遗传实验2-2 粗糙链孢霉生活史及
粗糙链孢霉的杂交实验—遗传学实验
取一载玻片，用解剖针将子囊果挑出放到载玻片上， 加1-2滴水，再盖上另一载玻片，用力压片，使子囊充 分压散而末破裂，最后在显微镜下观察、记录各种类型 子囊的数目。
粗糙链雹霉lys+与lys-杂交子囊孢子的排列方式 图中（1）（2）为非交换型；（3）（5）（6）缺少（4）为交换型子囊
作业
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实验八 粗糙链孢霉的杂交
一、实验目的
1、了解顺序四分体的遗传分析方法 2、掌握重组值的计算及着丝粒作图的方法 3、观察由于基因转换引起的异常分离现象
二、实验原理
粗糙链孢霉，又称红色面包霉，在分类学上属于真菌中 的子囊菌纲、球壳目、脉孢菌属。
利用粗糙链孢霉进行遗传学分析有如下优点： ① 个体小，生长快，容易培养； ② 有性繁殖可产生大量后代； ③ 无性世代是单倍体，基因型可直接反映在表型上； ④ 一次杂交可达到高等二倍体一次杂交和一次测交的目的
粗 糙 链 孢 霉 的 生 活 史
从交换型子囊数占总子囊数的百分比， 可以计算出该基因与着丝点间的交换值：
第二次分裂分离自囊数 子囊总数
1 100％ 2
三、实验材料、用具及药品
• 粗糙链孢霉：野生型（lys+）菌株，赖氨酸缺陷型（lys-） 菌株。
• 用具：酒精灯、试管、培养皿、载玻片、镊子、接种针、 解剖针、滤纸、显微镜等 。
• 药品： 75%酒精
四、实验步骤
1、菌种活化
把野生型和缺陷型菌种分别斜面接种到试管培养基上， 置于28℃恒温培养箱中培养5-7天，直至菌丝上部有分生孢 子产生，长好的菌株在菌丝上部可见红粉状孢子。
2、杂交培养基的配制：
将浸软的玉米粒剪碎，每试管2-3粒，加入3毫升2% 的琼脂，再放入经多次折叠的滤纸。加上棉塞，消毒 即可。
第八章 真菌的基因
• ④无性世代是单倍体，没有显隐性，基因型可以 直接在表型上反映出来； • ⑤一次只需分析一个减数分裂的产物，就可以观 测倒遗传结果，简单易行，而二倍体合子是两个 不同减数分裂产生的配子相互结合的结果，需要 通过测交实验才能分析减数分裂的结果，手续麻 烦。 • 因此粗糙链孢霉是进行基因分离和连锁交换遗传 分析的好材料。
第九章 真菌的基因重组和遗传 分析
第一节 顺序四分体分析(tetrad analysis)：
• 顺序四分子分析(tetrad analysis)：
– 指根据一个子囊中四个按严格顺序直线排列的 四分子(或其有丝分裂产物子囊孢子)表现进行 的遗传分析，也称为直列四分子分析。
一、 粗糙链孢霉的遗传分析
四、粗糙链孢霉的连锁与交换(P184)
nic+：烟酸缺陷型
+ade：腺嘌呤缺陷型
• 着丝粒与nic的重组值 =（5+90+1+5）/1000/2=5.05% • 着丝粒与ade的重组值
=（90+90+1+5）/1000/2=9.30%
四、粗糙链孢霉的连锁与交换
• nic与ade的重组值 = NPD+1/2T 总子囊数 = （1+1）+1/2 （90+5+5）/1000=5.2%
二、粗糙链孢霉的生活史
• 无性繁殖过程，由菌丝顶端断裂形成分生孢子。分 生孢子有两种，小型分生孢子中只含有一个核，大 型分生孢子有几个核。分生孢子萌发成菌丝，可以 再生成分生孢子，周而复始（见下图）。
粗糙链孢霉
• 在有性生殖过程中，粗糙链孢霉的菌株有两种不同 接合型(mating type)，它们受一对等位基因控制。 不同接合型菌株的细胞接合产生子囊果及子囊孢子。
生科院遗传学-实验报告
实验成绩汇总表第一次实验实验日期：2022年10月21日实验成绩：实验名称：果蝇的形态、生活史观察及杂交实验维生素、维生素Ｄ、脂肪、粗纤维素、碳水化合物、矿物元素及微量元素２等，同时还含有丰富的酶系统和生理活性物质，果蝇喜甜食且葡萄糖能增加酵母活性。
实验操作：A溶液不断搅拌煮沸；B溶液玉米粉和水加热搅拌均匀后再加酵母粉煮沸。
A、B溶液再合到一起煮沸，待其降温至５０～６０℃时再加0.5 mL丙酸，待培养基冷却至室温后，再分装到各培养管中（每管约3mL）。
灭菌：将分装好的培养基置于高压蒸汽灭菌锅中，103.4 kPa ，121℃，灭菌20 min，冷却后置于－２０℃冰箱保存备用。
注意事项：1.A溶液加热过程中不断搅拌，以防琼脂在底部结块。
2.酵母菌加入后，加热的时间必须尽量缩短，避免酵母菌失活；丙酸必须待其降温至５０～６０℃时再加入，避免丙酸的挥发。
3.分装培养基时要一次性垂直分装到管底，不能污染到管壁、管口。
4.培养管内应晾至表面无水层、管壁无水滴再置于－２０℃冰箱保存备用。
（三）野生型果蝇的采集取一个清洁玻璃容器放入腐烂的香蕉，用纱布罩住容器口，在纱布上开几个2〜3 mm 见方的孔，将容器置于室外。
