:绿色荧光蛋白(g reen fluo rescent pr otein,G FP)是源于海洋生物多管水母属(aequoia v icto ria)的一种发光蛋白,能够自身催化形成生色团并在蓝光激发下发出绿色荧光,能在活细胞内稳定表达,本试验首先从含有G FP的大肠杆菌中提取质粒,并利用胶回收试剂盒纯化质粒,采用氯化钙法将工程菌D H5a制成感受态细胞,然后将纯化后的质粒转入已制备好的感受态细胞中,使得工程菌DH5a转化成具有抗氨苄青霉素的大肠杆菌,并表达绿色荧光蛋白,接种于加氨苄青霉素的LB培养基上,筛选阳性克隆。
关键词:G FP;工程菌D H5a;质粒pG EM中图分类号:S852.61+2 文献标识码:A 文章编号:1671-7236(2007)05-0088-03 质粒pG EM是一长度为4.7kb的环形DNA,在其序列中有一编码绿色荧光蛋白的基因,它所表达的绿色荧光蛋白(g reen fluorescent protein, GFP)是源于海洋生物多管水母属(aequoia victori-a)的一种发光蛋白,能够自身催化形成生色团并在蓝光激发下发出绿色荧光,能在活细胞内稳定表达。
在pGEM的序列结构中有来自大肠杆菌T7及T3噬菌体(Studier等,1981;Davanlo o等,1984;Tabor 等,1985)的强启动子下游装置多克隆位点,组建成质粒载体(pGEM)就有可能合成高比活度的单链DNA探针。
工程菌株DH5a是实验室常用的一个宿主菌,常被用于质粒克隆和原核表达研究,本试验旨在研究该菌株的感受态细胞制备以及转化活性如何,为今后相关工作的开展,摸索条件。
大肠杆菌感受态细胞的制备和转化,是动物基因工程中最基本的试验技术,也是利用大肠杆菌介导法进行动物转化的重要前提,而感受态细胞制备的质量直接影响其转化率。
大肠杆菌DH5a感受态细胞转化率的改进
大肠杆菌DH5α感受态细胞转化率的改进桓明辉摘要：针对实验材料E．coli DH5α，对该茵株在不同生长时期的转化效率进行测定，确立了一个能制备高转化率感受态细胞的实验方案。
结果表明：在细茵的生长繁殖过程中，其转化率有很大变化；结果：得到了E．coil DH5α茵株制备感受态细胞的最佳条件。
关键词：大肠杆茵；感受态；转化率DH5a是一种常用于质粒克隆的菌株。
E.coli DH5a在使用pUC 系列质粒载体转化时，可与载体编码的β－半乳糖苷酶氨基端实现α－互补，可用于蓝白斑筛选鉴别重组菌株。
感受态细胞的制备和转化是分子生物学实验室频繁使用的一项重要的常规操作。
对细菌而言，为达到高效转化，活细胞数务必少于l08细胞／m1。
对于大多数E.coli来说，相当与OD600为0.4左右，但由于转化是一个很复杂的过程，具体的作用机理仍在探究中。
有文献指出[1]，细菌的最佳感受态细胞制备期对于不同菌株是不同的，并不一定都是在活细胞浓度为l08细胞／ml的时候最适宜，有必要针对所使用的菌株确定其最佳转化条件。
1 材料与方法1.1 材料与试剂菌株与质粒：E．coli DH5α，pUC18质粒由本实验室保存。
X-gal，IPTG，LB培养基，氨苄青霉素溶液，0.1 mol／L CaCl2溶液，均按《分子克隆实验指南》的要求配制。
1.2 方法1.2.1大肠杆菌生长情况的测定：从平板上挑取单个菌落(直径2～3 mm)到含有30ml LB培养基的锥形瓶中，37℃下250 r／min培养过夜。
取出0.3 ml培养物到含有l5 ml LB培养基的摇菌试管中，继续振荡培养，每隔20 min 取出一支摇菌试管，放于冰箱．统一测定菌液的OD600，绘制生长曲线。
选取几个不同时相的菌液倍比稀释从lO-1～lO-6，各取0.1 ml 稀释液涂布LB平板培养基，37℃正向培养1 h后，倒置培养l2～16 h。
每个稀释度铺3个平板，计数，作OD600一活菌细胞浓度图。
大肠杆菌DH5a使用说明
E.coli Competent CellsDH5α使 用 说 明 书Takara Code : D9057A 包 装 量 Competent Cells DH5α 100 μl × 10 支 Control DNA （pUC19，0.1 ng/μl ） 10 μl × 1 支 保 存 : -80℃ 制品说明 感受态细胞（Competent Cells ）是一种具有摄入外源DNA 能力的受容菌，它可以摄取外源的质粒DNA 等。
在进行基因重组实验时，使用感受态细胞的转化实验应用十分广泛。
在制作基因文库、重组质粒体以及进行亚克隆实验时，特别是在目的基因含量十分低的情况时，使用高效的感受态细胞显得十分重要。
Takara 公司在Hanahan 方法的基础上进行了改良，制备出了高效的感受态细胞（都为EK1系列的宿主大肠杆菌）。
Genotype F -,φ80d lac Z △M15, △(lacZYA-argF )U169, deoR , recA 1, endA 1, hsdR 17(r k -,m k + ), phoA , supE 44, λ-, thi -1, gyrA 96, relA 1 细胞种类 α-互补性选择宿主 E.coli DH5α E.coli DH5α在使用pUC 系列质粒载体进行DNA 转化时，由于载体DNA 产生的LacZ α多肽和DH5α编码的lacZ △M15相结合，从而显示β-半乳糖苷酶活性（α-互补性）。
