高通量测序原理和应用 ppt课件
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高通量测序原理
高通量测序原理高通量测序（high-throughput sequencing）是一种快速且高效的基因测序技术，它通过对DNA或RNA样本进行大规模并行测序，能够同时获得大量的基因序列信息。
下面介绍高通量测序的原理。
高通量测序的核心技术之一是DNA片段的扩增。
首先，需要将DNA或RNA样本提取出来，并根据需要进行富集和净化处理。
然后，将样本DNA或RNA分解成较短的片段，通常为几百到几千碱基对。
接下来，为每个片段的两端连接适配体（adapter），适配体中含有特定序列，用于测序和扩增引物的结合。
在测序之前，需要将这些片段通过PCR（聚合酶链反应）进行扩增，形成DNA文库。
文库中的每个片段都带有两端适配体并连接了PCR引物。
最后，将文库进行测序。
高通量测序技术主要有两种方法：SBS（测序by合成）和SMRT（单分子实时测序）。
下面分别介绍它们的原理：1. SBS（Sequencing by Synthesis）：这是目前应用最广泛的高通量测序技术。
其原理是通过单个DNA聚合酶复制 DNA的过程，依次加入四种具有不同荧光发射特性的可逆终止核苷酸（dNTPs）。
每次加入一个dNTP后，检测其是否被聚合到待测序片段上，并记录其信号。
然后，将其去除，以便加入下一个dNTP。
重复这个过程，直到测序结束。
通过检测每个位置的荧光信号，就可以获得该位置的碱基信息。
2. SMRT（Single-molecule Real Time sequencing）：这种技术利用了DNA聚合酶的优异性质，实现了单分子级别的DNA测序。
SMRT测序使用了一种称为“ZMW”的奇特结构，即零模式波导孔（Zero-mode waveguide）。
在这种结构中，只有非常小的体积（约为20nm）被激光所照亮，并记录荧光信号。
通过DNA聚合酶复制过程，加入了与待测DNA碱基互补的荧光标记的dNTPs，并记录下其荧光信号。
通过不断加入dNTPs，观察荧光信号的变化，就可以获得DNA测序信息。
高通量测序的原理及应用
高通量测序的原理及应用1. 概述高通量测序（High-throughput sequencing），也被称为第二代测序技术，是一种用于快速、准确且具有高通量的DNA测序方法。
相比于传统的测序方法，高通量测序技术在测序速度、准确度和成本上有明显的优势。
本文将介绍高通量测序的原理及其在生物医学、生态学和农业等领域的应用。
2. 原理高通量测序的原理基于DNA的复制和测序。
下面列举高通量测序的几种常见方法：•Sanger测序法–Sanger测序法是最早被广泛应用的测序方法之一。
它基于DNA合成中的酶法延伸原理进行测序。
通过控制核苷酸的浓度，可以在DNA合成中引入荧光标记。
随着合成的扩增，核苷酸会停留在特定位置，之后通过电泳分析荧光标记的顺序来测定目标DNA序列。
•454测序法–454测序法是一种基于密集插入测序技术的高通量测序方法。
通过将待测DNA样本切割成较小的片段，并与特定合子序列连接，形成序列文库。
之后，这些片段将在流动细胞中进行多轮酶法扩增，并通过荧光探针进行检测，从而实现对目标DNA序列的测定。
•Illumina测序法–Illumina测序法是目前最广泛应用的高通量测序技术之一。
该方法通过将DNA样本分离成独立的DNA片段，并连接到流动细胞矩阵中。
接下来，在不同的扩增循环中，特定的核苷酸会被逐步加入，并通过荧光探针的检测来确定DNA的序列。
最终，可以通过计算机软件将这些测定的片段合并成完整的目标DNA序列。
3. 应用高通量测序技术在各个领域有广泛的应用，包括：•生物医学研究–在生物医学领域，高通量测序技术可以帮助研究人员对人类遗传病的发生机制进行深入研究。
通过对大规模的基因组数据进行测序和分析，可以寻找与特定遗传病相关的基因变异并探索潜在的治疗方法。
此外，高通量测序还可以用于肿瘤学研究，帮助研究人员了解肿瘤发展、进展和治疗的分子机制。
•生态学研究–高通量测序技术可以应用于生态学研究中，帮助研究人员分析和识别不同环境下的微生物群落组成。
高通量测序技术的类型原理及应用-ppt
纳米孔测序原理
概述
纳米孔测序技术利用电 场驱动DNA通过纳米孔， 通过检测电流变化来判 断DNA序列。
原理
DNA通过纳米孔时，不 同碱基对产生的电学信 号不同，根据信号差异 进行测序。
特点
单分子测序、实时检测、 便携式，适用于单分子 水平的基因组测序和变 异检测。
合成测序原理
概述
合成测序技术是通过连续添加碱基并检测产物来推断DNA 序列的技术。
特点
高通量测序技术具有高速度、高 准确性、高灵敏度、高通量和高 信息量等特点，能够快速获取大 量基因组序列信息。