2〜3 d 后即可采集到野生型果蝇，放入冰箱冷冻室（-20℃）冷冻约2 min，待果蝇全部被麻醉之后，再转移到培养管内。
（四）接种将新培养管与装有果蝇的培养管口对口垂直放置。
其中，装有新鲜培养基的培养管倒扣在上方，打开培养管塞后应迅速对好2个管口，将对好的2个培养管翻转，使新培养管位于下方，轻顿几下，待全部果蝇落入新培养管注明两亲本的基因型及交配日期。
7~8天后清空亲本，待F1成蝇羽化后逐日观察、计数对应表型个体数（可靠的计数及观察是培养开始的20天以内，再晚可能有F2了）若须继续试验、观察F2，可从F1内挑出雌雄蝇5-10对另瓶培养。
单因子杂交杂交实验步骤：1、选处女蝇：每两组做正、反交各1瓶，正交选野生型，红眼为母本，反交选突变型白眼为母本，将母本旧瓶中的果蝇全部麻醉处死，在8-12h内收集处女蝇5只将处女蝇和5只雄蝇转移到新的杂交瓶中，贴好标签，于25℃培养。
十二粗糙链孢霉的杂交
非交换型 交换型
计算交换值：
交换型子囊数
1
交换值 = ————————×——×100%
观察到的子囊总数 2
显微镜观察结果
注意事项
1．实验用过的接种针要过火灭菌。 2．镊子放入次氯酸钠中浸泡5分钟洗净。 3．三角瓶中的液体要煮沸5分钟后，才能
粗糙链孢霉的生殖方式有无性繁殖和有性繁殖 两种。
实验原理
在粗糙链孢霉中，一次减数分裂产物包含在一 个子囊中，所以很容易看到一次减数分裂所产 生的四分体中一对基因的分离，从而直观的证 明基因的分离。同时，由于一个子囊中间的空 间很小，8个子囊孢子依次紧密排列在其中， 就可以测定着丝粒距离并发现基因转变。若两 个亲代菌株有某一遗传性状的差异，那麽杂交 形成的每一个子囊孢子属于一种类型，它们的 分离比例是1：1，而且子囊孢子按一定顺序排 列。
2．杂交
用接种针把两个不同接合型的链孢霉的菌株的 分生孢子，各少许接种同一管的培养基斜面上， 此过程应在严格的无菌操作下进行，接种后放在 25℃培养，直到斜面上出现肥满的黑色子囊果， 子囊果在低温下可长期保存。此外，并非所见的
方法和步骤
3．子囊孢子分离和交换的观察 将成熟的子囊果从培养基中小心挑出，放于
滴有1-2滴5%次氯酸钠溶液的载玻片上（若附 着分生孢子太多可先在5%次氯酸溶液中洗去）， 再放上一片载玻片轻轻一压将子囊果压碎，使 里面的许多子囊彼此分开，就可在解剖镜下八 个子囊孢子的分离和有规律的排列。
粗糙脉孢霉四分子遗传分析
真菌类的遗传分析————四分子分析与作图一粗糙脉孢霉的性质与生活史（一）粗糙脉孢霉的性质粗糙脉孢霉( Neurosporocrassa ) 属于真菌中的子囊菌纲，是低等的真核生物。
每一菌丝细胞中含有几十个细胞核。
是遗传分析好材料:1子囊孢子是单倍体，其表型直接反应其基因型。
2 一次只分析一个减数分裂的产物。
3体积小，易培养，繁殖快，一次杂交就能产生大量的后代，便于获得正确的统计学结果。
4能进行有性生殖，其染色体的结构和功能类似于高等动植物。
5 更加重要的是，子囊孢子在子囊中的线性排列顺序与减数分裂中期染色体在赤道板两侧的排列顺序相同，这就是粗糙脉孢霉成为了遗传分析的好材料。
（二）粗糙链孢霉的生活史粗糙链孢霉有有性生殖和无性生殖。
二 顺序四分子与遗传分析 （一）顺序四分子 (ordedtetrad)粗糙脉霉菌减数分裂的四个产物保留在一起，称为四分子。
但是，在分裂的过程中子囊的外形比较狭窄，以至分裂的纺锤体不能重叠，只能纵立于它的长轴中，这样所有分裂后的核――８个子囊孢子都是从上到下排列成行，所以，脉孢菌减数 分裂所产生的四分子是属于顺序四分子(ordedtetrad)。
可推知：第一对子囊孢子来自一条染色单体，第二对孢子则是来自这条染色单体的姊妹染色单体; 第三和第四对子囊孢子是来自前一条染色体同源染色体的姊妹染色单体。
无性孢子——分生孢子 有性孢子——子囊孢子这种顺序四分子在遗传分析上有很多优越性:(1). 可以把着丝粒作为一个座位(locus)，计算基因与着丝粒的重组率，即着丝粒作图。
(2). 子囊中子囊孢子的对称性，证明减数分裂是一个交互过程，而非单向过程。
(3).可以检验染色单体的交换有否染色单体干涉现象，还可利用它来进行基因转变(gene conversion)的研究。
(4).证明双交换不仅可以包括4线中的两线, 而且可以包括3线或4线双交换。
（二）着丝粒作图与遗传分析利用四分子分析法，测定基因与着粒间的距离称为着丝粒作图。
粗糙链孢霉顺序四分子分析
粗糙链孢霉顺序四分子分析Analysis of the Neurospora crassa’s ordedtetrad摘要：本实验通过菌种活化、杂交、显微镜观察等方法对粗糙链孢霉的顺序四分子进行遗传分析，从而达到以下目的：1、了解粗糙链孢霉的生活周期及生长特性；2、通过对粗糙链孢霉杂交后代的表型分析，掌握顺序四分子的遗传学分析方法；3、通过有关基因的着丝粒作图，进一步理解基因的分离和连锁交换定律。