利用这一特性，可以很容易鉴别重组体菌株。
DH5α可以用于制作基因库、进行亚克隆等，由于DH5α具有decR 变异，可以作为较大质粒的宿主菌使用。
细胞浓度 : 1～2×109 Bacteria/ml 质量标准 1. 使用1 ng 的质粒DNA 进行转化时： 100 μl Competent Cells DH5α/1 ng pUC19 Plasmid 进行转化时产生的菌落＞1×108 transformants/1 μg pUC19 Plasmid 2. β-半乳糖苷酶、α-互补性的确认 对E.coli Competent Cells DH5α使用pUC19 DNA 进行转化后，在含有100 μg/ml 的Ampicillin 、40 μg/ml 的X-Gal 的L-琼脂平板培养基上，产生蓝色菌落。
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感受态细胞的制备（DH5α）
一、准备工作
所有试剂、容器均需提前预冷。
1、实验器械
4℃离心机（50ml离心管），37℃恒温箱，37℃摇床，超净台（使用前需要紫外消毒15min 至少）；0.22μm的滤器2个（过滤灭菌TfB2种溶液），10ml注射器2个；冰盒；高压灭菌的1.5mlEP管1盒，与离心机配套的50ml离心管6个（高压灭菌），高压灭菌的500ml 锥形瓶2个，高压灭菌的100ml玻璃瓶2个，高压灭菌的1ml枪头和200μl枪头各一盒。
2、试剂配制（甘油特别难吸，用蓝枪头慢慢吸吧）
① LB平板：单纯LB平板，加有amp或有kana的（制板时需标注好类型，时间）。
② SOB培养基（Super Optimal Broth）
③ TfBⅠ：（100ml制备量）分别称取乙酸钾0.294g，MnCl2 0.99g，KCl 0.146g，CaCl2
0.111g，置于200ml烧杯中，加入15ml甘油和85mlDDW，摇晃，使其全部溶解。
然后在安全橱中用孔径为0.22μm的滤器过滤混合液，置于高压灭菌的100ml玻璃瓶中，4℃保存，使用前必须预冷。
（装在50ml离心管，封口4度保存）
④ TfBⅡ（20ml制备量，每次现用现配，装在50ml离心管）：分别称取MOPS 0.046g，CaCl2
0.167g，KCl 0.015g，置于50ml烧杯中，加入3ml甘油和17mlDDW, 摇晃，使其全部溶解。
然后在安全橱中用孔径为0.22μm的滤器过滤混合液，使用前必须预冷。
配制量 1 L
配制方法 1.配制250 mM KCl溶液。
（50ml离心管分装）
在90 ml的去离子水中溶解l.86 g KCl后，定容至100 ml。
2.配制2 M MgCl2溶液。
（50ml离心管分装）
在90 ml去离子水中溶解4.06g MgCl2 6H2O后，定容至100 ml，高温高压灭菌。
5.量取10 m1 250 mM KCl溶液，加入到烧杯中。
6.滴加NaOH小块，调节pH值至
7.0。
7.加入去离子水将培养基定容至l L。
8.高温高压灭菌后，4℃保存。
9.使用前加入5 ml灭菌的2 M MgCl2溶液。
LB培养基
配制量 1 L
配制方法
3.滴加固体NaOH，调节pH值至7.0。
4.加去离子水将培养基定容至1 L。
5高温高压灭菌后，4度保存。
二、实验步骤
1、第一天：下午3点取出-80°的感受态细胞DH5a，冰浴，用枪头沾一点（就可以带出很多细菌，剩余的不要了），在500ul的LB液体培养基中吹打（轻柔），取50ul至另一个500ul 的LB中再稀释，取100ul涂板。
37度恒温箱培养过夜约16h（具体时间观察单克隆，可以顺利挑菌就行）。
2、第二天早上，观察是否长出单个菌落，菌落大小合适时，向2个无菌的摇菌管分别加入
5ml高压过的SOB培养液，标注为对照管和DH5α管。
从LB平板上挑取单个菌落加入DH5α管中，220rpm，37℃，5h，OD550达0.3，将5mlSOB倒入100mlSOB，37度，220rpm，
3.5h后，OD550达0.36（T43.7%），取出冰上放置5min；
3、将100ml菌液转入两个离心瓶中（平底），spin 3K,5’,4℃，倒净上清，倒置于
吸水纸上吸干剩余上清。
之后步骤必须冰上进行，盐处理细胞后，操作轻柔;
4、每管加入20ml TbfI 重悬，轻柔操作，冰上放置5’, spin 3K,5’,4℃。
倒去上清，
并倒置于吸水纸上;
5、每管加入2ml Tbf ll 重悬，轻柔操作，冰上放置15’;
6、每管50ul 分装。
液氮速冻，-80度储存，标明制作日期，细菌种类;
7、留出一管做鉴定，分别直接涂布阴性，含AMP，含Kana的板子；再分别转化抗AMP和抗
Kana的质粒，分别涂布含AMP，含Kana的板子，第二天验证感受态状态。
8、正常感受态在阴性板子中长，在含AMP，含Kana的板子中不长；转化抗AMP和抗Kana
的质粒后分别后分别在含AMP，含Kana的板子中生长。
（每个都需涂2个板，含AMP，含Kana的板子）。