高通量测序技术的发展历程
1977年
01
1986年
02
03
1990年
Sanger等提出DNA测序方法， 即双脱氧终止法，奠定了DNA测 序的基础。
Maxam和Gilbert提出另一种测 序方法，即化学降解法。
微生物多样性研究
高通量测序技术可以测定微生物群落的基因组序列，有助于研究微 生物多样性和生态学。
农业与动植物研究
作物育种与改良
高通量测序技术可以测定作物的基因组序列，为 作物育种和改良提供技术支持。
动物遗传资源保护
高通量测序技术可以检测动物的遗传变异，有助 于动物遗传资源的保护和评估。
生态学与进化研究
原理
合成过程中加入不同碱基的类似物，通过检测产物中特定 碱基的量来确定DNA序列。
特点
高精度、高分辨率、低成本，适用于基因组测序和SNP检 测。
光学图谱测序原理
概述
光学图谱测序技术利用光学显微镜和 分子标记技术对DNA进行定位和测
序。
原理
在DNA分子上标记荧光染料或量子 点等光学标记，通过光学显微镜观察
高通量测序的原理
高通量测序的原理
高通量测序是一种用于快速测定DNA或RNA序列的技术，也被称为次代测序技术。
其原理基于原始测序方法的改进，利用了并行测序和大规模平行处理的特点。
高通量测序的主要原理包括以下几个步骤：
1.文库构建：将DNA或RNA样本进行裂解、适配体连接、扩增等处理，生成包含片段的文库。
2.芯片或滤纸扩增：将文库中的DNA或RNA片段进行扩增，生成大量的复制品。
3.固定片段：将扩增的DNA或RNA片段固定到特定的载体上，这些载体可以是微流控芯片、滤纸或玻璃片等。
4.并行测序：将固定的DNA或RNA样本放入高通量测序设备中，利用平行处理的方式，进行大规模的测序反应。
5.碱基识别：在测序反应中，通过特殊的化学试剂，碱基对（例如A与T、C与G）会发出特定的荧光信号，设备可根据这些信号确定每个位置上的碱基。
6.数据收集和分析：测序设备通过扫描和相机等设备收集碱基对的荧光信号，并通过软件处理和分析这些数据，得到完整的DNA或RNA序列。
总的来说，高通量测序通过并行处理和大规模测序反应，可以快速、准确地得到大量的DNA或RNA序列信息。
这项技术广泛应用于基因组学、转录组学、表观基因组学等领域，对于揭示生物学过程、疾病机制等具有重要的意义。
高通量测序在医学中的应用百迈客ppt课件
研究目的：探究Long Noncoding RNA 对于心血管功 能的调控作用。
材料与方法：对小鼠多分化阶段的胚胎干细胞与成年 小鼠大脑、肝脏和骨骼肌肉组织进行长链非编码RNA 测序。Illumina测序平台。
33
研究结果：
鉴定出了47个在ESCs中高表达但在其他 三种组织中中等表达的lncRNA，一种 lncRNA在心脏组织中表现出高表达的现 象，将其命名Braveheart。 经分析bvht（AK143260）是一种包含三 个外显子的590nt长的转录本。
基因突变
9
10
案例分析
Whole-exome sequencing of gallbladder carcinoma identifies recurrent mutations in the ErbB pathway
——胆囊癌相关基因变异及其致病机理
材料与方法： 57对胆囊癌患者的癌组织和相应 的癌旁正常组织，外显子组测序。 Illumina测序平台
11
TP53、ERBB3基因在胆囊癌病人中出现C>T碱基的高频颠换， 颠换率分别为47.1%、11.8%
12
胆囊癌ErbB信号通路
13
案例分析
Loss-of-Function Mutations in APOC3,Triglycerides, and Coronary Disease
——胆囊癌相关基因变异及其致病机理
18
19
案例分析
Decoding the regulatory landscape of Medulloblastoma using DNA methylation sequencing
——成神经管细胞瘤是一种高度恶性原发性脑肿瘤
材料与方法：对小鼠多分化阶段的胚胎干细胞与成年 小鼠大脑、肝脏和骨骼肌肉组织进行长链非编码RNA 测序。Illumina测序平台。
33
研究结果：
鉴定出了47个在ESCs中高表达但在其他 三种组织中中等表达的lncRNA，一种 lncRNA在心脏组织中表现出高表达的现 象，将其命名Braveheart。 经分析bvht（AK143260）是一种包含三 个外显子的590nt长的转录本。
基因突变
9
10
案例分析
Whole-exome sequencing of gallbladder carcinoma identifies recurrent mutations in the ErbB pathway
——胆囊癌相关基因变异及其致病机理
材料与方法： 57对胆囊癌患者的癌组织和相应 的癌旁正常组织，外显子组测序。 Illumina测序平台