Abstract：This experiment by strains of activation, hybridization, microscope observation and other methods of rough chain spore mould order four molecular genetic analysis, so as to achieve the following objectives:1 and understand the life cycle of the rough chain spore mould and growth characteristics;2, through the rough chain spore mildew hybrid offspring phenotype analysis, grasp the sequence of four molecular genetics analysis method;3, through the relevant genes centromere mapping, separation of further understanding the genetic chain and exchange law.关键词：顺序四分子，连锁交换定律，基因转换，第一次减数分裂，第二次减数分裂Key words：Ordedtetrad，Chain exchange law，Gene conversion，First division segregation，Second division segregation前言：粗糙链孢霉( Neurospora crassa ) 又称红色面包霉，属于真菌中的子囊菌纲、球壳目、脉孢菌属，目前已知4～5种。
实验十粗糙链孢霉的分离和交换
粗糙链孢霉的分离和交换
• (a)成熟的子囊果； • (b)散开的子囊
5.着丝粒作图
• 交换值=（交换型子囊数/观察到的子囊 总数）×1/2×100%
五、作业及思考题
• 1.高等动、植物的有性生殖和基因交换与 粗糙链孢霉有什么异同？
• 2.根据实验统计结果，绘出粗糙链孢霉 lys基因与着丝粒的连锁图。
• 3.什么是极化子模型？在粗糙链孢霉的杂 交过程中应主意哪些问题？
实验十 粗糙链孢霉的分 离和交换
一、实验目的
• 学习粗糙链孢霉的培养方法和杂交技术。 • 了解粗糙链孢霉的生活史。 • 通过对链孢霉杂交产生的子囊孢子的统
计分析，验证遗传学的基本规律，掌握 有关基因的着丝粒距离的计算和作图。
二、实验原理
• 链 孢 霉 的 四 分 子 （ ordered tetrad）分析涉及到其减数分 裂过程中的重组、交换的整 个过程，两种不同接合型 （mating type）的个体产生 的短暂二倍体进行的减数分 裂形成了4个单倍体的细胞。 根据在同源染色体联会时有 无非姊妹染色体的交换，带 有基因标记的子囊孢子可以 直接显现出来，因此是遗传 分析工作中的有用工具。
2.菌株活化
• 把野生型及缺陷型的 菌株从冰箱中取出， 分别接种到相应的培 养基上进行扩大培养， 通常28℃温箱培养5 天左右。注意接种要 严格在超净工作台上 进行无菌操作，以防 细菌和其他真菌的感 染
3.接种杂交
• 无菌条件下取野生型和缺陷型的少许菌丝接种到同 一试管的杂交培养基上。
• 在杂交培养基中放入一张灭菌的滤纸，分别把两种 菌株接在滤纸的两侧以便于杂交成功后收获子囊果。
三、实验材料
• 粗糙链孢霉的野生型菌株（Lys+,接合型 A）、赖氨酸缺陷型菌株（Lys-，接合型 a）
实验十三 链孢霉四分子分析
实验十三链孢霉四分子分析实验十三链孢霉四分子分析(,学时)一、教学基本要求:1、了解粗糙脉孢菌的生活周期及特性。
2、学习顺序四分子的遗传学分析方法二、教学内容:〖目的和要求〗要求学生加深了解顺序四分子分析的原理和方法，增加链孢霉杂交的感性认识，并能进行有关基因的着丝粒距离的计算和作图。
从而正确认识和验证分离和交换定律，并了解基因转变现象。
〖实验原理〗1、原理:基因分离——第二次减数分裂分离。
1交换型子囊数，8，，，重组型配子数2重组值,，100%,，100%总的配子数总的子囊数，8，，交换型子囊数,，50%总的子囊数，，9，5，10，16,，50%,7.3%274〖实验目的〗通过对粗糙链孢霉赖氨酸缺陷型和野生型杂交所得后代的表现型的分析，了解顺序排列的四分体的遗传学分析方法，进行有关基因的着丝粒距离的计算和作图。
〖实验材料〗+,1(粗糙链孢霉野生型菌株，Lys,接合型。
-2(粗糙链孢霉赖氨酸缺陷型菌株，Lys，接合型a。
〖实验器具和药品〗1(器具:显微镜，钟表镊，解剖针，接种针，载波片，试管，培养皿。