11
TP53、ERBB3基因在胆囊癌病人中出现C>T碱基的高频颠换， 颠换率分别为47.1%、11.8%
12
胆囊癌ErbB信号通路
13
案例分析
Loss-of-Function Mutations in APOC3,Triglycerides, and Coronary Disease
——胆囊癌相关基因变异及其致病机理
18
19
案例分析
Decoding the regulatory landscape of Medulloblastoma using DNA methylation sequencing
——成神经管细胞瘤是一种高度恶性原发性脑肿瘤
高通量测序技术及实用数据分析ppt课件
第三代测序：单分子测序
不同于第二代测序依赖于DNA模板与固体表面相结合然后边合成边测序，第三代 分子测序，不需要进行PCR扩增。
早在2008年，HelicoBio Science 公司的Harris等在Science上报道了他们开发的 TIRM（total internal reflection microscopy）测序技术。
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Ion Torrent测序技术：
使用半导体技术将生化反应与电流强度直接联系。在聚合酶反应时，每聚合 一个碱基会释放出相应的质子，引起周围环境PH的变化，将PH变化转化为 电流的变化，最终记录电流信号，获得测序序列。读长约200bp，根据芯片 不同可以一次产生10M-20G的数据。
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19
物上每一个dNTP的聚合与一次荧光信号的释放偶联起来，通过检测荧光的释放和强度，达到
实时测定DNA序列的目的。
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14
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Hiseq2000/Hiseq1000（HIseq2500/Hiseq1500）平台简介： 原理：基于DNA单分子簇边合成 ➢ 将基因组DNA的随机片段附着到光学透明的玻璃表面（即Flow cell），这些DNA片段经过延伸
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常见的高通量测序测序平台
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焦磷酸测序技术：引物与模板DNA退火后，在dna聚合酶(DNA polymerase)、ATP硫酸化酶(ATP
sulfurytase)、荧光素酶(1uciferase)和三磷酸腺苷双磷酸酶(Apyrase)4种酶的协同作用下，将引
• 每一个k-mer作为图中一个节点，两 个k-mer如果在同一read中相邻，则 形成一个边。
高通量测序原理课件
传统的测序方法，适用于小规模测序项目。
高通量测序技术
采用并行测序的方法，能够大幅提高测序效率 和准确性。
高通量DNA。2DNA片段连接
将DNA片段连接到测序引物和适配器。
3
DNA扩增
通过PCR或桥式PCR扩增DNA片段。
4
测序反应
利用测序技术获取DNA片段的序列信息。
高通量测序原理课件
欢迎来到高通量测序原理课件！ 在本课程中，我们将深入介绍高通量测序的 原理和应用，帮助您理解这项革命性的技术。
高通量测序原理简介
高通量测序是一种先进的基因测序技术，它能够以前所未有的速度和准确度获取DNA序列信息。它已经在许多 领域产生了深远的影响。
测序方法概述
Sanger测序
Ion Torrent
无需芯片，具有快速和灵敏的 测序技术。
结论和展望
高通量测序技术的快速发展为生命科学研究带来了巨大的机遇。未来，我们 可以期待更加高效和经济的测序方法的出现，推动理和分析，得出DNA序列。
应用领域与发展趋势
高通量测序已经广泛应用于基因组学、医学研究、农业科学等领域。随着技术的不断革新，我们可以期待更多 令人兴奋的应用和创新。
主要技术平台对比
Illumina
市场主导者，提供高度准确和 高通量的测序服务。
PacBio
长读段测序，适用于复杂基因 组和结构变异的研究。
高通量测序技术
采用并行测序的方法，能够大幅提高测序效率 和准确性。
高通量DNA。2DNA片段连接
将DNA片段连接到测序引物和适配器。
3
DNA扩增
通过PCR或桥式PCR扩增DNA片段。
4
测序反应
利用测序技术获取DNA片段的序列信息。
高通量测序原理课件
欢迎来到高通量测序原理课件！ 在本课程中，我们将深入介绍高通量测序的 原理和应用，帮助您理解这项革命性的技术。
高通量测序原理简介
高通量测序是一种先进的基因测序技术，它能够以前所未有的速度和准确度获取DNA序列信息。它已经在许多 领域产生了深远的影响。
测序方法概述
Sanger测序
Ion Torrent
无需芯片，具有快速和灵敏的 测序技术。
结论和展望
高通量测序技术的快速发展为生命科学研究带来了巨大的机遇。未来，我们 可以期待更加高效和经济的测序方法的出现，推动理和分析，得出DNA序列。
应用领域与发展趋势
高通量测序已经广泛应用于基因组学、医学研究、农业科学等领域。随着技术的不断革新，我们可以期待更多 令人兴奋的应用和创新。
主要技术平台对比
Illumina
市场主导者，提供高度准确和 高通量的测序服务。
PacBio
长读段测序，适用于复杂基因 组和结构变异的研究。
高通量测序技术及其在农业上的应用详解演示文稿
第四页，共27页。
• 1977年Sanger等发明的双脱氧核苷酸末端终止法和 Gilbert等发明的化学降解法，标志着第一代测序技术的诞生 。
• 尽管第一代测序技术已经帮助人们完成了从噬菌体基因组到 人类基因组草图等大量的测序工作，但由于其存在成本高、 速度慢等方面的不足，并不是最理想的测序方法。经过不断 的开发和测试，进入21世纪后，以Roche公司的454技术 、Illumina公司的Solexa技术和ABI公司的SOLiD技术 为标志的第二代测序技术诞生了。
第十九页，共27页。
SOLiD 的特点与主要应用
• 读长较短，50-75bp • 精度高，可达Q40 • 通量高， 20-30G每天，1Run 可达120G • 主要应用：基因组重测序、SNP检测等
第二十页，共27页。
三种平台的技术差异
平台 PCR 测序载体 测序方式
结果序列
454 磁珠乳化PCR 磁珠 焦磷酸、荧光
第三页，共27页。
1.2 为什么要发展高通量测序技术
• 快速和准确地获取生物体的遗传信息对于生命科学研究一直 具有十分重要的意义。对于每个生物体来说，基因组包含了 整个生物体的遗传信息。测序技术能够真实地反映基因组 DNA上的遗传信息，进而比较全面地揭示基因组的复杂性 和多样性，因而在生命科学研究中扮演了十分重要的角色。
第二十二页，共27页。
3.1 全基因组重测序
全基因组重测序是对已知基因组序列的物种进行不 同个体的基因组测序，并在此基础上对个体或群体进行差 异性分析。全基因组重测序的个体，通过序列比对，可以 找到大量的单核苷酸多态性位点( SNP) 、插入缺失位点( InDel，Insertion/Deletion) 、结 构 变 异 位 点( SV ，Structure Variation) ， 通过生物信息学手段，分析 不同个体基因组间的结构差异，同时完成注释。
• 1977年Sanger等发明的双脱氧核苷酸末端终止法和 Gilbert等发明的化学降解法，标志着第一代测序技术的诞生 。
• 尽管第一代测序技术已经帮助人们完成了从噬菌体基因组到 人类基因组草图等大量的测序工作，但由于其存在成本高、 速度慢等方面的不足，并不是最理想的测序方法。经过不断 的开发和测试，进入21世纪后，以Roche公司的454技术 、Illumina公司的Solexa技术和ABI公司的SOLiD技术 为标志的第二代测序技术诞生了。
第十九页，共27页。
SOLiD 的特点与主要应用
• 读长较短，50-75bp • 精度高，可达Q40 • 通量高， 20-30G每天，1Run 可达120G • 主要应用：基因组重测序、SNP检测等
第二十页，共27页。
三种平台的技术差异
平台 PCR 测序载体 测序方式
结果序列
454 磁珠乳化PCR 磁珠 焦磷酸、荧光
第三页，共27页。
1.2 为什么要发展高通量测序技术
• 快速和准确地获取生物体的遗传信息对于生命科学研究一直 具有十分重要的意义。对于每个生物体来说，基因组包含了 整个生物体的遗传信息。测序技术能够真实地反映基因组 DNA上的遗传信息，进而比较全面地揭示基因组的复杂性 和多样性，因而在生命科学研究中扮演了十分重要的角色。
第二十二页，共27页。
3.1 全基因组重测序
全基因组重测序是对已知基因组序列的物种进行不 同个体的基因组测序，并在此基础上对个体或群体进行差 异性分析。全基因组重测序的个体，通过序列比对，可以 找到大量的单核苷酸多态性位点( SNP) 、插入缺失位点( InDel，Insertion/Deletion) 、结 构 变 异 位 点( SV ，Structure Variation) ， 通过生物信息学手段，分析 不同个体基因组间的结构差异，同时完成注释。
临床医学技术培训PPT高通量测序与临床诊断
肿瘤基因突变背景
肿瘤的发生和发展与基因突变密切相关，不同患者的基因突变情 况各异。
高通量测序技术应用
利用高通量测序技术对肿瘤患者的基因进行突变筛查，找出与肿瘤 相关的特定基因变异。
个性化治疗指导