2(培养基(1)基本培养基(野生型可生长，缺陷型不能生长):50倍浓度的贮存液，，,2HONaCHO,2HO236572 柠檬酸钠 125克KHPO24 250克NHNO43 100克MgSO,7HO42 10克CaCl,2HO22 5克生物素溶液(5毫克/100毫升) 5毫升微量元素溶液,HO柠檬酸2500克,2,ZnSO,HO75.00克42,,Fe，，，，NHSO,HO61.00克44222,CuSO,HO50.25克,425毫升,MnSO,HO0.05克42,,HBO0.05克33,,NaMoO,2HO0.05克242,蒸馏水100毫升,氯仿 1毫升蒸馏水 1000毫升氯仿(防腐) 2-3毫升用前稀释贮存液，再加1.5%的蔗糖，PH5.8。
如加2%琼脂，即成基本固体培养基。
(2)补充培养基:在基本培养基上补加一种或多种生长物质，如氨基酸、核酸碱基、维生素等。
粗糙脉孢菌顺序四分子遗传分析
粗糙脉孢菌顺序四分子遗传分析摘要：了解粗糙脉孢菌的生活周期及特性；通过对粗糙脉孢菌的赖氨酸缺陷型和野生型杂交所得后代的表型分析，学习顺序四分子的遗传学分析方法，进行有关基因与着丝粒距离的计算和作图。
关键词：粗糙脉孢菌；顺序四分子；交换型；非交换型；图距。
Abstract:understand the life cycle and features of neurospora crassa;Through phenotype analysis to hybrid offspring of the neurospora crassa lysine defect type and wild type, Learning order four molecular genetic analysis method and related genes and centromere distance calculation and drawing.Key word:neurospora crassa. Fourth order; Exchange type; The exchangetype; From figure.前言：粗糙脉孢霉(Neurosporocrassa)属于真菌中的子囊菌纲，是低等的真核生物。
每一菌丝细胞中含有几十个细胞核。
是遗传分析好材料:1)子囊孢子是单倍体，其表型直接反应其基因型。
2)一次只分析一个减数分裂的产物。
3)体积小，易培养，繁殖快，一次杂交就能产生大量的后代，便于获得正确的统计学结果。
4)能进行有性生殖，其染色体的结构和功能类似于高等动植物。
5)更加重要的是，子囊孢子在子囊中的线性排列顺序与减数分裂中期染色体在赤道板两侧的排列顺序相同，这就是粗糙脉孢霉成为了遗传分析的好材料。
粗糙链孢霉的生活史:粗糙链孢霉有有性生殖和无性生殖。
无性世代（单倍体世代）：菌丝体→分生孢子→菌丝体。
粗糙脉孢菌生殖方式有性世代（双倍体世代）：一个交配型的分生孢子落在另一交配型原子囊壳受精丝上，从而进入原子囊（子实体），进行多次有丝分裂，形成多个单倍体核，这些单倍体核与子实体中的单倍体核融合，形成多个二倍体核，然后进入减数分裂，每个二倍体核形成4个单倍体核，再进行一次有丝分裂，形成8个核，最后形成为一个子囊中的8个子囊孢子。
第四章连锁与交换定律2
MⅡ×1/2
nic
5.05 9.3
ade
nic
5.05 9.3
ade
2017/2/25
第三，它们在同一条染色体臂上，重组百分率只有4.25%。
2017/2/25
如果nic和ade连锁，其重组百分率用重组孢子数／ 总孢子数100的公式来计算。有208个重组孢子对， 重组百分率为：
2017/2/25
原位杂交的步骤
制备中期染色体
DNA原位变性 变性 放射性或非放射性标记探针 杂交（在载玻片上）
洗膜
检测 放射性标记：放射自显影 非放射性标记：荧光染料与抗体或蛋白结合 结合染色体形态进行基因定位
记录杂交信号
2017/2/25
荧光原位杂交（florescence in situ hybridization， FISH） 用特殊荧光素（dig或Biotin）标记探针DNA（Nick translation 标记法），变性成单链后与变性后的染 色体或细胞核靶 DNA 杂交。在荧光显微镜下观察并记 录结果。 FISH 优点：可用来作基因或特定DNA片段的染色体区 域定位。 缺点：必须在已知探针的情况下方可进行。
分离模 式
MⅠ MⅠ
子囊类 别
子囊数
PD
808
NPD
1
T
90
T
5
PD
90
NPD
1
T
5
1、亲二型（parental ditype PD)，2种基因型，都为亲型，包括①和② 2、非亲二型（non-parental ditype，NPD)：2种基因型，都为重组型， 包括②和⑥。 3、四型（tetratype,T)：4种基因型，2亲本2重组，包括③、④和⑦
遗传实验2-2粗糙链孢霉生活史及