根据患者的基因变异情况，制定针对性的治疗方案，提高治疗效果 和患者生存率。
案例三：新生儿基因筛查预防遗传性疾病
感谢观看
高通量测序原理
边合成边测序
利用DNA聚合酶和带有荧光标记 的dNTP，在DNA合成过程中实 时检测荧光信号，实现DNA序列
的测定。
桥式PCR扩增
将DNA片段固定在芯片上，通过 桥式PCR扩增形成DNA簇，提高 测序信号的强度和准确性。
可逆终止剂
使用可逆终止剂暂停DNA链的延伸 ，以便在每次反应中只加入一个 dNTP，确保测序的准确性。
DNA质量检测
利用凝胶电泳、分光光度计等方法对提取的DNA进行质量。
利用生物信息学方法对测序数 据进行处理和分析，包括序列 比对、变异检测、基因表达分 析等。
结果解读与报告
根据分析结果，结合临床信息 ，对疾病进行诊断、预后评估
或个性化治疗建议。
04
生物信息学在高通量测序数据分 析中应用
基因变异检测及注释方法
单核苷酸变异（SNV）检测
插入/缺失（INDEL）检测
通过比对测序数据与参考基因组，识别单 个碱基的替换、插入或缺失。
对组装得到的基因组进 行基因结构预测、功能
注释等分析。
基因结构预测
识别基因组中的编码区 、非编码区以及调控元
件等。
功能注释
对预测得到的基因进行 功能描述，包括基因产 物、参与的生物学过程
等。
转录组学和蛋白质组学数据分析
肿瘤的发生和发展与基因突变密切相关，不同患者的基因突变情 况各异。
高通量测序技术应用
利用高通量测序技术对肿瘤患者的基因进行突变筛查，找出与肿瘤 相关的特定基因变异。
个性化治疗指导
根据患者的基因变异情况，制定针对性的治疗方案，提高治疗效果 和患者生存率。
案例三：新生儿基因筛查预防遗传性疾病
感谢观看
高通量测序原理
边合成边测序
利用DNA聚合酶和带有荧光标记 的dNTP，在DNA合成过程中实 时检测荧光信号，实现DNA序列
的测定。
桥式PCR扩增
将DNA片段固定在芯片上，通过 桥式PCR扩增形成DNA簇，提高 测序信号的强度和准确性。
可逆终止剂
使用可逆终止剂暂停DNA链的延伸 ，以便在每次反应中只加入一个 dNTP，确保测序的准确性。
DNA质量检测
利用凝胶电泳、分光光度计等方法对提取的DNA进行质量。
利用生物信息学方法对测序数 据进行处理和分析，包括序列 比对、变异检测、基因表达分 析等。
结果解读与报告
根据分析结果，结合临床信息 ，对疾病进行诊断、预后评估
或个性化治疗建议。
04
生物信息学在高通量测序数据分 析中应用
基因变异检测及注释方法
单核苷酸变异（SNV）检测
插入/缺失（INDEL）检测
通过比对测序数据与参考基因组，识别单 个碱基的替换、插入或缺失。
对组装得到的基因组进 行基因结构预测、功能
注释等分析。
基因结构预测
识别基因组中的编码区 、非编码区以及调控元
件等。
功能注释
对预测得到的基因进行 功能描述，包括基因产 物、参与的生物学过程
等。
转录组学和蛋白质组学数据分析
高通量测序技术及原理介绍ppt课件
Bustard
• Base with highest corrected intensity is called
AC
G
T
CONFIDENTIAL – DO NOT DISTRIBUTE
C
Gerald
• Filtering removes low quality base calls
GEneration of Recursive Analyses Linked by
▪ Visualize the data, reports the results
Sequencing process
1 Library prep (~ 6 hrs)
2 Automated Cluster Generation (~ 5 hrs)
1-8 samples
3 Sequencing (~ 46 to 120 hrs)
1-8 samples
Fragment DNA Repair ends / Add A overhang
Ligate adapters Select ligated DNA
Hybridize to flow cell Extend hybridized oligos Perform bridge amplification
Solexa
Flow cell in GAIIx
Image re-analysis pipleline
Instrument PC
Images (.tif) Lane 1..8
Cycle 1..36
Tile_Cycle_Image_a, Tile_Cycle_Image_c, Tile_Cycle_Image_g, Tile_Cycle_Image_t
高通量测序技术的类型原理及应用--ppt
高通量测序技术的优点
大规模平行测序(massively parallel signature sequencing，MPSS)：它利用芯片进行测序，可以在
数百万个点上同时阅读测序，把平行处理的思想用到极 致。
成本低廉：利用高通量测序技术进行人类基因组测
序，耗资不到传统测序法的1%。
高通量测序技术的优点
第二代测序技术
原理：酶级联化学发光反应
1.首先将PCR 扩增的单链DNA 与引物杂交，并与DNA 聚 合酶、ATP 硫酸化酶、荧光素酶、三磷酸腺苷双磷酸酶、 底物荧光素酶和5'-磷酸硫酸腺苷共同孵育。
2.在每一轮测序反应中只加入一种dNTP，若该dNTP与 模板配对，聚合酶就可以将其掺入到引物链中并释放出 等摩尔数的焦磷酸。
类型及原理
目前，所说的高通量测序技术主要是指454 Life Sciences 公司、ABI 公司和Illumina公司推 出的第二代测序技术以及Helicos Heliscope TM 和Pacific Biosciences 推出的单分子测序技术。
第二代测序技术
2005年，454 Life Sciences 公司( 现已被Roche 公司收购) 首先推出了革命性的基于焦磷酸测序法 的超高通量基因组测序系统，开创了第二代测序 技术的先河。
高通量测序技术有完美的定量功能：这是因
为样品中某种DNA被测序的次数反映了样品中这种 DNA的丰度。这一点有望取代以前的基因表达芯片 技术用于基因表达的研究。
高通量测序技术的应用
大规模基因组测序 基因表达分析 非编码小分子RNA的鉴定 转录因子靶基因的筛选 DNA甲基化相关研究 其他
全基因组测序
高通量测序技术在发展初期由于读长较短，使 其在对未知基因组从头测序( denovo Sequencing) 的 应用受到限制，只能用于基因组重测序。
高通量测序服务简介(2)(精品PPT)
高通量测序效劳(xiào láo)与数据分析效劳(xiào láo) 简介
第一页，共三十二页。
高通量测序简介(jiǎn jiè)
பைடு நூலகம் 高通量测序技术〔第二代或下一代测序技术，next generation sequencing)
是对传统测序一次革命性的改变，一次对几十万到几百 万条DNA分子进行序列测定，因此在研究中又被称为深度 测序(deep sequencing) 。
第四页，共三十二页。
高通量测序数据分析效劳(xiào láo)适用范围
已进行高通量测序实验的机构，后续需要对所获 得的数据展开各种不同应用的研究。如基因组数 据挖掘、表达组的cSNP寻找、基因组的拼接与补 洞、miRNA的不同样本的表达差异分析等等。
一般的二代测序效劳公司没有相应深度分析的能 力，而实验室很难独立展开深度分析的工作，可 以采用合作科研或纯效劳委托(wěituō)形式。
Jonathan Rothberg博士创造 基于焦磷酸测序法的超高通量基因组测序系统， “一
个片段 = 一个磁珠 = 一条(yī tiáo)读长〔One fragment = One bead = One read〕 革命性的理念-边合成边测序
2006年被罗氏收购，2007年推出Genome Sequencer FL断，DNA 末端修复，连接接头
DNA片段在Cluster Station上成簇扩增：准
备Flowcell和试剂，安装到Cluster Station；将样品DNA连接到Flowcell；完全自动化 完成Cluster制备
DNA簇在Genome Analyzer上边合成边测 序：Flowcell和试剂，安置到Genome Analyzer；全自动化
定量分析等研究。用于作用靶基因的预测和鉴定、样品间
第一页，共三十二页。
高通量测序简介(jiǎn jiè)
பைடு நூலகம் 高通量测序技术〔第二代或下一代测序技术，next generation sequencing)
是对传统测序一次革命性的改变，一次对几十万到几百 万条DNA分子进行序列测定，因此在研究中又被称为深度 测序(deep sequencing) 。
第四页，共三十二页。
高通量测序数据分析效劳(xiào láo)适用范围
已进行高通量测序实验的机构，后续需要对所获 得的数据展开各种不同应用的研究。如基因组数 据挖掘、表达组的cSNP寻找、基因组的拼接与补 洞、miRNA的不同样本的表达差异分析等等。
一般的二代测序效劳公司没有相应深度分析的能 力，而实验室很难独立展开深度分析的工作，可 以采用合作科研或纯效劳委托(wěituō)形式。
Jonathan Rothberg博士创造 基于焦磷酸测序法的超高通量基因组测序系统， “一
个片段 = 一个磁珠 = 一条(yī tiáo)读长〔One fragment = One bead = One read〕 革命性的理念-边合成边测序
2006年被罗氏收购，2007年推出Genome Sequencer FL断，DNA 末端修复，连接接头
DNA片段在Cluster Station上成簇扩增：准