05 数据记录与分析 详细记录实验数据，ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ进行分析和总结。
04
实验结果和数据分析
实验结果
01
02
03
实验组1
在适宜条件下，粗糙链孢 霉生长良好，菌落形态正 常，颜色为灰白色。
实验组2
在不适宜条件下，粗糙链 孢霉生长受到抑制，菌落 形态变小，颜色为浅灰色。
对照组
未添加粗糙链孢霉的培养 基上未观察到任何菌落生 长。
生活史
无性繁殖
粗糙链孢霉通过无性繁殖产生分生孢子进行生殖，分生孢子在适宜的条件下萌发 形成新的菌丝。
有性生殖
粗糙链孢霉在某些条件下可以完成有性生殖，产生有性孢子。有性孢子的形成需 要两个不同性别的细胞结合，经过减数分裂产生单倍体核，再经过配对和分裂形 成有性孢子。有性孢子的萌发需要适宜的条件才能形成新的菌丝。
03
实验材料和方法
实验材料
粗糙链孢霉（Neurospora crassa）：作为实验材料， 粗糙链孢霉是一种常见的真菌，具有易于培养和遗传 操作的特点。
培养基：用于培养粗糙链孢霉的培养基有多种，如 玉米粉琼脂培养基、麦芽汁琼脂培养基等，可根据 实验需求选择适合的培养基。
显微镜、玻璃器皿、滤纸等实验器材：用于观察、 分离和培养粗糙链孢霉。
生殖方式
粗糙链孢霉通过无性繁殖产生 分生孢子进行生殖，每个分生 孢子可萌发形成新的菌丝。
生活环境
温度
粗糙链孢霉适宜在温暖的环境中生长，最适温度为2530℃，在10℃以下或35℃以上生长缓慢或停止生长。
湿度
粗糙链孢霉需要相对较高的湿度，一般在70%以上 的相对湿度下生长较好。
光照
粗糙链孢霉的生长不需要光照，黑暗条件有利于菌 丝的生长，而光照条件下有利于分生孢子的形成。
丝状真菌的遗传培训课件
丝状真菌的遗传
21
交换类型 无交换
四线 双交换
单交换
染色体图象 重组 四分子类型 子囊型
＋a
＋a , ＋a , n＋ , n＋
0%
①
n＋
(PD)
＋a
100% ＋＋, ＋＋ , na , na
②
n＋
(NPD)
＋a
50% ＋＋ , ＋a , n＋ , na ③
n
＋ 丝状真菌的遗传
(T)
22
交换类型 二线 双交换
丝状真菌的遗传
15
着丝粒作图(centromere mapping)
利用四分子分析法，测定基因与着丝粒 之间的距离。
链孢霉的野生型又称为原养型(prototroph)，
子囊孢子按时成熟呈黑色。
营养缺陷型(auxotroph)，只能在完全培养基上生长，
成熟较慢，子囊孢子呈灰白色。
prototroph
丝状真菌的遗传
第一节 粗糙链孢菌的遗传分析
• 生活史 • 四分体遗传分析 • 随机孢子遗传分析
丝状真菌的遗传
2
粗 糙 链 孢 霉 的 生 活 史
丝状真菌的遗传
3
生活史
图5-9红色链孢霉的生活史(引自Russell,1992)
丝状真菌的遗传
4
遗传分析
生殖方式
• 无性世代 ：
菌丝体→ 分生孢子 →菌丝体
n＋
(T)
资料分析：
1. 计算nic与着丝粒之间的重组率：
交总换子型囊子数囊12数总M 子2 囊数12
（4）（ 总5） 子 （6囊 ）（ 数7）12
590151 1000 2
5.05%
丝状真菌的遗传
遗传实验粗糙链孢霉生活史及-文档资料
红色链孢霉性状遗传杂交实验结果
子囊类型
非交换型
（1）＋＋＋＋―――― （2）――――＋＋＋＋
（3）＋＋――＋＋――
交换型
（4）――＋＋――＋＋ （5）――＋＋＋＋――
（6）＋＋――――＋＋
３、显微镜观察步骤：
（１）在长有子囊果的试管中加少量无菌水，摇 动片刻，把水倒在空三角瓶中，加热煮沸，以 防止分生孢子飞扬。
14
（２）取一载玻片，滴一滴５％次氯酸钠， 然后用接种针挑出子囊果放在载玻片上， 用另一载玻片盖上，用手指压片，将子 囊果压破，置显微镜下（１０Ｘ１５倍） 检查，即可见到３０－４０个子囊。
合计
其它类型
子囊数
16
链孢霉的子囊果和子囊
(a)成熟的子囊果； (b)散开的子囊
未交换型子囊 交换型子囊
交换型子囊
17
交换型子囊
未交换型子囊
未交换型子囊
18
19
20
六、作业：
1、记录每个完整子囊的类型，计算Lys 基因的着丝粒距离。
2、绘显微镜下观察到的杂交子囊的图。 3、分析红色面包霉的子囊孢子分离和交
7
图中（3）和（4）的形成。由于Lys基因与着丝粒 间发生了一个交换，Lys+/Lys-在第一次减数分离时 没有分离，到第二次减数分裂（M2）时，带有Lys+ 的染色单体才和带有Lys-的染色单体相互分开，所 以称为第二次分裂分离。然后再经一次有丝分裂， 形成4个孢子对，顺序是＋＋--＋＋--或--＋＋-＋＋。这是第二次分裂分离子囊。
（3）在７－１４天左右，就可在显微镜下观察。
13
另外一种方法：在杂交培养基上接种一个亲 本菌株，25 OC培养５－７天后即有原子囊果出 现。同时准备好另一亲本菌株的分生孢子，悬 浊于无菌水中（近于白色的悬浊液），将此悬 浊液加到形成原子囊果的培养物表面，使表面 基本湿润，继续25OC培养。原子囊果在加进分 生孢子一天后即可开始增大变黑成子囊果，７ 天后即成熟。
实验四 粗糙链孢霉顺序四分子分析 一、目的 1 了解粗糙链孢霉的生活
实验四粗糙链孢霉顺序四分子分析一、目的1. 了解粗糙链孢霉的生活周期及特性。
2. 通过对粗糙链孢霉的赖氨酸缺陷型和野生型杂交所得后代的表型分析，了解顺序四分子的遗传学分析方法，进行有关基因与着丝粒距离的计算和作图。
二、原理粗糙链孢霉（Neurospora crassa）属于真菌中的子囊菌纲。
它是进行顺序四分子分析的好材料。
粗糙链孢霉的菌丝体是单倍体（n=7），每一菌丝细胞中含有几十个细胞核。
由菌丝顶端断裂形成分生孢子。
分生孢子有两种，小型分生孢子中含有一个核，大型分子孢子中含有几个核。
分生孢子萌发成菌丝，可再生成分生孢子，周而复始，这样形成粗糙链孢霉的无性生殖过程。
粗糙链孢霉除无性生殖过程外，也可以进行有性生殖。
粗糙链孢霉的菌株具有两种不同的接合型（mating type），用A, a或mt+, mt-表示。
接合型是由一对等位基因控制的，并符合孟德尔分离定律。
没接合型菌株的细胞接合产生有性孢子，有性孢子可很快进入减数分裂。
有性生殖过程有两种方式：1. 当菌丝在有性生殖的杂交培养基上增殖时，就会产生原子囊果，内部附有产囊体，若另一接合型分生孢子落在这原子囊果的受精丝上时，分生孢子的细胞核进入受精丝，到达原子囊果的产囊体中，形成接合型基因的异核体。
进入产囊体中的分生孢子的核发生分裂，并进入产囊菌丝中，被隔膜分成一对细胞，形成钩状细胞，亦称原子囊。
钩状细胞顶端细胞的两核形态合子，合子核再进行减数分裂，分为四个单倍体的核，就是四分体，再进行一次有丝分裂，变成8个核，顺序地排列在一个子囊中。
原子囊果在受精后增大变黑，成熟为子中果。
一个子囊果中有30～40个子囊，成熟的子囊孢子呈橄榄球状，长30～40μm，比3～5μm的分生孢子要大得多。
子囊孢子如经60℃处理30～60分钟，便会发芽，长出菌丝，进入无性繁殖。
2. 不同接合型的菌丝相接触，两核配对，但不融合，形成形成双核体，随着双核体菌丝的发育，子囊壳中形成很多伸长的囊状孢子囊，即子囊进行发育。
粗糙链孢霉顺序四分子分析
粗糙链孢霉顺序四分子分析第一篇：粗糙链孢霉顺序四分子分析粗糙链孢霉顺序四分子分析Analysis of the Neurospora crassa’s ordedtetrad摘要：本实验通过菌种活化、杂交、显微镜观察等方法对粗糙链孢霉的顺序四分子进行遗传分析，从而达到以下目的：1、了解粗糙链孢霉的生活周期及生长特性；2、通过对粗糙链孢霉杂交后代的表型分析，掌握顺序四分子的遗传学分析方法；3、通过有关基因的着丝粒作图，进一步理解基因的分离和连锁交换定律。
Abstract：This experiment by strains of activation, hybridization, microscope observation and other methods of rough chain spore mould order four molecular genetic analysis, so as to achieve the following objectives: 1 and understand the life cycle of the rough chain spore mould and growth characteristics;2, through the rough chain spore mildew hybrid offspring phenotype analysis, grasp the sequence of four molecular genetics analysis method;3, through the relevant genes centromere mapping, separation of further understanding the genetic chain and exchange law.关键词：顺序四分子，连锁交换定律，基因转换，第一次减数分裂，第二次减数分裂Key words：Ordedtetrad，Chain exchange law，Gene conversion，First division segregation，Second division segregation 前言：粗糙链孢霉(Neurospora crassa)又称红色面包霉，属于真菌中的子囊菌纲、球壳目、脉孢菌属，目前已知4～5种。
链霉菌基因实验操作