备Flowcell和试剂，安装到Cluster Station；将样品DNA连接到Flowcell；完全自动化 完成Cluster制备
DNA簇在Genome Analyzer上边合成边测 序：Flowcell和试剂，安置到Genome Analyzer；全自动化
定量分析等研究。用于作用靶基因的预测和鉴定、样品间
高通量基因测序原理及操作流程培训
25℃
洗脱结束， 进入下cycle
测序过程的总结
➢ 1、3步骤：杂交；连接；信号收集。
➢ 2、常用酶：T4连接酶（30℃）。 ➢ 3、2种滤光片：绿色滤光片—CY3；黄色滤光片—TR。 ➢ 4、4种反应Buffer：2×SSPE；Reaction Buffer；1 X
Buffer N（ NaOH）；Washing Buffer
高通量基因测序原理及操作流程培训
❖ 原理 ❖ 流程图
原理
I. 杂交：利用碱基互补原理，通过退火将 anchor结合于测序样品末端的已知序列；
II. 连接：随后在T4 ligase的作用下，使与待测 位点碱基互补的荧光探针与anchor连接并与 样品互补结合；
III. 收集信号：收集与样品结合后的荧光探针在 特定激发光下发出的荧光信号，由荧光信号 的种类确定样品上所测位点的碱基种类。
➢5、1Base，2Cycle：Cycle1 —A(TR)、
G（CY3）；Cycle2—C（TR）、T（CY3）。
谢谢
42℃，2min
连接
25℃
连接
Reaction buffer 25℃， Wash
Load： T4 Ligase Probe Reaction buffer
30℃， 10min
Washing buffer 2×SSPE
30℃， Wash
采图 信号收集
采图 完成后
Load： 1 X NaOH
25℃
Load： 2×SSPE
Anchor
5’
DNA
3’
Beads
Anchor
Probe
Beads
5’
DNA
3’
Anchor Probe
洗脱结束， 进入下cycle
测序过程的总结
➢ 1、3步骤：杂交；连接；信号收集。
➢ 2、常用酶：T4连接酶（30℃）。 ➢ 3、2种滤光片：绿色滤光片—CY3；黄色滤光片—TR。 ➢ 4、4种反应Buffer：2×SSPE；Reaction Buffer；1 X
Buffer N（ NaOH）；Washing Buffer
高通量基因测序原理及操作流程培训
❖ 原理 ❖ 流程图
原理
I. 杂交：利用碱基互补原理，通过退火将 anchor结合于测序样品末端的已知序列；
II. 连接：随后在T4 ligase的作用下，使与待测 位点碱基互补的荧光探针与anchor连接并与 样品互补结合；
III. 收集信号：收集与样品结合后的荧光探针在 特定激发光下发出的荧光信号，由荧光信号 的种类确定样品上所测位点的碱基种类。
➢5、1Base，2Cycle：Cycle1 —A(TR)、
G（CY3）；Cycle2—C（TR）、T（CY3）。
谢谢
42℃，2min
连接
25℃
连接
Reaction buffer 25℃， Wash
Load： T4 Ligase Probe Reaction buffer
30℃， 10min
Washing buffer 2×SSPE
30℃， Wash
采图 信号收集
采图 完成后
Load： 1 X NaOH
25℃
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Anchor
5’
DNA
3’
Beads
Anchor
Probe
Beads
5’
DNA
3’
Anchor Probe
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➢Single-Read Sequencing(SR, 单向测序)指只检测
基因片段一端的序列信息。
互补接头 接头
基因序列
接头
Paired-End Sequencing
➢Paired-End Sequencing
(PE, 双向测序)是指检 测基因片段的两端序列 信息。
Single Read
Paired End
Shenzhen branch:
Thanks ！
➢GA 负 责 对 芯 片
内的基因片段进行 边合成边测序反应 (SBS) ， 收 集 碱 基 信息。
➢Single-Read Sequencing
单向测序
➢Paired-End Sequencing
双向测序
➢Indexed Sequencing
混合样品测序
Single-Read Sequencing
Hiseq 2000
Hiseq 2000
High-seq 2000
Some of our partners on cancer and complex disease studies
Welcome to BGI.