链霉菌实验操作1录入时间:2009/8/28 16:09:31 来源：食品科技网一、培养基、抗生素、生长因子常用抗生素及其使用浓度抗生素英文名称及缩写抗性基因贮藏液浓度(mg/ml)使用终浓度（μg/ml）链霉菌大肠杆菌MM2CMYEMELA或LB氨苄青霉素氯霉素潮霉素卡那霉素壮观霉素链霉素硫链丝菌素红霉素阿泊拉霉素Ampicillin, AmpChloramphenicol, CmlHygromycin, HygKanamycin, KmSpectinomycin, SpcStreptomycin, StrThiostrepton, ThioErythomycin, EryApramycin, Amblacathygaac或aphaadAstrtsrerm Eaac(3)IV10025(无水乙醇配)5025505025(DMSO配)10050R10102?501051010R－2550502510－50R－－－50－2.5－5050-1002550505025不敏感2030-5*–表示无记录或不能使用，贮存液除特别说明外均用无菌水配制*此表仅供参考！！！*R表示不敏感*Km 和Am有交叉抗性，所以同时具有这两种抗性基因时应适当提高抗生素的量，并作好对照。
*Hyg易见光分解，应用锡箔纸包好。
*有些抗生素需要在低盐的环境（如DNA培养基）下筛选效率较高，如Hyg, Km, VioLB（Luria-Bertani）培养基胰蛋白胨10g，酵母抽提物5g，NaCl 5g，葡萄糖1g，蒸馏水加至1000ml，pH7.3左右（灭菌后第一次用时还要调一次）LALB中加入终浓度为1.5-2%的琼脂粉(不同的琼脂加的量不同，如青岛琼脂大概需1.5%，而华美的需要2%)。
＊做蓝白斑筛选时不加葡萄糖基本培养基（MM）溶液：L-天冬酰胺0.5g，K2HPO4 0.5g,MgSO4·7H2O 0.2g,FeSO4·7H2O 0.01g,蒸馏水至1000ml将每250ml溶液分装到装有2.5g琼脂的500ml三角瓶中，灭菌，使用时每瓶加入50％葡萄糖（8磅灭菌）5ml，调pH7.0。
粗糙脉胞菌顺序四分子分析
ห้องสมุดไป่ตู้ 实验原理
着丝粒与基因间的重组率 =
第二次分裂分离子囊数 1/2
子囊总数
100%
或：
重组率 =
MII 1/2
MI + MII
100%
基因与着丝粒间距离（图距）： 重组率去掉%即为图距，单位为厘摩（cM）。
实验步骤
1.菌种活化
2.杂交接种 3.培养 4.压片观察
实验步骤
4.压片观察：
将附有子囊果的滤纸条放入3%来苏尔溶液 10min，杀死孢子，以防止污染实验室； 取一载玻片，滴1~2滴3%来苏尔溶液，然后用接 种针挑出子囊果放在载玻片上；
盖上另一载玻片，用手指压片，将子囊果压破；
置显微镜下观察
实验结果
可观察到一个子囊果中散出30~40个子囊； 观察子囊孢子的排列情况；
实验六 粗糙脉胞菌顺序四分子分析
实验目的
1.了解粗糙脉胞菌的生活周期及特性；
2.学习粗糙脉胞菌的培养方法和杂交技术； 3.学习顺序四分子的遗传学分析方法，进行 有关基因与着丝点距离的计算和作图。
实验材料
1．粗糙链孢霉野生型菌株，Lys+，分生孢 子粉红色； 2．粗糙链孢霉赖氨酸缺陷型菌株，Lys-， 分生孢子白色。
实验结果
观察一定数目的子囊果，记录每个杂交型 完整子囊的类型，并计算出Lys基因与着丝 粒间的距离。
1. 填表 2. 列出计算公式及结果 3. 绘制显微镜下观察到的杂交子囊的图
注意！！
本次实验观察过的载玻片、用过的 镊子等物品都需放入消毒液中浸泡 10分钟后取出清洗，以防污染实验 室！
实验原理
本实验用赖氨酸缺陷型与野生型杂交，得到的子囊 孢子分离为4个黑色的（+）和4个灰色的（-）。 黑色孢子为野生型，赖氨酸缺陷型孢子成熟迟，在 野生型孢子成熟变黑时，还未变黑，而呈浅灰色； 根据黑色孢子和灰色孢子在子囊中的排列顺序，可 知合子在减数分裂时，基因Lys和着丝粒之间发生交 换的情况，最终可有两大类型的子囊出现，即第一 次分裂分离子囊和第二次分裂分离子囊。
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另外一种方法：在杂交培养基上接种一个亲 本菌株，25 OC培养５－７天后即有原子囊果出 现。同时准备好另一亲本菌株的分生孢子，悬 浊于无菌水中（近于白色的悬浊液），将此悬 浊液加到形成原子囊果的培养物表面，使表面 基本湿润，继续25OC培养。原子囊果在加进分 生孢子一天后即可开始增大变黑成子囊果，７ 天后即成熟。 ３、显微镜观察步骤： （１）在长有子囊果的试管中加少量无菌水，摇 动片刻，把水倒在空三角瓶中，加热煮沸，以 防止分生孢子飞扬。
实验二 粗糙链孢霉生活史及杂交
［一、实验原理］
粗糙链孢霉属于真菌中的子囊菌纲。粗糙 链孢霉的菌丝体是单倍体（n=7），每一菌丝 细胞中含有几十个细胞核。由菌丝顶端断裂形 成分生孢子。 分生孢子有两种，小型分生孢子中含有一 个核，大型分生孢子中含有几个核。分生孢子 萌发成菌丝，可再生成分生孢子，周而复始， 这是粗糙链孢霉的无性生殖过程。
本实验用赖氨酸缺陷型（记作Lys-）与野生型（记作 Lys+）杂交，得到的子囊孢子分离为4个黑的（＋），4 个是灰的（-）。黑的孢子是野生型；赖氨酸缺陷型孢 子成熟迟，所以呈灰色。根据黑色孢子和灰色孢子在子 囊中的排列顺序，可有6种子囊类型。 子囊型（1）和（2）的产生如图。第一次减数分裂 （M1）时，带有Lys+的两条染色单体移向一极，而带有 Lys-的两条染色单体移向另一极。Lys+/Lys-这对基因在 第一次减数分裂时分离，称第一次分裂分离。第二次减 数分裂（M2）时，每一染色单体相互分开，形成四分体， 顺序是＋＋——或——＋＋，再经过一次有丝分裂，成 为（1）和（2）子囊型。形成这两种子囊型时，在着丝 粒和基因对Lys+/Lys-间未发生过交换，是第一次分裂分 离子囊。
（２）取一载玻片，滴一滴５％次氯酸钠， 然后用接种针挑出子囊果放在载玻片上， 用另一载玻片盖上，用手指压片，将子 囊果压破，置显微镜下（１０Ｘ１５倍） 检查，即可见到３０－４０个子囊。 （3）最后用过的针及玻片要用开水煮过洗 净。
（4）在显微镜下观察记录子囊孢子在子囊中的排列顺 序，将结果记入下表。 红色链孢霉性状遗传杂交实验结果
链孢霉（Neurospora crassa）的生活史
图8-19
粗糙链孢霉的菌株有两种不同的接合型， 用A,a 或mt+, mt-表示，他们受一对等位 基因控制。不同结合型菌株的细胞接合产 生有性孢子，这过程称为有性生殖。有性 生殖可以通过两种方式进行。 一是产生原子囊果，内附有产囊体，若 另一接合型的分生孢子落在这原子囊果的 受精丝上时，分生孢子的细胞核进入受精 丝，到达产囊体，形成接合型基因的异核 体。 二是不同接合型的菌株的菌丝连接， 两种接合型的细胞核发生融合形成合子， 产生子囊果。
图中（3）和（4）的形成。由于Lys基因与着丝粒 间发生了一个交换，Lys+/Lys-在第一次减数分离时 没有分离，到第二次减数分裂（M2）时，带有Lys+ 的染色单体才和带有Lys-的染色单体相互分开，所 以称为第二次分裂分离。然后再经一次有丝分裂， 形成4个孢子对，顺序是＋＋--＋＋--或--＋＋-＋＋。这是第二次分裂分离子囊。 （5）和（6）子囊型的形成与（3）和（4）类似， 也是两个染色单体发生了交换，不过交换不是发生 在第2条染色单体与第3条染色单体之间，而是发生 在1，3或2，4两条染色单体之间。
粗糙链孢霉lys+与lys-杂 交子囊孢子的排列顺序
(1)、(2)为非交换型 (3)、（4)、(5)、(6)为交换型子囊 (7)、（8)、(9)、(10)是由转换造成的异常比例
［二、实验目的］
1． 掌握粗糙链孢霉的杂交技术； 2． 统计杂交结果，计算基因图距。
[三、实验材料]
粗糙链孢霉野生型菌株，Lys+,接合型A.
子 囊 类 型 （1）＋＋＋＋―――― （2）――――＋＋＋＋ （3）＋＋――＋＋―― （4）――＋＋――＋＋ （5）――＋＋＋＋―― （6）＋＋――――＋＋ 合 计 其它类型 子 囊 数
非交换型
交换型
链孢霉的子囊果和子囊
(a)成熟的子囊果； (b)散开的子囊
未交换型子囊
交换型子囊
交换型子囊
交换型子囊 未交换型子囊
粗糙链孢霉赖氨酸缺陷型菌株Lys-,接合型a.
[四、实验器具和药品]
1.器具：显微镜，钟表镊，解剖ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ，接种 针，载玻片，试管，培养皿。 2.药品： ５％次氯酸钠。
[五、实验步骤]
1、菌种活化：把野生型和缺陷型菌种从冰箱取出， 分别接在两支土豆培养基试管斜面上， 28OC温箱培养５天。培养到菌丝上部有分生孢子 产生。 ２、杂交： （１）同时在杂交培养基上接种两亲本菌株的分生 孢子或菌丝，25 OC温箱进行混合培养。注意要贴 好标签，写明亲本菌株及杂交日期。 （2）杂交后５－７天就能看到许多棕色的原子囊果 出现，以后原子囊果变黑变成子囊果。 （3）在７－１４天左右，就可在显微镜下观察。
未交换型子囊
六、作业：
1、记录每个完整子囊的类型，计算Lys 基因的着丝粒距离。 2、绘显微镜下观察到的杂交子囊的图。 3、分析红色面包霉的子囊孢子分离和交 换现象与高等植物的性状分离和交换有 什么不同，本实验结果说明了什么？
粗糙链孢霉的子囊和子囊型
其中，1 和2 是 未交换的，称第一 次分裂分离子囊； 3-6 都是发生交换 的，称第二次分裂 分离子囊。 因此，统计第二 次分裂分离子囊占 总子囊数的比例， 乘以0.5，就可决定 某一基因与着丝粒 之间的重组值。重 组值去掉%（即乘以 100），即为该基因 图距。
粗糙链孢霉的子囊和子囊型