Beijing branch: Hangzhou branch:
New campus in Shenzhen:
高通量测序原理和应用
Illumina/Solexa genome analyzer
3’-
…-5’
5’-
GTATTTTCGGCACAG
A
G
A
C
T C
T TG
Cycle 1:按顺序加入反应试剂 合成第一个碱基 清除未反应的碱基和试剂
激发碱基荧光并收集荧光信号 去除阻断基团和荧光基团
Cycle 2-n:
转录本
Fragment buffer
Superscript III RNase H
N6 primer
mRNA DNA
DNA polymerase I ds cDNA
转录本
RNA-seq在医口中的应用
– 用于癌驱动基因的筛选 – 用于融合基因的筛选 – 用于可变剪接的筛选 – 用于RNA水平的SNP分析 – ……
重复前面的步骤
Base Calling
T G C TAC GAT …
1
2
3
4
5
6
7
8
9
TTTTபைடு நூலகம்TTGT…
The identity of each base of a cluster is read off from sequential images
➢CS 负 责 将 待 测
样品“种植”于检测 芯片(Flow Cell)中 并进行扩增。
Small RNA 测序
Day1 Day2 Day3 Day4
Small RNA 测序
Small RNA在医口中的应用
– 两种差异样本之间的Small RNA比较 – MicroRNA和基因表达差异综合 – 生物标记 – ……
RNA-seq
– 基因表达差异（DGE） – 转录本
DGE
DGE
Indexed Sequencing
➢Indexed Sequencing是指将多种样品混合后进行
测序的技术。
➢这是为了充分利用solexa高通量的特点，有助于
降低成本。
应用
• DNA 水平 – 全基因组测序（de novo和Resequencing） – 目标区域测序 (外显子测序) – 表观（bisulfite、MeDIP、ChIP-seq）
– 单基因病外显子测序 – 复杂疾病外显子测序 – 某种疾病已知的相关基因深度测序以挖掘突变位点等 – ……
表观-Bisulfite
表观-Bisulfite
表观-MeDIP
表观-MeDIP
表观-ChIP-seq
表观-ChIP-seq
表观在医口中的应用
– 组蛋白修饰及转录因子研究 – 全基因上的DNA甲基化图谱 – 高CpG区域的甲基化图谱 – ……
RNA 水平 – 小RNA测序 – RNA-seq（DGE、转录本）
全基因组测序
全基因组测序在医口中的应用
– 单个临床细菌、真菌等微生物的基因组研究 – 多个同属菌株的基因组比较及群体进化 – 宏基因组 – 疾病样本的重测序 – ……
目标区域测序
目标区域测序
目标区域测序
目标区域测序在医口中的应用
基因片段一端的序列信息。
互补接头 接头
基因序列
接头
Paired-End Sequencing
➢Paired-End Sequencing
(PE, 双向测序)是指检 测基因片段的两端序列 信息。
Single Read
Paired End
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➢GA 负 责 对 芯 片
内的基因片段进行 边合成边测序反应 (SBS) ， 收 集 碱 基 信息。
➢Single-Read Sequencing
单向测序
➢Paired-End Sequencing
双向测序
➢Indexed Sequencing
混合样品测序
Single-Read Sequencing
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High-seq 2000
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GTATTTTCGGCACAG
A
G
A
C
T C
T TG
Cycle 1:按顺序加入反应试剂 合成第一个碱基 清除未反应的碱基和试剂
激发碱基荧光并收集荧光信号 去除阻断基团和荧光基团
Cycle 2-n:
转录本
Fragment buffer
Superscript III RNase H
N6 primer
mRNA DNA
DNA polymerase I ds cDNA
转录本
RNA-seq在医口中的应用
– 用于癌驱动基因的筛选 – 用于融合基因的筛选 – 用于可变剪接的筛选 – 用于RNA水平的SNP分析 – ……
重复前面的步骤
Base Calling
T G C TAC GAT …
1
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3
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5
6
7
8
9
TTTTபைடு நூலகம்TTGT…
The identity of each base of a cluster is read off from sequential images
➢CS 负 责 将 待 测
样品“种植”于检测 芯片(Flow Cell)中 并进行扩增。
Small RNA 测序
Day1 Day2 Day3 Day4
Small RNA 测序
Small RNA在医口中的应用
– 两种差异样本之间的Small RNA比较 – MicroRNA和基因表达差异综合 – 生物标记 – ……
RNA-seq
– 基因表达差异（DGE） – 转录本
DGE
DGE
Indexed Sequencing
➢Indexed Sequencing是指将多种样品混合后进行
测序的技术。
➢这是为了充分利用solexa高通量的特点，有助于
降低成本。
应用
• DNA 水平 – 全基因组测序（de novo和Resequencing） – 目标区域测序 (外显子测序) – 表观（bisulfite、MeDIP、ChIP-seq）
– 单基因病外显子测序 – 复杂疾病外显子测序 – 某种疾病已知的相关基因深度测序以挖掘突变位点等 – ……
表观-Bisulfite
表观-Bisulfite
表观-MeDIP
表观-MeDIP
表观-ChIP-seq
表观-ChIP-seq
表观在医口中的应用
– 组蛋白修饰及转录因子研究 – 全基因上的DNA甲基化图谱 – 高CpG区域的甲基化图谱 – ……
RNA 水平 – 小RNA测序 – RNA-seq（DGE、转录本）
全基因组测序
全基因组测序在医口中的应用
– 单个临床细菌、真菌等微生物的基因组研究 – 多个同属菌株的基因组比较及群体进化 – 宏基因组 – 疾病样本的重测序 – ……
目标区域测序
目标区域测序
目标区域测序
目标区域测序在医口中的应用